Keringő tumor DNS

preanalitikai megfontolásokszerkesztés

amikor a vért EDTA csövekben gyűjtik és tárolják, a fehérvérsejtek elkezdenek lizálni, és genomikus vad típusú DNS-t bocsátanak ki a mintába, jellemzően sokszorosan nagyobb mennyiségben, mint a ctdns. Ez megnehezíti a mutációk vagy más ctdns biomarkerek kimutatását. A kereskedelemben kapható sejtstabilizáló csövek használata megakadályozhatja vagy késleltetheti a fehérvérsejtek lízisét, ezáltal csökkentve a ctdns hígító hatását. Sherwood et al a KRAS mutációk kiváló kimutatását mutatta be mind az EDTA K3, mind a Streck BCT csövekben gyűjtött egyező mintákban. A sejtstabilizáló csövek előnyei olyan helyzetekben valósíthatók meg, amikor a vért nem lehet azonnal plazmává feldolgozni.

más eljárások is csökkenthetik a” szennyező ” vad típusú DNS mennyiségét, és megvalósíthatóbbá tehetik a ctdns kimutatását:

• soha ne fagyassza le a vérmintát a plazma kivonása előtt ctdns analízis céljából
• a mintát 2-4 órán belül dolgozza fel plazmává (ha EDTA-csőben gyűjtik)
• soha ne használjon heparinizált csöveket, a heparin gátolja a PCR-t a DNS spirális szerkezetének utánzásával
• végezzen kettős Centrifugálási lépést (centrifugálja a vért a plazma eltávolításához, majd ismételje meg a plazmán, hogy távolítsa el a cső alján lévő törmelékből), hogy több sejttörmeléket távolítson el a DNS-extrakció előtt.
• a plazma jobb, mint a szérum a ctdns helyreállításához

a ctDNAEdit kivonása

a ctdns-elemzés fő vonzereje, hogy nem invazív módon, vérvétel útján extrahálják. A cfdns vagy a ctdns megszerzése általában körülbelül 3 ml vért igényel EDTA-bevonatú csövekbe. Az EDTA alkalmazása fontos a vér koagulációjának csökkentése érdekében. A vér plazma-és szérumfrakcióit centrifugálással lehet elválasztani. a ctdns vagy cfdns később kivonható ezekből a frakciókból. Bár a szérumban általában nagyobb a cfdns szintje, ez elsősorban a limfocitákból származó DNS-nek tulajdonítható. A szennyező cfdns magas szintje nem optimális, mert ez csökkentheti a ctdns észlelésének érzékenységét. Ezért a vizsgálatok többsége plazmát használ a ctdns izolálásához. A plazmát ezután centrifugálással újra feldolgozzuk, hogy eltávolítsuk a maradék ép vérsejteket. A felülúszót DNS-extrakcióra használják, amelyet kereskedelemben kapható készletek felhasználásával lehet végrehajtani.

Ctdnaedit elemzése

a ctdns extrakció utáni elemzése különféle amplifikációs és szekvenálási módszereket igényel. Ezek a módszerek két fő csoportra oszthatók az alapján, hogy a cél az összes gén lekérdezése egy nem célzott megközelítésben, vagy ha a cél a specifikus gének és mutációk megfigyelése célzott megközelítésben.

nem célzott megközelítések

teljes genom vagy teljes eXom szekvenálási megközelítésekre lehet szükség a tumor DNS új mutációinak felfedezéséhez, miközben figyelemmel kísérik a betegség terhelését vagy nyomon követik a gyógyszerrezisztenciát. A nem célzott megközelítések a tumor heterogenitásának megfigyelésére vagy új gyógyszercélok felfedezésére irányuló kutatásokban is hasznosak. Bár bizonyos alkalmazásokban szükség lehet célzott módszerekre, drágább és alacsonyabb felbontású. Ez megnehezíti a ritka mutációk kimutatását, vagy olyan helyzetekben, ahol alacsony ctdns-szint van jelen (például minimális maradék betegség). Ezenkívül problémák merülhetnek fel a tumorsejtekből származó DNS és a normál sejtekből származó DNS megkülönböztetésével egy teljes genom megközelítés alkalmazásával.

