a kromatin Immunprecipitációs (ChIP) vizsgálat fontos módszer a transzkripciós szabályozás monitorozására, a specifikus fehérjék és a genomi DNS régió közötti kölcsönhatások feltáratlan ismeretével. Tekintettel arra, hogy az élő sejtekben található DNS-kötő fehérjék (beleértve a transzkripciós faktorokat és hisztonokat) térhálósíthatók az általuk kötött DNS-hez, a chipet arra használják, hogy a fehérje–DNS komplexet megfelelő antitesttel immunprecipitálják a sejtlizátumokból. Az immunprecipitált komplexeket centrifugálással gyűjtik össze, és a fehérjéket eluálják további elemzés céljából, például western blot és LC/MS.a nukleinsav analízist PCR, RT-PCR, cDNS szekvenálás és mikroarray segítségével érik el. Ez a protokoll részletes eljárást biztosít a sikeres Chipvizsgálat gyors és hatékony eléréséhez.
reagensek:
- 37% formaldehid
- 1 M glicin
- sejtlízis puffer: 150 mM NaCl, 50 mM trisz-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, 1 db proteáz inhibitor koktéllal.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Adjunk hozzá 27 67 ml formaldehidet 1 mL tápközeghez, hogy 1% – os végső koncentrációt kapjunk, inkubáljuk a sejteket 10 percig szobahőmérsékleten, miközben lassan rázzuk egy ringató vagy rázóeszközön.
2. A keresztkötést 141 6 ml glicin / 1 mL táptalaj hozzáadásával oltjuk ki, hogy 125 mM-es végső koncentrációt kapjunk, a sejteket szobahőmérsékleten 5 percig inkubáljuk.
3. Úszó cellák esetében: a cellákat 15 mL-es kúpos csőbe helyezzük, centrifugáljuk 2000 g-on 4 6c-on 5 percig. Dobja ki a felülúszót, és mossa le a sejteket kétszer hideg PBS-sel.
Ugrás az 5.lépésre.
4. Ragasztósejtek esetén: távolítsa el a táptalajt, mossa le a sejteket kétszer hideg PBS-sel. Kaparja a sejteket PBS-be egy 15 mL-es kúpos csőben, centrifugálja 2000 g-on 4 KB-on 5 percig.
lízis és szonikáció
5. Dobja ki a felülúszót, adjon hozzá 1 mL hideg sejtlízis puffert 1 607 cellánként. A pelletet többször fel-le pipettázással reszuszpendáljuk, majd 10 percig jégen inkubáljuk.
6. Szonikát, hogy a kromatint 0,5~1 kb-os töredékre nyírja. Kerülje a habot, és tartsa a mintát jégen.
Megjegyzések:
- a Szonikációs feltételeket optimalizálni kell a minta és a szonikátor modelljétől függően. Jellemzően hat 15 másodperces impulzust, majd 45 másodperces pihenőidőt találtak a 6.0 kimeneten. A fragmentum méretének elemzéséhez kis mennyiségű teljes DNS-t extrahálunk egy nyírt kromatin alikvotból, majd elemezzük agarózgélen (1~2%).
- a kötetek azt javasolják, hogy legyen 1 mL, hogy fenntartsák a szonikáció hatékonyságát.
7. Centrifugáljuk 12 000 g-on 4 C-on 10 percig, és tartsuk meg a felülúszót.
8. Töltsön 0,5 mL felülúszót egy friss 1-be.5 mL-es cső DNS-fragmens elemzéshez.
Immunprecipitáció
9. Adjunk hozzá megfelelő antitesteket vagy normál IgG-t a mintához, és inkubáljuk 15 percig ultrahangos vízfürdőben szobahőmérsékleten.
Megjegyzések:
- válasszon IgG-t ugyanabból a fajból, ahol az antitesteket előállították.
- az inkubációs időt optimalizálni kell az antitest és az antigén függvényében. Az alacsony expressziós szintű antigének esetében az inkubációt 4-en végezhetjük 6CC egyik napról a másikra egy forgó platformon .
10. Készítsen fehérje a-agaróz gyöngyöket: a gyöngyöket háromszor mossuk 1 mL lízispufferrel (proteáz inhibitor nélkül), centrifugáljuk 2000 ft-on néhány másodpercig 4 ft-on, majd dobjuk ki a felülúszót.
11. Hígítsuk fel a gyöngyöket 1: 1 arányban lízispufferrel, majd adjunk hozzá 50 6L-t a mintához.
12. Inkubáljuk 4 db C-on 30~45 percig egy forgó platformon.
13. Centrifugáljuk 2000 db g-on 1 percig 4 db C-n, majd dobjuk ki a felülúszót.
14. A gyöngyöket négyszer mossuk 1 mL lízis pufferrel (proteáz inhibitor nélkül), dobjuk el a felülúszót.
DNS tisztítás és elemzés
15. A mosott gyöngyöket reszuszpendáljuk 100 db 60% – os Chelex 100-mal.
16. Pipettázzuk fel-le néhány másodpercig, majd forraljuk a mintát 10 percig.
17. Centrifugáljuk 12 000 g-on 1 percig szobahőmérsékleten, majd helyezzük át a felülúszót egy friss, 1,5 mL-es csőbe.
18. Tisztítsa meg a DNS-t DNS-tisztító készlet vagy standard fenol: kloroform extrakciós protokoll segítségével.
19. Oldjuk fel a DNS-t 50 6DL ddH2O-val, és használjuk a DNS-minta 2~10 ml-ét (a reakció térfogatának 25% – a) A PCR-reakciókban
Ismerje meg a ChIP elvét
érje el a ChIP szervízünket
ha bármilyen kérdése van, kérjük, vegye fel velünk a kapcsolatot: