Növények és a kórokozó
a közönséges jégnövényt (Mesembryanthemum crystallinum L.) üvegházban termesztették, a Jégnövény leírása szerint ku Enterprises et al. . A 3. levélpár megjelenése után az egyik növénykészletet 0,4 M NaCl-lal öntöztük a Crassulacean sav metabolizmusának kiváltására (CAM növények), míg egy másikat csapvízzel (C3 növények) tovább öntöztünk. 12 nap elteltével a CAM indukcióját a NaCl – lal kezelt növényekben a levélsejt-nedvben lévő napi ~ malát mérésével igazoltuk. Ezt követően a 2.levélpár C3 és CAM növények leveleit Botrytis cinerea-val oltottuk be, a Ku Xhamniak et al. .
klorofill a fluoreszcens képalkotás
a Levéltartóval felszerelt Imaging-PAM klorofill Fluorométer (Walz, Effeltrich, Németország) Mini változatát használtuk a fluoreszcens képalkotás rögzítésére (Imaging-PAM M sorozatú klorofill Fluorométer) . A fluorométer egy levélcsipesz modell terepi alkalmazásokhoz. A levéltartó biztosítja, hogy a levél vízszintesen legyen tartva a fényforráshoz, hogy elkerülje a heterogén megvilágítást a levélminta különböző területein. A mintavételi pozíciókat úgy választottuk meg, hogy egyenlő távolságra legyenek a középső szár mentén, azonban a levél mérete és morfológiája, valamint a levelek tartóba helyezésének technikája miatt kissé különböztek egymástól. Csak a biotikus stressz hatásainak azonosítása, valamint a műtárgyak klorofill fluoreszcencia mérési eljárásba történő bevezetésének elkerülése érdekében a levelekre nem alkalmaztak olyan referenciajeleket, amelyek lehetővé tennék a levélkép hivatkozását. A közönséges jégnövény leveleiből származó klorofill fluoreszcenciát az érdeklődési terület (AOI eszköz) meghatározásával nyertük a képalkotó Win 2.41 a szoftver segítségével.
az Imaging-PAM segítségével az aktuális fluoreszcencia hozamot (Ft) folyamatosan figyeltük. A növények sötét alkalmazkodott 20 min. Telítési impulzus alkalmazásával meghatároztuk a sötét szintű fluoreszcencia hozamot (Ft = F0) és a maximális fluoreszcencia hozamot (Fm). Leképeztük a psii, Y(NPQ) és Y(NO) maximális PSII kvantumhozamát, az Fv/Fm-et, valamint a szabályozott és nem szabályozott energiaeloszlás kvantumhozamát. Az Fv / Fm − t az alábbi egyenlet alapján számítottuk ki: Fv/Fm = (Fm-F0) Fm. Az Y (NPQ) kiszámítása Kramer et al. a képlet szerint: 1-Y (II) − 1/(NPQ + 1 + qL (Fm / F0-1)). Az Y (NO) értéket Kramer et al. az egyenlet szerint: Y (nem) = 1/. A képalkotás folyamata a biológiai anyag pszeudo-színes (indexelt színmódú) képeit 640 680 pixel felbontással biztosítja, amely megfelel a 32 24 mm-es fizikai méretek látómezőjének.
a C3 és a CAM növények fertőzött leveleit CHL fluoreszcencia elemzésre vettük a beoltás időpontjában és 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 72 órával az oltás után. Chl a fluoreszcenciát mértünk a 2. levélpár csatolt leveleire három C3 és CAM növényből, amelyek a növénytermesztés két független ismétléséből származnak. Minden levél vett elemzésre külön szűrjük minden időpontban (ábra. 1). Az Y (NO), Y(NPQ) és Fv/Fm(FV / Fm) kilenc képből álló reprezentatív sorozatot dolgoztunk fel a C3 és CAM jégnövények esetében, hogy mérjük ezeknek a paramétereknek a változásait az idő múlásával átvilágított levélpengék kiválasztott területén. Összehasonlításképpen, y(NO), Y (NPQ) és Fv/Fm átlagolt adatok a teljes levél régiók ábrán látható. 2 kapott. Az y(NO) képeken PÉLDÁZTUK a képbeállítás eredményeit, valamint a biotikus stressz terjedésének térbeli-időbeli mintázatának mérését a levelekben a javasolt módszerrel.