a teljes genom vagy eXom szekvenálás általában nagy áteresztőképességű DNS-szekvenálási technológiákat alkalmaz. A szekvenálás korlátozása csak az egész exomra csökkentheti a költségeket és növelheti a sebességet, de a DNS nem kódoló szabályozó régióinak mutációival kapcsolatos információk elvesztésének árán. Míg a DNS polimorfizmusainak szekvenálással történő egyszerű vizsgálata nem különbözteti meg a DNS-t a tumortól vagy a normál sejtektől, ez a probléma megoldható a normál DNS kontrollmintájával (például bukkális tamponnal nyert DNS-sel) összehasonlítva.) Fontos, hogy a teljes genom és a teljes eXom szekvenálás hasznos a kezdeti mutáció felfedezéséhez. Ez információt nyújt az érzékenyebb célzott technikák alkalmazásához, amelyeket aztán betegségmegfigyelési célokra lehet felhasználni.

a teljes genomszekvenálás lehetővé teszi a cfdns szerkezeti tulajdonságainak, a fragmentumok méretének és fragmentációs mintáinak helyreállítását. Ezek az egyedi minták fontos információforrást jelenthetnek a ctdns kimutatásának javítása vagy ezen fragmensek származási szövetének lokalizálása érdekében. A rövid fragmensek (<150bp) méretválasztása in vitro vagy in silico módszerekkel javíthatja a mutációk és a kópiaszám-rendellenességek helyreállítását.

digitális kariotipizálás

ezt a módszert eredetileg Bert Vogelstein, Luis Diaz és Victor Velculescu laboratóriuma fejlesztette ki a Johns Hopkins Egyetemen. A normál kariotipizálással ellentétben, ahol festéket használnak a kromoszóma sávok festésére a kromoszómák vizualizálása érdekében, a digitális kariotipizálás a lókuszok DNS-szekvenciáit használja a genomban a másolatszám-variáció kiszámításához. A kópiaszám-eltérések gyakoriak a rákokban, és olyan helyzeteket írnak le, amikor a gén heterozigozitásának elvesztése csökkent funkcióhoz vezethet az alacsonyabb expresszió vagy a gén duplikációja miatt, ami túlzott expresszióhoz vezet.

az átrendezett végek személyre szabott elemzése (PARE)

miután a teljes genomot szekvenálták egy nagy áteresztőképességű szekvenálási módszerrel, mint például az Illumina HiSeq, a Pare-t alkalmazzák az adatokra a kromoszómális átrendeződések és transzlokációk elemzésére. Ezt a technikát eredetileg a szilárd tumor DNS elemzésére tervezték, de ctdns alkalmazásokhoz módosították.

DNS-metiláció és Hidroximetilezés

a megfelelő epigenetikai jelölés elengedhetetlen a normális génexpresszióhoz és a sejtfunkcióhoz, és az epigenetikai minták rendellenes változásai a rák egyik jellemzője. A normál epigenetikus státuszt a sejtben legalább részben fenntartják DNS-metilezés. Az aberráns metilezési minták mérése a ctdns-ben a DNS “CpG-szigeteknek”nevezett régióinak stabil metilezése miatt lehetséges. A ctdns metilezése biszulfit kezeléssel detektálható. A biszulfitkezelés kémiailag átalakítja a nem metilezett citozinokat uracillá, miközben a metilezett citozinokat módosítatlanul hagyja. A DNS-t ezután szekvenálják, és a DNS metilációs mintázatának bármilyen változása azonosítható. A DNS-hidroximetilezés hasonlóan társult jel, amelyről kimutatták, hogy prediktív markere az egészséges kontra beteg állapotoknak a cfdns-ben, beleértve a rákot is. Az aberráns hidroximetilezési minták ctdns-ben történő mérését a Chicagói Egyetem (Chuan He lab,) Stanford Egyetem (Quake lab,) és a Cambridge Epigenetix cég kutatói bizonyították.

célzott megközelítések

célzott megközelítésben a ctdns szekvenálása egy genetikai panel felé irányítható, amely az érdekes rák mutációs hotspotjai alapján épül fel. Ez különösen fontos a kezelés tájékoztatásához olyan helyzetekben, amikor a mutációkat gyógyszerezhető célpontokban azonosítják. A ctdns célzott elemzésének személyre szabása minden beteg számára a folyékony biopsziák standard primer szövetbiopsziákkal történő kombinálásával is lehetséges. Az elsődleges tumor biopszia teljes genomja vagy teljes exome szekvenálása lehetővé teszi a beteg tumorára jellemző genetikai mutációk felfedezését, és felhasználható a beteg ctdns-ének későbbi célzott szekvenálására. A ctdns kimutatásának legnagyobb érzékenységét specifikus célzott szekvenálással érik el egyetlen nukleotid polimorfizmusok (SNP). Az általánosan mutált gének, például az onkogének, amelyek jellemzően hotspot mutációkkal rendelkeznek, jó jelöltek a célzott szekvenálási megközelítésekhez. Ezzel szemben a legtöbb tumorszuppresszor gén a funkciómutációk lehetséges elvesztésének széles skálájával rendelkezik az egész génben, és mint ilyenek, nem alkalmasak célzott szekvenálásra.

