antitesteket
Dynabeads-hez konjugált nyúl IgG-t (Sigma) alkalmaztak TAP-tagged törzsek ellen, amelyekben az a fehérjét tartalmazó Tap-tag volt a cél. Millipore 07-729 antitestet használtunk a CTCF-et célzó K562 minták ellen.
Tn5 Tisztítás
a TN5 e54k e110k P242A L372P14 egyedi konstrukcióját pET-45b( + ) vektorban rendelték (GenScript) a hiperaktív Tn5 kifejezésére egy N-terminális His6-tag. A plazmid az Addgene-nél kapható (Addgene ID: 112112). A BL21 (DE3) Kompetens E. coli sejteket (New England Biolabs) transzformáltuk, és egyetlen kolóniát növesztettünk 37cc-n OD600-ra 0,4-re 500 ml LB + 50db/ml ampicillin + 30db/ml kloramfenikolban. A sejteket átvittük egy 25 6CC inkubátorba, és 0,5 mM izopropil-d-galaktopiranoziddal indukáltuk 4 órán keresztül.a sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze, egyszer st pufferrel mossuk, majd a sejtpelletet folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk.
a Tn5-et a korábban leírtak szerint tisztítottuk10, kevés módosítással. Röviden, a sejteket reszuszpendáltuk 10 Térfogat (ml/g) TEGX100 pufferben (20 mM-es trisz-HCl, pH 7,5, 100 mM-es NaCl, 1 mM-es EDTA, 10% glicerin, 0,1% Triton-X 100), amely CPI-t és 100 Ft fenilmetil-szulfonil-fluoridot tartalmazott, és lizozimmal (Sigma; 1 mg / 1 g sejtpellet) inkubálással szobahőmérsékleten 30 percig lizáltuk. A lizátumot 20 000 6g-on 20 percig 4CC-n centrifugáltuk, a felülúszót 0,25% polietilén-iminnel (szigma) kicsaptuk, majd 10 000 g-on 15 percig centrifugáltuk. A felülúszót ezután 47% – os telítettségű ammónium-szulfáttal (0.28 g/ml) egy 30 perces inkubálás alatt, majd 20 000g-n centrifugáljuk 15 percig.
a pelletet ezután 50 ml nikkel affinitás terhelő pufferben (50 mM kálium-foszfát, pH 7,4, 50 mM KCl, 20% glicerin) reszuszpendáltuk, és egy HisTrap HP oszlopra (GE Healthcare; 5 ml) töltöttük 1,5 ml/perc sebességgel, ugyanezzel a pufferrel egyensúlyban. Az oszlopot egymás után mossuk I mosópufferrel (50 mM kálium-foszfát, pH 7,4, 1 M KCl, 50 mM imidazol, 20% glicerin), II mosópufferrel (50 mM kálium-foszfát, pH 7.4500 mM KCl, 50 mM imidazol, 20% glicerin), majd a TN5-öt nikkel affinitás elúciós pufferrel (50 mM kálium-foszfát, pH 7,4, 500 mM KCl, 500 mM imidazol, 20% glicerin) eluáltuk 2 ml/perc sebességgel. Az eluátumot hígító pufferrel 300 mM KCl-re hígítottuk (50 mM kálium-foszfát, pH 7,4, 20% glicerin), a végső térfogatot pedig 50 ml-re állítottuk TEGX300 pufferrel (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerin, 0,1% Triton-X 100).
ezután a mintát HiTrap Heparin HP oszlopra töltöttük (GE Healthcare; 1 ml), amelyet TEGX300-mal 1 ml/perc sebességgel egyensúlyoztunk. 5 oszlop térfogatú pufferrel történő mosás után egy 10 ml-es lineáris (300 mM-től 1,2 M-ig) NaCl gradienst futtattunk eluálni. A TN5 az oszlopból körülbelül 600 mM NaCl-on eluálódik. A fő elúciós csúcsot tartalmazó frakciókat kombináltuk (3,5 ml), és egy éjszakán át dializáltuk a 30% glicerint tartalmazó TEGX300 pufferrel szemben, majd -80 6587>
élesztő kromatinkészítmény
TAP-taggal ellátott Saccharomyces cerevisiae törzseket (nyílt Biosystems) 500 ml élesztő pepton-dextróz közegben OD600 = 0,8-ra növeltük 25 65 C-on. A sejteket formaldehiddel térhálósítottuk 1% – os végső koncentrációban 15 percig szobahőmérsékleten, majd 125 mM-es glicin végső koncentrációval 5 percig leállítottuk. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze,majd 1 ml ST pufferben (10 mM-es Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) megmossuk 4CC-n, és két alikvotra osztottuk. A sejteket ismét pelletáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, a pelletet pedig gyorsan lefagyasztottuk.