példa képek a nem szabályozott energiaeloszlás kvantumhozamáról a közös jégnövény leveleiben. A C3(a–d) és a CAM (e–h) fluoreszcencia paraméterek PSII Y (NO) értékére vonatkozik. A levélfragmens tartalmazza a kórokozó beoltásának helyét és a stressz terjedésének tüneteit
példa a C3 közös jégnövény levelére a kiválasztott érdekes régiókkal. A firmware-szerkesztőben manuálisan kiválasztott beállítások lefedik a fertőzött (1), a tünetmentes (2), valamint a középső területeket (3)
kép igazítása
a PAM-képadatok időbeli sorrendben történő gyűjtésének mechanizmusa a levélfragmentum elmozdulását eredményezi a látómezőben az egyes időpontok között (ábra. 1). A levél helyzetének megváltozása miatt az olyan jellemzők, mint a középső rész, valamint az oltási helyek mind eltérő elhelyezkedéssel, mind orientációval rendelkeznek. Ezenkívül megfigyelhető az átméretezés hatása. A stressz terjedésének megfelelő értékeléséhez a nézetmezőket kölcsönösen szinkronizálni kell, feltételezve, hogy egyikük referencia (rögzített) kép, a többi kép pedig a rögzített képhez igazodik. Ez a megközelítés az orvosi képalkotásban képregisztrációként ismert . A fluoreszcens képek alapvető regisztrációs feladata a megfelelő elforgatásból, transzlációból és méretezésből álló ‘hasonlóság’ transzformáció megtalálása. A levelek felületi hajlítása és hajtogatása a stressz miatt csak az egyes képek helyi régióiban fordul elő, és kisebb jelentőséggel bírnak a globális képbeállítás szempontjából. A regisztráció utáni feldolgozás szakaszában kompenzálhatók nemlineáris transzformációkkal, mint pl. vékonylemez, felületi spline és démon leképezések .
a fluoreszcens képeket felvételek sorozataként készítik előre meghatározott időintervallumokban, megközelítőleg azonos levélrégióban. A figyelembe vett képköteg jellegzetes elemei elsősorban levélvénákat képviselnek. A korlátozott kontraszt, valamint a Pam képalkotás színes divatja miatt azonban rosszul különböztethetők meg a képtartalomtól. A tartalmat vizuálisan uraló stressz tünetek területei egyetlen sorozatban lévő képek között változhatnak. Ilyen esetben az automatikus regisztráció sikertelen lenne.
a legnépszerűbb, automatikus korszerű módszerek a képintenzitás összehasonlításán alapulnak néhány korrelációs mutatóval (intenzitás-alapú módszerek), vagy a rögzített és mozgó képeken történő keresésre támaszkodnak a kiválasztott képfunkciók, például pontok, vonalak és kontúrok közötti megfelelésre (funkcióalapú módszerek) . Ezen megközelítések egyike sem teszi lehetővé a közönséges jégnövény Pam fluoreszcencia képeinek megfelelő regisztrálását, amit a kiegészítő anyagokban szereplő példák igazoltak és bemutattak (kiegészítő fájl 1). Az ott bemutatott eredmények megerősítik, hogy a sikertelen automatikus regisztrációk oka a megőrzött tulajdonságokkal rendelkező képrégiók erős elhomályosítása a képtartalom dinamikus változásaival, amelyeket a levélszövet fertőzése okoz. A népszerű módszerek tesztelését mind a Matlab regisztrációs Becslője, mind a Fidzsi-szigeteki környezetben elvégezték .
a PAM képregisztráció algoritmusát Matlab környezetben tervezték a szakértő által manuálisan kiválasztott vezérlőpontok halmaza alapján. A megfelelő vezérlőpontok beállításához minden képen a funkció cpselect of Control Point Selection Tool from Image Processing Toolbox került alkalmazásra. A képeket párban szerkesztették, beleértve egy rögzített képet és egy mozgó képet. A közvetlenül a kórokozó beoltása után szerzett első képet rögzített (referencia) képként feltételeztük. Az interaktív ponttérképezésen keresztül a felhasználó nemcsak az idegek látható körvonalait mutathatja meg, hanem más jellegzetes elemeket is, például az injekciós pontot, a kórokozó terjedésének helyeit, valamint a legszembetűnőbb epidermális hólyagsejteket (ábra. 3).
