határok a genetikában

jelentőség

egyre nagyobb az érdeklődés a circrns-ek iránt, mivel biomarker-potenciáljuk mellett számos biológiai folyamatban és betegségben is szerepet játszanak. Elsősorban a hátlapi csomópontot feltérképező olvasások jelenlétével detektálják őket. Ennek ellenére a circrns-ek már nem az egyetlen átiratok, amelyek ilyen csomópontot tartalmaznak, mivel a legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a kör alakú DNS-ek gyakoriak és átírhatók, ami olyan átiratokat eredményez, amelyek utánozzák a circrns jelet. Ezért ez az új típusú kiméra átirat megváltoztathatja a circrns elemzés módját, és befolyásolhatja a már bejelentett eredmények egy részét.

a kör alakú RNS-ek Az egyetlen Kiméra átiratok?

a kör alakú RNS-eket (circrns-eket) néhány évvel ezelőtt fedezték fel újra, mivel nem kanonikusan összekapcsolt RNS-formák vannak jelen különböző organizmusokban, beleértve az embereket is (Salzman et al., 2012; Jeck et al., 2013). Ezek kovalensen zárt transzkripciók, amelyek egy RNS visszaillesztési esemény révén képződnek, ahol egy downstream exon splice donora csatlakozik egy upstream splice akceptorhoz, ami kovalensen zárt transzkriptumokhoz vezet, amelyeket egy olyan visszaillesztési csomópont jelenléte jellemez, amely megkülönböztethetővé teszi a circrns-eket lineáris társaiktól (1a.ábra) (Zhang et al., 2016; Wilusz, 2018).

újrafelfedezésük óta a tudományos közösség felhívta a figyelmét a circrns-ekre, és megvizsgálta részvételüket az egészség és a betegség számos sejtfolyamatában (Haque and Harries, 2017), potenciális biomarkerként betöltött szerepüket (Abu and Jamal, 2016), valamint szabályozási funkcióikat (Floris et al., 2016). A circrns-ekről ma már ismert, hogy bőségesek és stabilak a citoszolban és a magban (Salzman et al., 2012; Jeck et al., 2013; Li et al., 2015), és a biofluidokban is szabadnak találták (Bahn et al., 2015; Memczak et al., 2015; Chen et al., 2018) és az extracelluláris vezikulákban (Kyoung Mi et al., 2017). A circrns biomarker potenciálját intenzíven tanulmányozták, valójában számos esettanulmány-tanulmányt tettek közzé, amelyek differenciáltan expresszált circrns-eket keresnek, amelyek különböző betegségek biomarkerei lehetnek. A mai napig a circrns-ek számos betegségben érintettek, beleértve a rákot is (Kristensen et al., 2017; Arnaiz et al., 2018), neurológiai rendellenességek (Akhter, 2018), kardiovaszkuláris betegségek (Aufiero et al., 2019) és immunrendszeri betegségek (Iparraguirre et al., 2017; Liu et al., 2019). Ugyanakkor a biogenezisük, jellemzőik, funkcióik és következményeik teljes megértése az emberi biológiában továbbra is nyitott kérdés a terület kutatói számára.

bár a legtöbb circrns funkciója ismeretlen, kimutatták, hogy egyes circrns-ek mikroRNS-szivacsként működhetnek, szabályozva a mikroRNS-szinteket és azok aktivitását (Hansen et al., 2013; Memczak et al., 2013; Zheng et al., 2016). Részt vesznek a génexpresszió szabályozásában azáltal, hogy szabályozzák szülői génjeik transzkripcióját, versenyeznek a lineáris splicing vagy szivacsos fehérjékkel (Ashwal-Fluss et al., 2014; Li et al., 2018). Érdekes módon a riboszóma profilozási vizsgálatok nemrégiben kimutatták, hogy a circrns-ek mind in vitro, mind in vivo lefordíthatók (Legnini et al., 2017; Yang et al., 2017).