egy 250 ml-es tenyésztési alikvot-ot lizáltunk 750 6L fa lízis pufferben (50 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% nátrium-dezoxikolát és CPI) és 1 ml térfogatú 0,5 mm-es cirkónium-oxid/szilícium-dioxid gyöngyök gyöngyveréssel egy Mini-Beadbeater-96 gépben (Biospec) három, 3 perces be – /5 perces kikapcsolási cikluson keresztül (a mintákat jégen tartották az off ciklus alatt). A lizátumot átvisszük egy új csőbe, és maximális sebességgel mikrocentrifikáljuk 3 percig 4 6c-on, hogy a kromatint pelletáljuk. A felülúszót eldobtuk, és a pelletet reszuszpendáltuk 750 db 6,1% – os SDS-sel kiegészített FA lízis pufferben, majd egy 15 ml-es Polisztirol kúpos csőbe helyeztük. A mintát ezután egy Bioruptorban (Diagenode) szonikáltuk 15 cikluson keresztül, 30 s be/ki intervallumokkal, hogy 100-500 bp méretű DNS-fragmenseket kapjunk. Egy ChIP-exo vizsgálat 50 ml-es sejttenyészetnek felel meg (~6 db 108 sejt). Ez kényelmes összeget jelent, nem pedig a szükséges minimális összeget.
K562 kromatinkészítmény
humán krónikus mieloid leukémia sejteket (K562, ATCC) 1 605-1 106 sejt/ml között tartottunk DMEM táptalajban, 10% magzati szarvasmarha szérummal kiegészítve 37 C-on, 5% CO2-vel. A sejteket PBS-sel (8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl és 2,7 mM KCl) mossuk, majd formaldehiddel térhálósítjuk 1% – os végső koncentrációban 10 percig szobahőmérsékleten, majd 125 mM-es glicin végső koncentrációval 5 percig leállítjuk. A felülúszót eltávolítottuk, és a sejteket 1 ml PBS-ben reszuszpendáltuk a mosáshoz. A sejteket 100 millió sejtnek nevezték el, centrifugálták, a felülúszót eltávolították, a pelletet pedig gyorsan lefagyasztották.
egy 100 millió cellás alikvot (több chipben való felhasználásra) lizáltunk 500 (10 mM-es trisz-HCl, pH 8,0, 10 mM-es NaCl, 0).5% NP40 és teljes proteáz inhibitor (CPI, Roche)) 10 percig jégen inkubálva. A lizátumot 2500 fordulat / perc sebességgel mikrocentrifikáltuk 5 percen át 4 6c-on. a felülúszót eltávolítottuk, a pelletet 1 ml-ben reszuszpendáltuk (50 mM-es Tris-pH 8,0, 10 mM-es EDTA, 0,32% SDS és CPI), és 10 percig jégen inkubáltuk, hogy a magok lizálódjanak. A mintát 600 db 60 mm-es immunprecipitációs hígító pufferrel (IP hígító puffer: 20 mM-es Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM-es EDTA, 150 mM-es NaCl, 1% Triton X-100 és CPI) hígítottuk (40 mM-es Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM-es EDTA, 56 mM-es NaCl, 0,4% – os Triton-X 100, 0) végső koncentrációra.2% SDS és CPI), és egy Bioruptorral (Diagenode) szonikálva 10 cikluson keresztül, 30 s be/ki intervallumokkal, hogy 100-500 bp méretű DNS-fragmenseket kapjunk.
Egérszövet-előkészítés
16 hetes felnőtt hím egér agy -, tüdő -, máj-és veseszöveteit Dr. Yanming Wang nagylelkűen biztosította.az Egérszöveteket 100 mg-os adagban dolgoztuk fel, és a kromatint a korábban leírtaknak megfelelően állítottuk elő21 kisebb módosításokkal. Röviden, 100 mg egérszövetet jégen darabokra daráltunk, 1% – os formaldehiddel 10 percig rögzítettük, majd 125 mM-es glicin végső koncentrációval 5 percig leállítottuk. A sejteket megpörgetjük, PBS-sel mossuk, majd 1 mL hideg Farnham sejtlízis pufferben (20 mM-es Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 és CPI) reszuszpendáljuk. A sejteket ezután egy rototorque-on inkubáltuk 20 percig 4 C-on. az izolált magokat leválasztottuk és RESZUSZPENDÁLTUK RIPA nukleáris lízis pufferben (1 db PBS, 1% NP-40, 0,5% Nadeoxikolát, 0,5% SDS és CPI). A magokat ezután egy Bioruptorral (Diagenode) szonikáltuk 10 cikluson keresztül, 30 s be/ki intervallumokkal, hogy DNS-t generáljunk a 100-500 bp mérettartományban. A májsejtek számát A korábban leírtak szerint becsültük22, 1 mg szövet nedves tömegének konverziós tényezője ~250 000 sejtnek felel meg.