a szakértő által kiválasztott ellenőrzési pontok. Példa Y (nem) egy CAM közös jégnövény levélfragmensének képei: a rögzített (referencia) kép, b a rögzített képhez igazítandó mozgókép
több pár vezérlőpont-hely, amelyek a lehető legszélesebb körben oszlanak el a levélkép felületén, elegendőek ahhoz, hogy ugyanazon levél nagyjából merev testnek tekintett képeit megfelelően igazítsák. A vezérlőpontok szélesebb eloszlása javítja a képillesztés érzékenységét, de korlátozza az igazítási transzformáció után levágott képnézeti mező, valamint a kiválasztott pont pontos elhelyezkedésének lehetősége a levéllemezen. Ilyen képbeállítással az Affin transzformációt a funkció segítségével hajtottuk végre fitgeotrans szerepel a képfeldolgozó eszköztárban. Ez a transzformáció a ‘hasonlóság’ verzióra korlátozódott (amely csak fordításból, forgatásból és hasonlóságból állt), mivel a Pam fluorométer jelenete nem dőlt meg. A mozgóképeket az imwarp funkció segítségével illesztettük a rögzített képhez. A regisztrációs algoritmus grafikus ábrázolása az ábrán látható. 4.
a blokkdiagram Affin és opcionális B-spline regisztráció alkalmazott fluoreszcens PAM képek. \(\left\) – a kontrollpontok vektora a rögzített képen, \(\left^{\left (k \ right)}\) – a kontrollpontok vektora a k-edik mozgóképben, \(\left^{{\left ({k^{\prime }} \ right)}}\)-a kontrollpontok vektora a k-edik mozgóképben A B-spline regisztráció után
a fertőzés különböző szakaszaiban lévő levelek felülete lokálisan hullámos vagy ráncos lehet, mint az elemzett PAM-fluorométer képeken megjelölt régióban (ábra. 5a, b), mely forma potenciálisan befolyásolhatja a kórokozó terjedési jelenségének megfelelő elemzését. Ez azt jelenti, hogy a geometriai transzformáción alapuló Affin regisztrációs módszer nem biztos, hogy elegendő a fluoreszcencia Pam képek illesztéséhez a látszólag látható nemlineáris deformációval rendelkező levelek egyes eseteiben. Ezért a szerzők kétlépcsős regisztrációs módszert javasolnak, ahol az Affin merev regisztrációt követi B-spline regisztráció csökkenti a nemlineáris deformációkat.
példa Affin és B-spline regisztrációk C3 közös jég növény levél kép. a az Y (NO) kép a PAM megszerzése után, b a merev Affin transzformáció utáni kép a regisztráció második szakaszában használt interaktív módon beállított elmozdulási vektorokat ábrázoló nyilakkal, c végső forma a kontrollpont alapú B-spline regisztráció után
a nem merev regisztrációs típus kiválasztása kihasználja azt a tényt, hogy a közönséges jégnövény levelei kissé rugalmas anyagot képviselnek, a kis hajlítóerők pedig a levélfelület profiljának sima változásait tartják fenn. Ennek a regisztrációs módosításnak az a sajátossága, hogy a kép deformációs mezőjének vektorait interaktívan kell kivetni. Erre a célra egy dedikált vektormező-szerkesztőt csatoltak az algoritmushoz. A mozgóképben csak néhány elmozdulási vektort kell megadni a levélfelület helyi és sima deformációinak regisztrálásához, mint az ábrán. 5b.
a regisztráció második szakaszához a B-spline Rueckert algoritmust választottuk ki. Megvalósítása elérhető a Matlab központi Fájlcserében, mint Dirk-Jan Kroon Spline regisztrációs eszköztár .