a circrns-ek fő jellemzője, amely a legtöbb különleges tulajdonságukért felelős, a körkörösség. Ezért a jellegzetes visszaillesztett csomópont kimutatása mellett ezen molekulák körkörösségének tesztelése minden circrns-vizsgálat egyik kulcsfontosságú pontja. Mindazonáltal számos tanulmány a circrns-ek felfedezését a teljes RNS-re alapozta, és ezáltal néhány lineáris kiméra transzkriptumot circrns-ként értelmezett, ami hamis pozitív circrns-detektálást eredményezett. Ennek a problémának a megkerülése érdekében a legtöbb tanulmány megerősítette a teljes RNS-seq által RNase R, Northern blot vagy elektroforetikus módszerekkel talált átiratok körkörösségét (Jeck and Sharpless, 2014). Ezek a körkörösségi validációk azonban néha olyan átiratokat is felfedtek, amelyek lineárisnak tűnnek, nem pedig kör alakúak, megerősítve, hogy a circrns-ek kimutatása a teljes RNS-ből kiindulva hamis pozitív eredményekhez vezethet. Ezeket a hamis pozitív eredményeket olyan technikai leleteknek vagy átiratoknak tulajdonították, amelyek nem gyakori eseményekből származnak, mint például exon duplikációk vagy transzplantációs események (Jeck and Sharpless, 2014; Szabo and Salzman, 2016). Ennek ellenére az a lehetőség, hogy valódi, biológiailag aktív és funkcionális lineáris transzkriptumokat találjunk, amelyek egy backsplicing csomópontnak megfelelő szekvenciát tartalmaznak (mostantól kiméra lineáris transzkriptumoknak hívják), kissé figyelmen kívül hagyták, mert az ilyen lineáris RNS forrása nem ismert az egészséges sejteknél.

körkörös DNS mint Kiméra lineáris átiratok forrása

az emberi genom nagy része lineáris kromoszómákba szerveződik, azonban néhány kivételt már régóta elfogadtak, például a mitokondriális DNS-t és a kromoszóma-rendellenességeket, például az onkogéneket hordozó DNS-köröket (például kettős perceket) (Benner et al., 1991; Nathanson et al., 2014; Turner et al., 2017) és a gyűrűs kromoszómák (T., 2004). Nem volt egészen a közelmúltig, hogy a különböző kör alakú DNS-ek, mint a microdns (Shibata et al., 2012) vagy extrakromoszomális kör alakú DNS-ekről (eccdns-ek) azt találták, hogy a különböző eukarióta genomok nagy részeiből is származnak, beleértve az embert és az élesztőt (M)., 2015; Kumar et al., 2017; m hosszú távú és mtsai., 2018).

kör alakú DNS-ek akkor képződnek, amikor egy lineáris DNS két vége össze van kötve, ami hasonló csomópontot eredményez, mint a circrns-ek backspliced csomópontja, amelyet általában töréspont-csomópontnak neveznek, amelyet a kör alakú eseménynek megfelelő szerkezeti leolvasású változatok alapján detektálnak (Gresham et al., 2010; m., 2018; Prada-Luengo et al., 2019) (1b.ábra). Általában száz bázistól a megabázis körökig terjednek, és teljes exonokat és géneket tartalmazhatnak (Shibata et al ., 2012; m., 2015; Kumar et al., 2017; Turner et al., 2017; m hosszú távú és mtsai., 2018), és míg a genom egyes régiói gyakrabban találhatók meg a körkörös DNS-en (Sinclair and Guarente, 1997;; M., 2016; Turner et al., 2017; m hosszú távú és mtsai., 2018), Úgy tűnik, hogy a legtöbb kör alakú DNS véletlenszerűen fordul elő (Shibata et al., 2012; m., 2015; Kumar et al., 2017; m hosszú távú és mtsai., 2018).

érdekes, hogy egy nemrégiben megjelent cikkben M ons et al. több ezer eccdns-t azonosítottak leukocitákban és izomsejtekben egészséges kontrollokban. Azzal a gondolattal, hogy megvizsgálják, hogy az eccdns-ek átírhatók-e, egy mRNS-könyvtárat is szekvenáltak az izomszövetből, és elemezték a transzkripciós eseményeket a detektált eccdns töréspont-csomópontján, több egyezést találva (M., 2018). Ez a megállapítás arra utal, hogy a körkörös DNS az egészséges szövetben átíródik, ami lineáris és poliadenilezett transzkriptumokat eredményez, amelyek a circrns-ek backsplicing szekvenciájával egyenértékű szekvenciát hordoznak(M)., 2018) (2.ábra).