kromatin immunprecipitáció
egy 50 ml-es élesztőtenyészet-ekvivalenst vagy 10 millió sejt-ekvivalens K562 kromatint IP hígító pufferrel 200 6L-re hígítottunk, és egy éjszakán át 4 C-on inkubáltuk a megfelelő ellenanyaggal. Az élesztőmintákhoz 10 db 6L ágyas IgG-Dynabead-ot adtunk; a K562 mintákhoz 3 db anti-CTCF antitestet adtunk 10 db a mag Sepharose (GE Healthcare) fehérje szuszpenzió-ekvivalenssel.
ChIP-exo 1.1
ChIP-exo 1.1-et a korábban leírtak szerint végeztük7,8,23. Röviden, a következő enzimatikus lépéseket hajtottuk végre immunprecipitált kromatinnal, még mindig a gyantán, több sómosással az egyes lépések között: T4 DNS polimeráz végpolírozás, T4 polinukleotid kináz, Klenow fragmentum a-farok, T4 DNS ligáz által közvetített Read_2 adapter ligálás, phi29 DNS polimeráz kitöltés, második T4 polinukleotid kináz, lambda exonukleáz emésztés és RecJf exonukleáz emésztés. Egynapos reverz keresztkötést és proteináz K kezelést követően az oldatban a következő lépéseket hajtottuk végre: phi29 primer kiterjesztés, második Klenow fragmens a-tailing, T4 DNS ligáz által közvetített Read_1 adapter ligálás és PCR.
ChIP-exo 3.0 és 3.1 (tagmentáció alapú változat)
immunprecipitáció után a következő lépéseket hajtottuk végre a gyantán. A Transzpozáz összeállításához a Tn5-öt a következő komponenseket tartalmazó, 10 MHz-es Transzpozáz-keverékben inkubáltuk, majd szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk: 12,5 m TN5, 50% glicerin és 7,5 m adapter (NexA2/ME comp). Az ebben a vizsgálatban használt oligonukleotidszekvenciákat Lásd az 1. Kiegészítő táblázatban.
a gyanta Forgácsanyagát egymás után mossuk FA lízis pufferrel, NaCl pufferrel (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1%-os nátrium-dezoxikolát), LiCl puffer (100 mM-es trisz-HCl, pH 8,0, 500 mM-es LiCl, 1%-os NP-40, 1%-os nátrium-dezoxikolát) és 10 mM-es trisz-HCl, pH 8,0, c-n 4 6587> c-n
a tagmentációs reakció (30 6L) a következőket tartalmazza: 20 mM-es trisz-HCl, pH 7,5, 5 mM-es MgCl2, 10% – os dimetil-formamid és 1 ~ az 1.lépésből származó tagmentációs keveréket (végkoncentráció: 1,25 Ft TN5, 5% glicerin, 750 nm adapter) 30 percig inkubáltuk 37 ft-on. inkubálást követően a gyantát kétszer mossuk guanidin-hidroklorid pufferrel (50 mm tris-HCL, pH 7,5, 500 mm guanidin-hidroklorid, 2 mm EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% – os nátrium deoxycholate) 5 perc, 37 °C-on, majd egyszer LiCl Puffer, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C.
A fill-in reakció (30 µl), amely: 10 U phi29 polimeráz (NEB), 1 × phi29 reakció puffer (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA, valamint 165 µM dNTPs terjedni kezdett a 20 perc 30 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. A kináz reakció (30 µl), amely: 10 U T4 PNK (NEB), 1 × T4 DNS Ligase Puffer (NEB), 2 × BSA volt lappangási idő 15 perc, 37 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. A λ exonuclease emésztés (100 µl) tartalmazó: 20 U λ exonuclease (NEB), 1 × λ exonuclease reakció puffer (NEB), a 0,1% Triton-X-100, 5% DMSO volt inkubáljuk 30 percig 37 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. A RecJf exonuclease emésztés (100 µl), amely: 75 U RecJf exonuclease (NEB), 2 × NEBuffer 2, A 0,1% Triton-X-100, 5% DMSO volt inkubáljuk 30 percig 37 °C-on; akkor mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C.