A B-spline regisztrációs eljárás két alapvető lépésből áll:
-
a képfelületen egyenletesen elosztott képpontok g rácsának inicializálása, az összes deformációs mező vektor nullára állítva, majd sűrű vektormező kiszámítása t deformációk a rácsban G köbös B-spline interpolációval manuálisan beállított vezérlőpont elmozdulási Vektorok \(\left^{\left( k \right)}\). Ezután mind a rácsot, mind a hozzá tartozó t transzformációs mezőt iteratív módon finomítják 4 lépésben a rácscsomópont távolságának csökkentése érdekében. A T transzformációt a Point_registration függvény készíti el a Spline Registration Toolbox-ból.
-
a mozgó (Affin regisztrált) kép \(I_{m}\) összes pixelpozíciójának és színkomponenseinek kétköbös interpolációinak B-spline átalakítása a spline simított deformációs mezőnek megfelelően.
Képregisztrációs pontosság
a javasolt képbeállítás pontosságát az ábrán látható n = 15 kontrollpont eltérésein a gyökértér (RMS) segítségével hajtottuk végre. 3. Az egyes rögzített képvezérlési pontok \(p_{i}\) elmozdulását mozgóképben értékelték az esethez igazítással vagy anélkül. 6 mint a vektorok \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\) és \(Q_{i} P_{i} =\Delta q_{i}\) sorrendben. A két esetben az összes ellenőrzési pont RMS elmozdulási hibáit egyetlen képen Eq-ban fejezzük ki. (1) mint \(\Delta r_{\text{rms}}\) és \(\Delta q_{\text{rms}}\).
A Pam-képek Affin regisztrációjának hibaértékelésének illusztrációja. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots, N\)—vezérlőpont a rögzített képen \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—a vezérlőpont feltérképezése \(p_{i}\) a mozgó képen \(I_{M}\), \(R_{i}\)—a vezérlőpont feltérképezése \(p_{\text{i}}\) regisztráció után, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—a vezérlőpont elmozdulási hibája \(p_{\text{I}}\) regisztráció után
a maradék elmozdulás \(\delta_{rms}\) százalékos aránya az Affin típusú regisztráció után egy képenként értékelhető az Eq szerint. (2).
az értékelt Affin regisztrációs hibákat az 1. táblázat tartalmazza. Az eredeti \(\Delta q_{\text{rms}}\) elmozdulások, amelyek 3,01-7,09 mm között változnak, a ‘hasonlóság’ regisztrálást követően 0,45-1,71 mm-es \(\Delta r_{\text{rms}}\) tartományra csökkennek a vizsgált C3 üzemben. A CAM plant paraméterei a következők: \(1.90 \div 5.69\;{\text{mm}}\) a \(\Delta q_{\text{rms}}\) és \(0.41 \div 1.53\;{\text{mm}}\) a \(\Delta r_{\text{rms}}\) esetében. Ha a \(\delta_{rms}\) átlagot mind a C3, mind a CAM képsorozatok esetében, akkor ez körülbelül 21%, illetve 23%. Az y(NO), Fv/Fm és NPQ fluoreszcencia paraméterek regisztrálás nélküli jégnövény levélképekből nyert értékei a levél inkompatibilis részeiből származnak, és nem vehetők figyelembe (lásd a 2.Kiegészítő fájlt).
további B-spline regisztrációs leképezés esetén a transzformációs hibát két komponens határozza meg. Ezek közül az első a bejegyzés utáni elmozdulás \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\) ábrán látható. 7a, \(R_{i}\) értékkel EQ-ban értékelve. (3) mint a régió centroidja \(\bar{p}\) \(A_{i}\).
ahol \(I_{R} \ left (p \right) \in\ left\) a regisztrált vezérlőpont képének intenzitását jelöli a P pixelben, \(\left| {a_{I}}\right|\)—az elmosódó régió területe. A hiba második komponensét az intenzitás szórási sugara határozza meg \(\rho_{i}\) az egyes vezérlőpontok körül elosztva \(R_{i}\) az Eq-ban leírtak szerint. (4).