a kör alakú DNS-ek transzkripciós bizonyítékai, bőségükkel együtt, arra engednek következtetni, hogy a kör alakú DNS-ek jelentős mennyiségű lineáris RNS-ek természetes forrása lehet, amelyek kiméra csomópontokat hordoznak. Sok esetben ezek a kiméra csomópontok nem különböztethetők meg a circrns-ek backsplicing csomópontjaitól, ezért zavaró tényezők lehetnek a circrns-vizsgálatokban. A következő bekezdésekben ismertetjük a javaslatot alátámasztó adatokat.

circrns kimutatás: Minden, ami csillog, nem Arany

mint korábban bemutattuk, a circrns-ek egy nem kanonikus splicing esemény, az úgynevezett backsplicing. Az ebből a backsplicing eseményből származó átiratok kovalensen zárt hurkú szerkezettel rendelkeznek, sem 5′-3′ polaritással, sem poliadenilezett farokkal, és ami még fontosabb, a lineáris átirathoz viszonyított kódolt exon sorrend jelenléte jellemzi őket (Zhang et al., 2016; Wilusz, 2018). Ez a kódolt exon-sorrend nyilvánvalóvá válik a backspliced csomópontban, amely egy 5′ downstream szekvenciát köt össze egy upstream 3′ szekvenciával. Így az összes circrns detektáló algoritmus kihasználja a visszaillesztett csomópontok jelenlétét diagnosztikai jellemzőként a circrns azonosítására (1a.ábra).

különböző módszereket alakítottak ki ezeknek a visszaillesztett csomópontoknak a kimutatására. A biomarker szűrővizsgálatokban széles körben alkalmazták az ezeket a hátlapos régiókat célzó próbákat tartalmazó kereskedelmi tömböket (Iparraguirre et al., 2017; Liu et al., 2017; Sui et al., 2017; Li et al., 2018). Az ezt követő validálás gyakran a backsplicing csomópontok divergens primerekkel történő erősítésén is alapul (Panda and Gorospe, 2018). Sok más cikk nagy áteresztőképességű szekvenálási elemzést végzett, amely legyőzi a tömbök egyik fő korlátját, amely lehetővé teszi nemcsak a jegyzetekkel ellátott circrns-ek, hanem a De novo RNS cirkularizációs eseményeinek kimutatását is olyan genomi régiókból, ahol a korábbi tanulmányok nem jegyeztek fel circrns-t. Számos bioinformatikai csővezetéket fejlesztettek ki a circrns-ek kimutatására az RNS-Seq adatkészletekben, de mindegyik a visszaillesztési csomópontokon áthaladó olvasmányok jelenlétén alapul, és a legmegbízhatóbb megtalálása továbbra is kihívást jelent a bioinformatikusok számára (Hansen et al., 2016; Hansen, 2018; Prada-Luengo et al., 2019).

két fő megközelítés követhető a circrns-ek kimutatására az RNS-Seq adatokban. Először is, sok circrns RNS-seq vizsgálat az RNase r kezelt mintákon alapul annak érdekében, hogy az összes lineáris RNS-t kimerítsék a szekvenálás előtt. Bár ezt a megközelítést kifejezetten a circrns kimutatására tervezték, érdemes megjegyezni, hogy az RNáz r lebomlása változó, hogy ritkán fordulnak elő RNáz r rezisztens lineáris RNS-ek és RNáz r érzékeny circrns-ek (Szabo and Salzman, 2016), és hogy ez a kezelés magas RNS-bemenetet igényel, amely egyes szövetek számára korlátozó lehet. Más circrns-vizsgálatok a teljes, riboszomális kimerültségű (ribo -) vagy nem poliadenilezett (polyA -) RNS szekvenciáját választják, ahol mind lineáris, mind kör alakú RNS-ek találhatók (Salzman et al., 2012; Memczak et al., 2013; Broadbent et al., 2015; Lu et al., 2015; Memczak et al., 2015). Ez a megközelítés elkerüli az RNáz R használatát, amely csökkenti a szekvenáláshoz szükséges RNS mennyiséget, és lehetővé teszi más típusú RNS-ek expressziójának tanulmányozását ugyanabból az adatkészletből. Kimutatták, hogy jó szekvenálási mélységgel és minőséggel, valamint gondos adatelemzéssel a teljes RNS-szekvenálásból valódi circrns-ek detektálhatók (Wang et al., 2017) azonban ebben a második megközelítésben a circrns-ek későbbi körkörösségének megerősítésére van szükség.