DNS eluálódnak a gyanta, valamint a fordított kereszt-összekötő, valamint Proteináz K kezelést végeztek (40 µl), amely: 30 µg Proteináz K, 25 mM Tris-HCl, pH 7-es.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, és 0,5% SDS inkubáltuk 16 órán át 65 db 65dB-n. a felülúszót ezután átvisszük egy új csőbe, és agencourt AMPure mágneses gyöngyökkel (Beckman Coulter) tisztítjuk a gyártó utasításait követve, és 1,8db-os AMPure szuszpenziót adunk a DNS térfogatához (72db).A mintát az Ampergyöngyökből 10 6L vízben eluáltuk, majd oldatban a következő enzimatikus lépéseket hajtottuk végre.
Adapter lekötésével (version 3.0): a primer kiterjesztés reakció (teljes reakciótérfogat 20 6L); a újraszuszpendált minta volt, ki 1 × phi29 reakció puffer, 2 × BSA, 100 µM dNTPs, 0,5 µM NEKEM sorrend oligonukleotid (összesen 9 µl), valamint a lappangási idő 5 percig 95 °C-ig, majd 10 perc, 45 °C-lehetővé teszi az oligo idő, hogy kiizzít. A minta eltolódott 30 °C hozzáadása előtt 10 U phi29 polimeráz (1 µl), valamint azokat a 20 perc 30 °C-on, majd 10 perc, 65 °C-inaktiválják, eltolódott 37 °C-on
a követ reakció (a teljes reakció térfogat 30 µl); a primer kiterjesztését reakció volt, ki 10 U Klenow Töredék, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (összesen 10 µl), majd inkubáljuk 30 percig 37 °C-on, majd 20 perc 75 °C-inaktiválják, eltolódott 25 °C. a második adapter ligálási reakció (a teljes reakció térfogat 40 µl); a követ reakció volt, ki 2,000 U T4 DNS ligase (enzymatics), 1 × NEBNext Gyors Lekötésével Puffer (NEB), 375 nM-adapter (ExA1-58/13), valamint a lappangási idő 1 h 25 °C.
Sín lekötésével (3.1-es verziója): az adapter lekötésével (40 µl); az újraszuszpendált DNS-hez 1200 U T4 DNS-ligázt, 1 db T4 DNS-ligáz puffert, 375 nM-es adaptert (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) adtunk, és 1 órán át inkubáltuk 25 db C-on.
mindkét 3.0-s és 3.1-es verzió: a ligálási reakciót ezután AMPure gyöngyökkel tisztítottuk és 15 db 6L vízben reszuszpendáltuk. A mintát ezután PCR-rel amplifikáltuk. PCR amplifikációhoz (teljes reakciótérfogat 40 6L); az újraszuszpendált DNS-hez 2 U fúziós Melegindítású polimerázt (Thermo scientific), 1 o phúziós HF puffert (Thermo scientific), 200 m dntps-t, 500 nM-t adtunk primerenként (P1.3 és NexA2-iNN), és 18 cikluson keresztül erősítették (20 másodperc 98cc denatúránál, 1 perc 52ccc hőkezelésnél és 1 perc 72cc hosszabbításnál). A reakció egynegyedét további hat cikluson keresztül amplifikáltuk (összesen 24), és a könyvtárak jelenlétét 2% – os agaróz gélen végzett elektroforézissel határoztuk meg.
méretválasztás: 200-500 bp PCR terméket géltisztítottunk egy 2%-os agaróz gélből a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) segítségével.
ChIP-exo 4.0 és 4.1 (egyszálú DNS ligációs változatok)
immunprecipitáció után a következő lépéseket hajtottuk végre a gyantán. A ChIP anyag gyanta volt mosni, egymás után FA Lízis Puffer, NaCl Puffer, LiCl Puffer, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. A végén javítás reakció (50 µl), amely: 7.5 U T4 DNS polimeráz (NEB), 2.5 U-DNS-Polimeráz I (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4 DNS Ligase Puffer, valamint 390 µM dNTPs volt inkubáljuk 30 min 12 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. A λ exonuclease emésztés (100 µl), amely: 20 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reakció puffer, a 0,1% Triton-X-100, 5% DMSO volt inkubáljuk 30 percig 37 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. A RecJf exonuclease emésztés (100 µl), amely: 75 U RecJf exonuclease, 2 × NEBuffer 2, A 0,1% Triton-X-100, 5% DMSO swas inkubáljuk 30 percig 37 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C.
