a mikroszkópia alapértelmezés szerint olyan technika, amely lehetővé teszi számunkra, hogy megfigyeljük, nem pedig mérjük a biológiai eseményeket, és következtetéseket vonjunk le a látottak alapján, nem pedig néhány számítás alapján. A cikk témája ezért kissé meglepőnek tűnhet, mivel a kolokalizáció méréseivel foglalkozik. Bár vannak olyan helyzetek, amikor vizuálisan meg lehet határozni a fehérje kolokalizációját, gyakran szükség lesz két próba kölcsönös eloszlásának pontosabb megerősítésére.
miért nem elegendő a Kolokalizáció vizuális meghatározása?
csak akkor mondhatjuk, hogy a két szonda kizárólag megfigyelés alapján kolokalizálódik, ha ellenőrzött protokollt követ a kolokalizációs elemzéshez (elegendő jel minden csatornán, nincs autofluoreszcencia vagy jelátfolyás). Ebben az esetben, ha a zöld jel a piros jelzéssel kolokalizálódik, és a kép többnyire sárga, nincs szükség statisztikai mérésre. De ha nem lát átfedést, ez nem azt jelenti, hogy nincs ott! Lehet, hogy a két csatorna intenzitása nem azonos. Nevezetesen, a közbenső szín, amelyet látunk, csak akkor jelenhet meg, ha mindkét szonda azonos intenzitású. Ezért a vizuális meghatározáson alapuló következtetések gyakran hamis negatív eredményekhez vezethetnek.
milyen módszerek léteznek az átfedés mérésére?
bár ebben a kérdésben nincs egyetlen szabványos megközelítés, két széles körben alkalmazott és általánosan elfogadott módszer létezik. Ezek magukban foglalják Pearson korrelációs együtthatóját (PCC) vagy Mander kolokalizációs együtthatóját (MCC).
ez a két módszer a kolokalizáció két különböző aspektusára vonatkozik – a korrelációra és az együttes előfordulásra. A Pearson-együttható a két csatorna pixelintenzitásának korrelációjához kapcsolódik. Méri a jelek közötti kapcsolatot-függetlenül attól, hogy az egyik csatorna jelértékei egyidejűleg emelkednek-e a másikkal, vagy az egyik jel esik, amikor a másik emelkedik. A korreláció különbözik az együttes előfordulástól, amelyet matematikailag Mander együtthatója fejez ki. Ez az egyik jel lefedettségét jelenti a másik felett, amely feltárja, hogy két szonda milyen mértékben foglalja el ugyanazt a helyet. Vizsgáljuk meg ezt egy kicsit tovább.
Pearson korrelációs együtthatója (PCC)
meghatározás: a PCC a jelintenzitások közötti lineáris kapcsolatot tükrözi. Az értékek 1 (tökéletes pozitív korreláció) és -1 (tökéletes negatív korreláció) között mozoghatnak, míg a 0 azt jelenti, hogy nincs korreláció. Lehetőség van a PCC vizuális felfedezésére a scattergram ahol a telek koordinátái pixelértékeket (jelet) képviselnek mindkét csatornán. Minél több pont csoportosul egy egyenes vonal körül, annál jobb a korreláció a két jel között
követelmények: a PCC-t az érdekes régióban (ROI) kell mérni a hamis pozitív vagy negatív eredmények elkerülése érdekében. Ha a PCC-t a teljes képen mérjük, a háttér pixelei tökéletesen korrelálnak, és felfújják a PCC-t. Ezzel szemben, ha a mérést olyan érdekes régióban hajtják végre, ahol mindkét csatorna heterogén eloszlása van, a PCC depressziós lesz.
a ROI-t kézzel vagy küszöbértékkel választhatja ki a háttér kizárásához. Bárhogy is csinálja, legyen óvatos, különösen küszöbértéknél. A ROI kiválasztásának tartalmaznia kell a sejt(ek) összes releváns régióját, azaz minden olyan helyet, ahol a szonda várhatóan eloszlik. Ha intenzitás-alapú módszert használ a ROI (küszöbérték) kiválasztásához, véletlenül kizárhatja a releváns eredményeket. Hogy történhetett ez meg? Lehet, hogy a kölcsönös kirekesztés régiója, ahol egyik címke sem jelenik meg, és ez biológiailag releváns eredmény lehet (mindkét molekula nem expresszálódik a sejt azon a helyén). A küszöbértékek azonban nem tartalmazzák ezt a régiót a ROI-ban, így fennáll annak a veszélye, hogy elveszíti a releváns eredményeket.
ajánlott: PCC-t kell használni a képeken, Ha lineáris kapcsolat van az intenzitások között. Ha az adatok egy összetettebb modellhez illeszkednek, a PCC nem fog jól teljesíteni. Más módszert kell választani, ha egyenetlen átfedés van, ahol a szondák együtt oszlanak el, de különböző arányban. Ez akkor fordulhat elő, ha a GFP-t egy szondaként használják. Expressziós szintje eltérhet a sejtek között, és potenciálisan a PCC depresszióját okozhatja a magas intercelluláris variabilitás miatt.