a körkörös DNS-ekből átírt lineáris kiméra RNS-ek felfedezésével a circrns-ek már nem az egyetlen átiratok kiméra csomópontokkal. Ezért rendkívül fontos megjegyezni, hogy míg az első megközelítés jelentősen gazdagítja az RNS-mintát a circrns-ekben, így a detektált kiméra csomópontok többsége megfelel a valódi circrns-eknek, a második túlbecsülheti a circrns-átiratok számát azáltal, hogy a circrns-eknek tulajdonítja mind a circrns-ekből érkező jelet, mind a kör alakú DNS-ekből átírt lineáris kiméra átiratokat. Következésképpen, figyelembe véve a cirkrns-ek és a lineáris kiméra átiratok együttélését, a körkörösségi tesztek és a funkcionalitásvizsgálatok szükségessége egyre fontosabbá válik, és különös figyelmet kell fordítani nemcsak a kísérleti, hanem a számítási módszerekre is, hogy elkerüljük a körkörös DNS-ekből származó kiméra átiratok összetévesztését a visszahelyezéssel létrehozott cirkrns-ekkel.

Vita

a circrns mező még mindig korai szakaszban van, azonban a circrns-ek már kimutatták, hogy megdöbbentő molekulák, amelyek számos folyamatban érintettek, nagy biomarker potenciállal rendelkeznek, és ez megváltoztathatja a transzkripciós és transzlációs folyamatok megértését is. Ezen okok miatt egyre nagyobb figyelmet kapnak, és a circrns mező jelenleg az egyik legaktívabb RNS kutatási terület. Azonban még mindig sok konfliktus, ellentmondás és nyitott kérdés van (Li, 2019), amelyeket meg kell vitatni.

ebben a jelentésben, valamint a körkörös DNS-mező közelmúltbeli fejlődésének fényében szeretnénk rámutatni az extrakromoszomális kör alakú DNS-ből származó transzkripcióra, mint a lineáris transzkripciók egyik fő természetes forrására, visszaillesztett jelekkel, amelyek zavarhatják a circrns-adatokat (M)., 2018). Mostantól a technikai leletek, duplikációk és transzplantációs események mellett, amelyek hamis pozitív eredményekhez vezethetnek a circrns kimutatásában, figyelembe kell vennünk az új típusú kiméra átiratok létezését is. Ezért a körkörös vizsgálatok és a funkcionális vizsgálatok fontosabbak, mint valaha.

mindenesetre ezeket a kiméra lineáris átiratokat nemcsak a circrns-vizsgálatok puszta zavaró tényezőjének kell tekinteni. A circrns-jellemzés technikai következményei ellenére az eccdns-ekből származó circrns-szerű kiméra lineáris RNS-molekulák létezése egy új típusú molekulát ad az RNS-ek egyre növekvő listájához, és kibővíti a transzkriptom összetettségéről és szabályozásáról alkotott elképzelésünket. Sőt, ezek az eccdns-ből származó lineáris RNS-molekulák a circrns-hez hasonló funkciókat is bemutathatnak, beleértve a szabályozó funkciókat vagy a lefordítandó potenciált. Az eccdns transzkriptumokból származó géntermékek potenciálisan hozzájárulhatnak a szomatikus sejtek és szövetek fenotípusához, amint azt az élesztőben jelentették (Gresham et al., 2010; Demeke et al., 2015). Ezen a kialakulóban lévő területen azonban több adatra és kutatásra van szükség a jéghegy felszínének megkarcolásához.

szerzői hozzájárulások

LI, IP-L, BR és DO írta a tanulmányt.

finanszírozás

ezt a tanulmányt az Instituto de Salud Carlos III finanszírozta a “PI17/00189” projekten keresztül (az Európai Regionális Fejlesztési Alap/Európai Szociális Alap társfinanszírozásával) “befektetés a jövőbe”). Az IP-L-T és a BR-t a dán független Kutatási Tanács, a 6108-00171B, az LI-t pedig a baszk kormány Oktatási Minisztériuma támogatta .

összeférhetetlenség

a szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.