a célzott megközelítések előnye, hogy a ctdns polimeráz láncreakciókkal (PCR) vagy digitális PCR-rel amplifikálódik. Ez különösen fontos a ctdns elemzésekor, nem csak azért, mert a véráramban viszonylag alacsony a DNS-szint, hanem azért is, mert a ctdns a kivont teljes sejtmentes DNS kis részét teszi ki. Ezért az érdekes régiók erősítése drasztikusan javíthatja a ctdns érzékelésének érzékenységét. A PCR-rel történő amplifikáció azonban hibákat vezethet be, tekintettel a DNS-polimerázok eredendő hibaarányára. A szekvenálás során bevezetett hibák csökkenthetik a ctdns mutációk kimutatásának érzékenységét is.

Droplet Digital PCR (Ddpcr)Szerkesztés

ez a módszer a digitális PCR-ből származik, amelyet eredetileg Bert Vogelstein csoportja nevezett el a Johns Hopkins Egyetemen. A Droplet Digital PCR egy cseppgenerátort használ, hogy az egyes DNS-darabokat olaj/víz emulzió segítségével cseppekre ossza fel. Ezután az egyes cseppekben egyedi polimeráz láncreakciók lépnek fel kiválasztott primerek alkalmazásával a ctdns régióival szemben, majd a végpontig haladnak. Az érdekes szekvenciák jelenlétét fluoreszcens próbákkal mérjük, amelyek az amplifikált régióhoz kötődnek. a ddPCR lehetővé teszi az allél és a mutáns frekvenciák magas kvantitatív értékelését a ctdns-ben, de ezt korlátozza az egy vizsgálatban használható fluoreszcens próbák száma (legfeljebb 5). A vizsgálat érzékenysége az elemzett DNS mennyiségétől függően változhat, körülbelül 1: 10 000.

gyöngyök, emulgeálás, amplifikáció és mágnesesség (sugárzás)Szerkesztés

ez a technika csepp digitális PCR-re épül annak érdekében, hogy áramlási citometriával azonosítsa a ctdns mutációit. Miután a ctdns-t kivonták a vérből, a PCR-t olyan primerekkel hajtják végre, amelyek célja az érdekes régiók megcélzása. Ezek a primerek specifikus DNS-szekvenciákat vagy címkéket is tartalmaznak. Az amplifikált DNS-t streptavidinnel bevont mágneses gyöngyökkel keverik és cseppekké emulgeálják. A DNS amplifikálására biotinilezett primereket használnak, amelyek a címkékhez kötődnek. A biotinilezés lehetővé teszi az amplifikált DNS kötődését a sztreptavidinnel bevont mágneses gyöngyökhöz. A PCR befejezése után a DNS-hez kötött gyöngyöket mágnes segítségével elválasztjuk. A gyöngyökön lévő DNS-t ezután denaturálják, és hagyják, hogy hibridizálódjon az egyes DNS-sablonokra jellemző fluoreszcens oligonukleotidokkal. A kapott gyöngy-DNS komplexeket ezután áramlási citometriával elemezzük. Ez a technika képes megragadni az allél és a mutációs frekvenciákat a ddpcr-hez való kapcsolódás miatt. A ddpcr-rel ellentétben azonban a fluoreszcensen kötött próbák rugalmassága miatt nagyobb számú DNS-szekvencia kérdezhető ki. Ennek a rendszernek egy másik előnye, hogy az izolált DNS felhasználható downstream szekvenálásra is. Az érzékenység 1,6 a 104-ben 4,3 a 105-ben.

rák személyre szabott profilozás mély szekvenálással (CAPP-Seq)Szerkesztés

ezt a módszert eredetileg Ash Alizadeh és Maximilian Diehn csoportjai írták le a Stanford Egyetemen. Ez a technika biotinilezett oligonukleotidszelektor próbákat használ a CTDNS kimutatása szempontjából releváns DNS-szekvenciák megcélzására. A nyilvánosan elérhető rákadatbázisokat a rák visszatérő mutációi elleni próbák könyvtárának felépítésére használták ki azok kiújulási indexének kiszámításával. A protokollt a ctdns-gyűjteményben megfigyelt alacsony DNS-szintekre optimalizálták. Ezután az izolált DNS mély szekvenáláson megy keresztül a fokozott érzékenység érdekében. Ez a technika lehetővé teszi több száz DNS-régió kihallgatását. A CAPP-Seq ctdns detektálási érzékenysége 2,5 molekula 1 000 000-ből.

