Kimérák

mit fog nyújtani I. rész

• számlaszám.
• egy mycoplasma-mentes ES sejtvonal 40 kromoszómával.

mit fogunk csinálni

• es sejtvonalonként körülbelül 50 blasztocisztát injektálunk. Ennek eredményeként 10 egér született. Az egerek közül három várhatóan erős hím kiméra lesz. Bizonyított sikerünk van.
• az egereket elválasztásig (három héttel a születés után) elhelyezzük.

mit nyújt II.rész

• az elválasztott egereket elhelyezi.

költség

• $3300 per 129 sejtvonal és a költségek donor nők; $4950 per sejtvonal és a költségek donor nők más genetikai háttérrel.
• a helyi, nem CWRU megrendelések további 200 dollárt számítanak fel az egerek csomagolásáért és szállításáért. Nem helyi megrendelések kerül felszámolásra $200 és a szállítási költségek.

szabályozási megfelelés

• a nyomozóknak iacuc protokollra van szükségük intézményüktől, hogy egereket kapjanak a magból. A CWRU IACUC protokolloknak meg kell határozniuk a Case transzgenikus mag használatát. A nyomozóknak általában nincs szükségük saját IBC protokollra: az állatokban a rekombináns DNS felülvizsgálatát a transzgenikus mag online megrendelésével benyújtott információk alapján végzik, és jóváhagyásuk esetén módosításként hozzáadják a mag IBC protokolljához. Az IBC felveheti Önnel a kapcsolatot további információkért az rDNA felülvizsgálatának részeként a megrendelés benyújtása után. Az IBC jóváhagyása szükséges az injekciók megkezdése előtt.

Köszönetnyilvánítás

• kérjük, hogy szemináriumokon és kiadványokban ismerje el az eset transzgenikus és célzott létesítményét.

idővonal

• a sejtek injekciózásának dátumától számítva legalább 6 hét lesz, mire egereket tudunk szállítani Önnek (majdnem 3 hét a terhességig, és legalább 3 hét a szülés utáni növekedés az elválasztás előtt). További 6 hétbe telik, amíg a hím kimérák elég idősek lesznek a szaporodáshoz, és legalább további 6 hét, mielőtt az utódokat elválasztják a genotípustól, hogy teszteljék a csíravonal átvitelét-összesen 4.5 hónap az injekció beadásától a csíravonal átvitelének vizsgálatáig.
• a jelenlegi (3/25/21) várható idő a megrendelés elhelyezése és az ES-sejt injekció között 8 hét. Az injekció beadását megelőző 8 hét során a chimera kérését az IBC rDNS Bizottsága felülvizsgálja, az ES sejteket felolvasztják és növesztik, és egereket rendelnek és fogadnak.

sikerességi arány Kiméra Egerek előállításában

a mag sejtvonalonként átlagosan körülbelül 5 kimérát generál.

első lépések
a célzott mutáció csíravonal-átvitelének valószínűsége növekszik a rendelkezésre álló független ES sejtvonalak számával. Átlagosan a 129 genetikai háttér ES sejtvonalainak körülbelül kétharmada-háromnegyede csíravonal lesz. A C57 háttéren lévő ES sejtvonalak esetében a vonalak átlagosan csak fele-kétharmada megy csíravonalba. Ezért, ha célzott ES cellavonalakat vásárol egy nyilvános adattárból, javasoljuk, hogy vásároljon 3 vagy több helyesen célzott sort a 129 háttéren, és 4 vagy több sort a C57 háttéren. Hasonlóképpen, rendeljen 2 vagy több injekciót 129 vonalhoz, és 3 vagy több C57 vonalhoz. Az eucomm es sejtjeiben feltételes allélokkal rendelkező szövetspecifikus kiütések generálásához lásd az alapozónkat.