ahol \(\left \ / \ cdot \ right\|\) a képsík P és \(\bar{p}\) pontjai közötti Vektor euklideszi normáját jelöli. Az igazított kontrollpont elmosódása \(R_{i}\) annak a ténynek köszönhető, hogy a nemlineáris regisztráció bicubic interpolációt használ a véges felbontású rácsban G. ezt a hatást kísérletileg mértük egy adott B-spline transzformáció végrehajtásával a fekete háttér fehér vezérlőpontjaiból épített képen. Táblázat 2 tartalmazza a magnitúdók \(\Delta q_{i}\) N = 9 példa elmozdulás mező Vektorok ábrán látható. 5b. A spline regisztrációt követő vektorleképezési hibák \(\Delta R_{i}\) nagyságát a kívánt rögzített kontrollpontok \(P_{i}\) és a regisztrált pontok \(R_{i}\) centroidjai között mérjük a \(A_{i}\) régióban. Az összes tesztelt \(\Delta r_{i}\) érték az\(50\;\upmu {\text{m}}\) képpontfelbontás alatt van, és figyelmen kívül hagyható—0-ra kerekítve. Ez a vezérlőpontok pontos pozicionálását jelenti a spline transzformációval. A 2.táblázatban látható elmosódási régió szórása a duplázás után a kontrollpont elmosódásának mértéke lehet. Ezután körülbelül változik \(24\; {\text{to}}\; 63\; \ upmu {\text{m}}\), ami egyenértékű az egy pixeles elmosódással. Így ez a transzformáció lehetővé teszi a fluoreszcens kép y(NO) változásainak megfelelő alakjának helyi helyreállítását.
a hiba magyarázata A PAM képek B-spline képregisztrációjában. a A vezérlőpont helyének leképezésének eltérése a regisztráció során, b a spline regisztrált vezérlőpont képintenzitás-eloszlása, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—vezérlőpont a rögzített képen \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—a vezérlőpont megfelelője \(p_{i}\) a mozgó képen \(I_{M}\), \(R_{i}\)—a vezérlőpont feltérképezése \(p_{i}\) regisztráció után, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—elmozdulási hiba a vezérlőpont feltérképezésének mértéke \(p_{i}\), \(a_{I}\)—elmosódott régió \(R_{I}\) körül, amely megfelel a vezérlőpontnak \(p_{I}\), \(\rho_{i}\)—a \(R_{I}\) elmosódás szórási sugara
a stressz terjedésének mérése
az adatelemzés egy speciális szerkesztő eszközt alkalmaz a Pam-képek kötegének manipulálására azok regisztrálása után. A főszerkesztő funkció lehetővé teszi két azonos hosszúságú \(l_{1} \;{\text{and}}\;L_{2}\) adatgyűjtő vonal rajzolását (ábra. 8), amely a verem bármely képén megfigyelhető és elérhető. A vizsgált kísérletben a \(l_{1}\) első sor az inokuláció \(s_{1}\) helyén kezdődik, ahol a T időpontban a levélszövetre a stressztényezőt alkalmazzák, és megközelítőleg a stressz tágulásának irányába kell állítani. A második vonal \(l_{2}\) a középső rész mentén helyezkedik el, ahol a megfigyelt stresszhatás időben mindig korlátozott volt, és a fluoreszcencia paraméterek minimális változásokat mutatnak. A vonalaknak teljes mértékben illeszkedniük kell a kép kontextusába.
mérési régiók Y (NO) képek közös jég növény levelek után a számítógép igazítás. A mérési pontok a következőket jelzik: (1) mezofill az oltás helyén, (2) mezofill sérülés nélkül, (3) midrib az oltási hely közelében. A mérési vonal (L1) a mezofillon belüli feszültség terjedésének irányába van orientálva, az (L2) vonal pedig a középső rész mentén helyezkedik el. Az (S1) és (S2) pontokon kezdődő vonalak
a pontszerű mérés további lehetősége akkor lehetséges, ha a 10 pixeles sugár három kis, különböző kör alakú régióját interaktív módon helyezik el a látómezőben (ábra. 8). A levélrégiókhoz kell tartozniuk, amelyek idővel különböző fluoreszcencia paraméterekkel rendelkeznek. Az összes regisztrált pixelérték átlagolása ezeken a régiókon belül történik.