Hogyan végezzünk DNS-extrakciót szárított Vérfoltokból Chelex gyanta felhasználásával

minden biotudós, aki elemezni akarja a DNS – t, tudja, hogy a folyamat a DNS kivonásával kezdődik az érdekes sejtekből. Ezek a sejtek lehetnek vörösvértestek, paraziták vagy baktériumok, hogy csak néhányat említsünk. Ezenkívül különféle DNS-extrakciós módszerek1 közül lehet választani a minta típusától, a downstream elemzéstől stb.függően. Sok tudós szárított vérfoltokkal (DBS) kezdi, ezért különösen érdekes, hogyan lehet kivonni a DNS-t az ilyen mintákból. A DBS-t általában úgy készítik el, hogy vért gyűjtenek egy Whatman FTA kártyára2 vagy Whatman kromatográfiás 3 mm-es szűrőpapírra, és a feldolgozás előtt egy ideig (~4 órán át) szárítják. Ezt a biológiai mintavételi módszert évtizedek óta használják.

az alábbiakban ismertetünk egy hasznos módszert a DNS ilyen mintákból történő izolálására BT Chelex 100 gyanta 3 alkalmazásával.

első lépés: eritrocita lízis

• vágjon ki egy száraz vérfoltot, és helyezze egy mikrocentrifuga csőbe (1,5 ml) lyukasztó segítségével. Ne felejtse el felcímkézni a csövet, különösen, ha több mintán dolgozik. Minőség-ellenőrzési célokra tartalmazzon egy pozitív kontroll vérfoltot is.
• adjunk hozzá 1 ml 0,5% szaponint a vérfoltot tartalmazó mikrocentrifugacsőbe. Zárja be, vortex, és inkubálja 4 0C-on legalább 4 órán át, vagy még jobb, egy éjszakán át. Ebben a lépésben a szaponin komplexek koleszterinnel az eritrocita membránban, ami pórusok kialakulásához vezet a membránban, ezért hemolízis.4 a szaponin egy általánosan használt Lízis Reagens paraziták (például malária paraziták) vörösvérsejtekből történő felszabadítására.
• forgassa néhány másodpercig 4000 fordulat / perc sebességgel, hogy eltávolítsa a cseppeket a belső fedélről, majd szívja le a szaponint a csőből egy vákuumszerelő gépen lévő pasteur pipettához rögzített, nem akadályozó pipetta hegyével. Műanyag pasteur Pipetta is használható. Hagyja a helyet a mikrocentrifuga csőben.

második lépés: mosás

• adjunk hozzá 1 ml foszfátpufferelt sóoldatot a mikrocentrifugába, zárjuk le, örvényeljük, és inkubáljuk 4 0C-on 20-30 percig. Az éjszakai inkubálás nem okoz kárt. Ez a lépés biztosítja a szaponin eltávolítását a csőből.
• centrifugáljon néhány másodpercig 4000 fordulat / perc sebességgel, majd távolítsa el a PBS-t, ugyanúgy, ahogy eltávolította a szaponint. Hagyja a helyet a mikrocentrifuga csőben.

harmadik lépés: DNS-extrakció Chelex gyantával

elv: a Chelex gyanta úgy működik, hogy megakadályozza a DNS lebomlását a lebontó enzimekből (DNS-ekből) és a potenciális szennyeződésekből, amelyek gátolhatják a downstream elemzéseket. Általában a Chelex gyanta csapdába ejti az ilyen szennyeződéseket, így a DNS oldatban marad. A Chelex gyanta olyan kationokat állít le, mint az Mg2+, amely a DNáz hatásának fontos társfaktora, ezáltal védi a DNS-t a lebomlástól.5,6

• pipettázzunk, és adjunk hozzá 150 db 6,7% – os Chelex gyantaoldatot a foltot tartalmazó mikrocentrifugacsőbe. Csukja be a csövet. Fontos figyelmeztetés: a 6,7% – os Chelex oldat elkészítésekor használjon olyan vizet, amely mentes a DNS-ektől, nukleázoktól (vagy bármi mástól, amely károsíthatja és lebonthatja a DNS-t).
• inkubáljuk 95 0C hőmérsékleten 10 percig hőblokk/ rázógép segítségével. Fontos, hogy a csövet kétszer, 2 percenként nyissa ki a nyomás felszabadítása érdekében, majd ezt követően néhány másodpercig rázza. Ez felszabadítja a DNS-t az oldatba.

negyedik lépés: kerülje a Chelex gyanta gyöngyöket a végső kivonatban

• Spin 5 percig 4000 fordulat / perc sebességgel
• pipettázzon a lehető legtöbb kivonatot egy kisebb mikrocentrifuga csőbe (0,6 ml) aeroszolzáró hegy segítségével, miközben elkerüli a Chelex gyöngyök átadását.
• centrifugálja a 0,6 ml-es mikrocentrifugát 4000 fordulat / perc sebességgel 10 percig. Az ötlet a második centrifugálás, hogy távolítsa el a maradék Chelex gyöngyök, amelyek átvihetik a végső kivonat. Miért fontos ez? Két fő oka van: 1) A Chelex kötődik a magnéziumionokhoz (a PCR-ben használt Taq polimeráz nélkülözhetetlen kofaktora) és 2) A Chelex fluoreszkál. Ha a fluoreszcencia az eredmény megjelenítésének módja, ez hamis pozitív eredményt hozhat létre.
• pipettázzunk kb. 100 ml-t, és a végső kivonatot helyezzük át egy új mikrocentrifugába. Címke és hűtőszekrényben tárolandó.

néhány tipp a DNS-kivonás közben

• tiszta környezetben dolgozzon szennyező anyagoktól
• használjon nukleázoktól mentes pipettahegyeket
• kezelje az összes mintát kesztyűvel
• ismét kerülje a Chelex gyöngyöket a végső kivonatban

következtetés

A Chelex Resin7 egyszerű és gyors DNS-extrakciós módszert biztosít a DBS-ből, különféle molekuláris analitikai alkalmazásokhoz. Ez a módszer nem igényel drága berendezéseket, és megbízható, ha más módszerekkel tesztelik.

1. GE Healthcare (2010). A Whatman FTA kártyákból származó DNS megbízható kinyerése. Alkalmazási Megjegyzés 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, Egyesült Királyság: GE Healthcare.
2. Whatman (n.n.). Szabadkereskedelmi lemez előkészítése DNS-elemzéshez. Whatman szabadkereskedelmi jegyzőkönyv BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) chelex 600 és Chelex 20 kelátképző ioncserélő gyanta használati utasítás. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio-Rad laboratóriumok.
4. Baumann, E., Stoya, G., V. A., Richter, W., Lemke, C. és Linss, W. (2000). Az emberi eritrociták szaponinnal történő hemolízise befolyásolja a membrán szerkezetét. Acta Histochemica, 102(1), 21-35.
5. IBRC (2016). Kivonási Protokoll: Chelex. Az IBRC honlapja. A lap eredeti címe:http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C. S., Boissaye, R., Stewart, J. és Staton, P. (n.d.). Chelex DNS extrakciós protokoll kidolgozása és belső validálása referencia orális tamponokhoz.
7. Walsh, P. S., Metzger, D. A. és Higuchi, R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 mint közeg a DNS egyszerű kivonásához PCR-alapú tipizáláshoz törvényszéki anyagból. Biotechnológiák, 54(3), 134-139.