Gyakran Ismételt Kérdések

mik azok a kimérák?
a kimérákat általában úgy alakítják ki, hogy egereket generáljanak gén célzott vagy gén csapdába esett ES sejtvonalakból. A gazdaembriókba injektált ES-sejtek kimérák néven ismert mozaikos egereket eredményeznek.
a hím ES sejteket nem szexuális blasztocisztákba injektálják. Ha a gazdaembrió nőstény, és a hím ES sejtek csírasejteket hoznak létre, a kiméra gyakran termékeny hím lesz. Olyan törzsből származó gazdaembriókat használnak, amelyek nem versenyeznek túl erősen az ES sejtekkel, és a két komponenst (ES és gazdaembrió) genetikailag jelölik a szőrzet színgénjeivel, így az ES sejtek hozzájárulása az állathoz könnyen meghatározható. Ha az ES-sejtek leszármazottainak aránya az állat szőrzetében magas, akkor az ES-sejtek ivarsejtekben való megjelenésének valószínűsége is magas, mivel az ES-sejtek az embriogenezis korai szakaszában alaposan keverednek a gazdasejtekkel. A kabátszín-jelölő rendszer lehetővé teszi annak megfelelő keresztezéssel történő meghatározását is, hogy a kimérák utódai az ES sejtkomponensből vagy a gazdaembriókomponensből származnak-e.
129 az ES sejtek barna szőrzetet eredményeznek, mert a / A (vad típusú Agouti), a C57BL/6J gazdaembriók pedig Fekete szőrzetet eredményeznek, mert a/a (recesszív nonagouti). Az ES sejtek az egerek 129 törzséből származnak; a gazdaembriók az egerek C57BL/6J törzséből származnak. Ha ezeket a kimérákat a/A nem agouti egerekben tenyésztik (például C57BL/6J, akkor minden barna utódnak (a / A) ES sejtből származó ivarsejtekből kell származnia, és a barna utódok 50%-a várhatóan hordozza a knockout allélt. Alternatív megoldásként a mutáció átvitelét közvetlenül az utódokból származó szövetek PCR vagy Southern blot vizsgálatával lehet meghatározni.

ha az ES sejtek a C57BL/6J törzsből származnak (a/a, Tyr/Tyr és black), a gazdaembrió albino C57BL/6J (a/a, Tyrc-2j/Tyrc2-J és white) lesz. Az ilyen kimérák c57bl/6J albínóvá történő tenyésztése fekete utódokat (a/a, Tyr/Tyrc-2j) hozhat létre az ES sejtkomponensből, amelynek 50%-ának hordoznia kell a mutációt, fehér utódokat (a/A, Tyrc-2j/Tyrc-2j) pedig a gazdaembrió komponenséből.
a hím kimérák, amelyek valószínűleg továbbítják a célzott mutációt, azonosíthatók kopulációs dugó genotipizálásával.

kimérák egyéb célokra
aggregációs kimérákat és diploidtetraploid kimérákat is készítünk. Két különböző egér törzsből származó két preimplantációs embriót kombinálunk, hogy aggregációs kimérát képezzünk. Ez a technológia felhasználható genetikai mozaik embriók előállítására a génműködés autonómiájának és nemautonómiájának elemzésére és más kísérleti célokra. A diploidtetraploid kimérákban a tetraploid komponens nagyrészt az embrióból származó placenta nagy részét, a diploid komponens pedig az embriót eredményezi. Ez a fajta kiméra felhasználható annak meghatározására, hogy szükség van-e génre a placentában vagy az embrióban.

miért vicces az egerem?
néhány ES sejtvonal heterozigóta a kabát színű allélok számára, amelyek csak a következő generációkban mutatkoznak meg. Az általunk használt R1 129 ES sejtek az albínó lokuszon heterozigóták, az albínó csincsilla alléljának (cch, más néven Tyrc-ch) egy példányát hordozzák, a rózsaszín szemű hígítási lokuszon (p) pedig heterozigóták. Az R1 ES sejtekből egymáshoz leszármazott utódok olyan egereket eredményezhetnek, amelyek fekete, a szürke különböző árnyalatai, a barna különböző árnyalatai vagy a sárga, a szőrzet színétől függően allélek.