Tagged AMplicon deep Sequencing (tam-Seq)Szerkesztés

a TAM-Seq lehetővé teszi a teljes gének célzott szekvenálását a ctdns mutációinak kimutatására. Először egy általános amplifikációs lépést hajtunk végre olyan primerek alkalmazásával, amelyek a teljes érdekes gént 150-200bp szakaszokban átfogják. Ezután egy mikrofluidikai rendszert használnak az egyes amplikonokhoz egyedi azonosítóval rendelkező adapterek csatlakoztatására, hogy tovább erősítsék a DNS-t párhuzamos singleplex reakciókban. Kimutatták, hogy ez a technika sikeresen azonosítja a TP53 tumor szuppresszor génben szétszórt mutációkat előrehaladott petefészekrákos betegeknél. Ennek a technikának az érzékenysége 1: 50.

Safe-Seq (Safe-Seq)Szerkesztés

ezt a módszert eredetileg Bert Vogelstein és csoportja írta le a Johns Hopkins Egyetemen. A Safe-Seq csökkenti a masszívan párhuzamos szekvenálás hibaarányát a ritka mutánsokkal szembeni érzékenység növelése érdekében. Ezt úgy éri el, hogy minden DNS-sablonhoz egyedi azonosító (UID) szekvenciát ad hozzá. A DNS-t ezután a hozzáadott UID-k segítségével amplifikálják, majd szekvenálják. Minden azonos UID-vel (UID-család) rendelkező DNS-molekulának ugyanazzal a bejelentett DNS-szekvenciával kell rendelkeznie, mivel egy molekulából amplifikálták őket. A mutációk azonban amplifikációval vezethetők be, vagy helytelen bázis hozzárendelések hívhatók meg a szekvenálás és az elemzés lépéseiben. Az UID jelenléte lehetővé teszi ezen módszertani hibák elválasztását a ctdns valódi mutációitól. A mutáció akkor tekinthető szupermutánsnak, ha a szekvenált olvasás 95% – A egyetért. Ennek a megközelítésnek az érzékenysége 9 az 1 millióhoz.

Duplex sequencingEdit

ez a módszer a Safe-Seq technikában hozzáadott egyedi UID-k továbbfejlesztése. A duplex szekvenálás során a randomizált kettős szálú DNS egyedi címkékként működik, és egy invariáns távtartóhoz kapcsolódik. Kategória csatolták mindkét végét egy DNS-fragmentum (α, illetve β kategória), amelynek eredményeként a két egyedi sablonok PCR – egy szál, egy α tag az 5′ végén β tag a 3′ végén, a másik szál a β tag az 5′ végén pedig egy α tag a 3′ vég. Ezeket a DNS-fragmenseket ezután primerekkel amplifikálják a címkék invariáns szekvenciáival szemben. Az amplifikált DNS-t szekvenálják és analizálják. A DNS-t a duplex adapterekkel hasonlítják össze, és a mutációkat csak akkor fogadják el, ha konszenzus van mindkét szál között. Ez a módszer figyelembe veszi mind a szekvenálás hibáit, mind a korai stádiumú PCR amplifikáció hibáit. A mutánsok felfedezésének megközelítésének érzékenysége 1: 10^7.

Integrated Digital Error Suppression (ide)-enhanced CAPP-SeqEdit

az iDES javítja a ctdns CAPP-Seq elemzését a hiba csökkentése és ezáltal a detektálás érzékenységének növelése érdekében. 2016-ban jelentették be, hogy az iDES ötvözi a CAPP-Seq-t a duplex vonalkódos szekvenálási technológiával és egy számítási algoritmussal, amely eltávolítja a CAPP-Seq hibridizációs lépéshez kapcsolódó sztereotip hibákat. A módszer magában foglalja a duplex szekvenálást is, ahol lehetséges, és magában foglalja a hatékonyabb duplex visszanyerést a sejtmentes DNS-ből. A CAPP-Seq továbbfejlesztett változatának érzékenysége 4 100 000 példányban.