Mander Kolokalizációs együtthatói
meghatározás: az MCC egy olyan mutató, amely leírja az együttes előfordulást-az egyik fehérje frakcióját, amely kolokalizálódik a másikkal. MCC kapsz egy jó intézkedés a kolokalizáció, ha a címke egy fehérje a vezikulumban, és szeretné látni, hogyan kolokalizálódik egy bizonyos szerkezet egy sejtben, mondjuk egy mikrotubulus. Ha feltételezzük, hogy az összes vezikulum mikrotubulusokkal kolokalizálódik, de a mikrotubulusoknak csak egy része kolokalizálódik a vezikulummal, akkor kiszámíthatja az MCC-t minden csatornára, és kaphat egy mutatót, amely kvantitatívan leírja ezt a frakcionált átfedést.
követelmények: a fogás MCC, hogy megköveteli a megszüntetése háttér. A legbonyolultabb rész itt az intenzitás határpontjának beállítása, amely lehetővé teszi a háttér kivonását. Az MCC egy szonda teljes fluoreszcenciáját méri minden nulla feletti pixelben. A nulla feletti pixelek azonban rendkívül ritkák, olyan tényezők miatt, mint: autofluoreszcencia, Fényszivárgás, nem specifikus címkézés vagy fluoreszcencia a fókuszon kívüli kép síkságokról. Az MCC mérése ezért a küszöb (cutoff) gondos kiválasztását igényli.
ennek első módja a globális küszöbérték, ahol minden pixelből kivonunk egy küszöbértéket, így a kiválasztott határérték alatti minden szint háttér lesz, és minden fenti pixel egy érdekes régióba esik. Bár ez nagyon intuitív, a globális küszöbérték meglehetősen durva, és nem kívánt helyzetekhez vezethet, mint például a háttérhez közeli, de valójában pozitív alacsony értékű pixelek kizárása.
egy automatikusabb és kevésbé szubjektív lehetőség a Costes módszer, ahol a küszöbértéket a PCC többszörös kiszámításával becsülik meg. Ez a pozitív pixelértékek tartományának meghatározására szolgál, ezért nem szabad kizárni őket. A PCC-t különböző pixelcsoportokra számítják ki, és küszöbértékként azokat a pixelértékeket veszik figyelembe, amelyeknél a PCC egyenlő vagy közel nulla. Ennek ellenére vizuálisan is ellenőrizni kell, mivel az alacsonyabb jel-zaj arányú képeken nagyon alacsony küszöbértéket azonosíthat, így nem különbözteti meg a címkézett struktúrákat a háttértől.
ajánlott: amikor a kísérlet biológiai kérdése a fehérje/struktúrák átfedésének mértékére vonatkozik, az MCC-nek kell lennie a választás mértékének. Ezek az együtthatók intuitívabban értelmezhetők, mint a PCC, és függetlenek a jel arányosságától (az egyes szondák által jelzett struktúrák számának különbségeitől).
Mielőtt elkezdené az elemzést
bármelyik választást választja a kolokalizáció mérésére, nagyon fontos, hogy a képgyűjtés helyes módon történjen. Próbáljon meg annyi tényezőt ellenőrizni, amennyit csak tud, és készítsen olyan kontrollmintákat, amelyek lehetővé teszik a lehető legtöbb változó figyelemmel kísérését.
ne feledje, hogy a vizuális kolokalizáció meghatározását számos tényező befolyásolja, többek között a megfigyelő szubjektivitása, az a tény, hogy az egyes egyének agya másképp látja a színeket, a megfigyelő lehetséges színvaksága és a térbeli felbontás, amely meghatározza a pixel méretét. Ügyeljen arra, hogy az elemezni kívánt képeket egységes módon dolgozza fel, és ne feledje, hogy bármilyen ellenőrizetlen manipuláció a releváns információk elvesztését okozhatja.
és végül, de nem utolsósorban
ezeket a számításokat a legtöbb képelemző szoftvercsomagban hajtják végre, például az ImageJ és a Volocity. De mivel a kolokalizáció mérése még mindig kissé zavaró terület, fejlesztésekre van szükség, ezért kövesse nyomon a szoftver új verzióit és csomagjait.
Hogyan mérjük a kolokalizációt? Tudassa velünk írásban a megjegyzések részben!
Irodalom:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. Gyakorlati útmutató a kolokalizáció értékeléséhez a biológiai mikroszkópiában. American Journal of Physiology-Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Kolokalizációs elemzés fluoreszcens mikroszkópiában. Ban ben: Taatjes, Douglas J., Roth, J Enterprgen (Szerk.), Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, New York: Humana Press, 2012, PP.97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Statisztikai vizsgálatok a kolokalizáció mérésére biológiai mikroszkópiában. Mikroszkópos folyóirat. 2013; 252(3): 295-302
ez segített neked? Akkor kérjük, ossza meg a hálózattal.