mit lehet tenni a csíravonal átvitelének biztosítása érdekében?
a csíravonal transzmisszió maximalizálható olyan ES sejtekkel, amelyek minimális időt töltöttek a tenyészetben, normális kromoszómakomplementációval rendelkeznek, és élesztőtől, baktériumtól és mikoplazmától mentesek. Célozzon meg egy sejtvonalat, amelyről tudja, hogy az Ön körülményei között továbbítják az intézményben. Használjon olyan szülői cellavonalat, amely a rendelkezésre álló legalacsonyabb átjárószám (lehetőleg kevesebb, mint a 16.átjárószám). Minimalizálja a célzott vonal tenyésztésének idejét. Ellenőrizze, hogy a célzott sejtvonalak normális számú kromoszómával rendelkeznek-e. Tesztelje a sejtvonalát mycoplasma szempontjából. Egyes cellavonalak akkor sem fognak továbbítani, ha ezek a paraméterek az Ön javára vannak. Még optimális körülmények között is csak a célzott ES sejtvonalak kétharmada kerül továbbításra a csíravonalon keresztül. Ezért kezdje legalább három független célzott cellavonallal az átvitel biztosítása érdekében.

gyenge kimérák/női kimérák vannak. Át fogják adni a kiütést?
mind a gyenge kimérák, mind a női kimérák képesek mutáns allélokat továbbítani, bár ritkán. A hím kimérák, amelyek valószínűleg továbbítják a célzott mutációt, azonosíthatók kopulációs dugó genotipizálásával. A női kiméráknak csak körülbelül 10% – a továbbítja az ES sejt genomját, amikor ezt megteszik, csak az első néhány alomban, és sok hím utódjuk nemi kromoszóma aneuploidiákkal rendelkezik, amelyek terméketlenné teszik őket (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

miért haltak meg a legerősebb kimérák?
a halálozás az ES-sejtekből származó állat arányával növekedhet, még a legjobb sejtvonalak esetében is. Ez a halálozás nagyrészt a kultúrában felmerült epigenetikai rendellenességeknek köszönhető. Úgy gondolják, hogy az epigenetikai rendellenességeket a túlélő egerek későbbi tenyésztésével korrigálják, és véletlenszerűen elkülönülnek a célzott lokusztól, még akkor is, ha nem.

milyen egér törzsre tenyésztem a mutánsokat?
a genetikai variabilitás lehető leggyorsabb minimalizálása érdekében a kimérákat ugyanolyan háttérbe helyezzük, mint az ES sejteket. Ha az ES sejtek 129-esek, akkor a kimérákat 129 egerré tenyésztjük, és a mutáció egy lépésben teljesen a 129 beltenyésztett háttéren lesz. A genetikai vizsgálatok leggyakoribb beltenyésztett háttere a C57BL/6 törzs. Ha az ES sejtjei C57BL / 6, keresztezze a kimérákat C57BL/6J egerekre. Ha meg akarja változtatni a hátteret, akkor a szabvány 9 soros keresztezést tesz a választott beltenyésztett törzsre (körülbelül 2,5 év). A 9 generáció indoklását itt magyarázza Lee Silver. Alternatív megoldásként a generációk számának körülbelül felére van szükség a marker által támogatott backcross vagy a speed congenics számára.A maximális szaporodás érdekében keresztezze az egereket egy olyan tenyésztett törzsre, mint a CD1. A CD1 egerek Svájci egerekből származnak, nagyfokú genetikai variációval rendelkeznek, és robusztus reprodukcióra lettek kiválasztva.

es cellák feltételes allélokkal az EUCOMM-től
az Eucomm minden egyes cellavonalához anyagátadási megállapodást kell kötnie. Indítsa el ezt a folyamatot a lehető leghamarabb.
az egerek generációs ideje és a kísérleti egerek előállításához szükséges keresztezések száma olyan hosszú ideig egyesül, ami meglepő azok számára, akik nem szoktak az egér genetikájához, ezért tervezzen előre. Az egerek generációs ideje (a szexuálisan érett felnőttektől a szexuálisan érett utódokig tartó idő) körülbelül 3 hónap.
az EUCOMM feltételes allélok jellemzően Frt-oldalú kazettával rendelkeznek (“Frt-ed” kazetta). A kazettának van egy splice akceptora, amely gyakorlatilag az összes illesztést átirányítja a kazettába, így az allél funkcióvesztés-mutációvá válik ebben a konfigurációban. A feltételes allél létrehozásához az Frt-vel szegélyezett kazettát el kell távolítani az Flpe-expresszáló egerekre való keresztezéssel. Az Flpe / Frt rendszer összehasonlítható, de különbözik a Cre/LoxP rendszertől.
az ES sejteket a gazdaszervezet embrióiba injektáljuk, hogy kiméra egereket készítsünk. Innen tenyészteni fogja az egereket, hogy mutációt hordozó egereket generáljon (csíravonal átvitel). Az egerek ezen alapító generációja keresztezhető olyan egerekkel, amelyek kifejezik az Flpe-t az Frt-ed kazetta eltávolítására, létrehozva a feltételes allélt. Ezután még több keresztet kell tennie a kísérleti egerek előállításához.

1. az ES sejtinjekciótól a felnőtt ivarérett kimérákig az egerek generációs ideje (3 hónap).
2. a kimérákat vad típusú egereknek tenyésztik, hogy létrehozzák a mutánst a csíravonalban (3 hónap).
3. a heterozigóta frtd feltételes egereket homozigótákat expresszáló Flpe-re keresztezzük. Ez Flpe / o, frtd feltételes / + utódokat generál. (3 hónap)
4. az Flpe/o, frtd feltételes/+ egereket vad típusúra keresztezik, hogy megállapítsák a kivágott allélt a csíravonalban, és elszaporítsák az Flpe-t, és a kivágást molekulárisan igazolják ezekben a feltételes/+ egerekben (3 hónap).
5. a feltételes/+ egereket ezután tenyésztették egymással, hogy homozigóta feltételes allél egereket készítsenek (3 hónap).
6. a feltételes / feltételes egereket szövetspecifikus-CRE/szövetspecifikus-CRE, null/+ egerekké tenyésztjük, hogy a kísérleti szövetspecifikus-CRE/o, feltételes/null egereket és a kontroll szövetspecifikus-CRE/o, feltételes/+ egereket hozzuk létre.

ezenkívül meg kell szerezni a fple, null, Cre egereket, tenyészteni kell a szövetspecifikus-Cre/szövetspecifikus-Cre, null/+ egereket.
a feltételes allélt is elemezni kell annak megállapításához, hogy a CRE-vel történő kivágás előtt vad típusú függvény, a CRE-vel történő kivágás után pedig null. Annak megállapításához, hogy a feltételes allél vad típusú-e a kivágás előtt, a feltételes/feltételes és a feltételes/null mutánsokat meg kell vizsgálni annak meghatározására, hogy fenotípusuk megegyezik-e a +/+ és a null/+ egerekkel. Annak megállapításához, hogy a Cre-kimetszett feltételes egy null allél a feltételes keresztezzük egy csíravonal Cre egér és a kimetszett feltételes keresztezzük annak vizsgálatára, hogy a fenotípus a kimetszett feltételes/kimetszett feltételes ugyanaz, mint a null/null és/vagy, hogy nem fehérje készül a kimetszett feltételes allél.
a CRE aktivitás riportere, mint például a RosaReporter, vagy ideálisabb esetben, amely közvetlenül megmutatja, hogy az érdekes fehérje hiányzik a célsejtekből immunfluoreszcencia fontos kontroll. A RosaReporter állandó béta-galaktozidáz expressziót generál minden CRE-nek kitett sejtben.
a túlzott Cre expresszió kromoszóma-töréshez vezethet, amely a feltételes allél funkciójától független fenotípusokat okozhat. Ezért a testvér egerek, amelyek expresszálják a Cre-t, de megtartanak bizonyos génfunkciókat (például feltételes/+), fontos kontroll.