Első adapter lekötésével: ssDNA lekötésével (4.0, 40 µl): a adapterion lekötésével 1200 U T4 DNS ligase, 1 × T4 DNS Ligase Puffer, pedig 375 nM egyszálas adapter (ExA1-58-N5) volt a lappangási idő 1 h 25 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C.
Sín lekötésével (4.1-es verzióját, 40 µl): 1200 U T4 DNS ligase, 1 × T4 DNS Ligase Puffer, vagy 375 nM-adapter (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) volt a lappangási idő 1 h 25 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C.
Mindkét verzió 4.0 vagy 4.1: a DNS eluálódnak a gyanta, valamint a fordított kereszt-összekötő, valamint Proteináz K kezelést végeztek (40 µl), amely: 30 µg Proteináz K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, illetve 0,5% – os SDS keltetett 16 h 65 °C.
a felülúszót ezután egy új csőbe helyeztük, és a gyártó utasításait követve Agencourt AMPure mágneses gyöngyökkel (Beckman Coulter) tisztítottuk (1,8 db térfogat). A mintát az Ampergyöngyökből 20 6L vízben eluáltuk, majd oldatban a következő enzimatikus lépéseket hajtottuk végre.
második adapter lekötése: ssdns lekötése( 4.0-s verzió, teljes reakciótérfogat 40 6L): az újraszuszpendált DNS-hez 1200 U T4 DNS-ligázt, 1 db T4 DNS-ligáz puffert, 375 nM-es adaptert (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) adtunk, és 1 órán át inkubáltuk 25 db C-on.
Sínadapter lekötése (4.1-es verzió, teljes reakciótérfogat 40 6L): az újraszuszpendált DNS-hez 1200 U T4 DNS-ligázt, 1 db T4 DNS-ligáz puffert, 375 nM-es adaptert (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) adtunk, majd 1 órán át inkubáltuk 25 db C.
mindkét 4.0-s és 4.1-es verzióban: a lekötési reakciót ezután megtisztítottuk ampergyöngyökkel (1,8 db térfogat) és 15 ml vízben Reszuszpendálva. A mintát ezután PCR-rel amplifikáltuk. PCR-amplifikációhoz (teljes reakciótérfogat 40 6L); az újraszuszpendált DNS-hez 2 U fúziós Melegindító polimerázt (Thermo scientific), 1 db fúziós HF puffert (Thermo scientific), 200 db dntps-t, 500 nM-t minden alapozónként (P1.3 és NexA2-iNN) adtunk, és 18 cikluson keresztül erősítettük (20 s 98 db C denatúránál, 1 perc 52 db C lágyításnál, 1 perc 72 db C kiterjesztésnél). A reakció egynegyedét további hat cikluson keresztül amplifikáltuk (összesen 24), és a könyvtárak jelenlétét 2% – os agaróz gélen végzett elektroforézissel határoztuk meg. Méretválasztás: 200-500 bp PCR terméket géltisztítottunk egy 2%-os agaróz gélből a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) segítségével.
Megjegyzés: A ChIP-exo 4.0/4.1 beépített egy univerzális Read_2 adaptert, a vonalkódot később adták hozzá a PCR során hosszú alapozókkal. Amikor hosszú PCR primereket használtak egy könyvtári konstrukcióban, amely magában foglalta a lambda exonukleáz emésztését, a könyvtárak alacsony hozammal és magas adapter dimerekkel szenvedtek. Jelenleg csak teljes hosszúságú adaptereket és minimális hosszúságú PCR primereket használunk.
ChIP-exo 5.0
immunprecipitáció után a következő lépéseket hajtottuk végre a gyantán. A ChIP anyag gyanta volt mosni, egymás után FA Lízis Puffer, NaCl Puffer, LiCl Puffer, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. a követ reakció (50 µl), amely: 15 U Klenow Töredék, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP volt inkubáljuk 30 percig 37 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. Az első adapter lekötésével, valamint kináz reakciók (45 µl) tartalma: 1200 U T4 DNS ligase, 10 U T4 PNK, 1 × NEBNext Gyors Lekötésével Puffer, vagy 375 nM-adapter (ExA2_iNN / ExA2B) volt a lappangási idő 1 h 25 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. A fill-in reakció (40 µl), amely: 10 U phi29 polimeráz, 1 × phi29 reakció puffer, 2 × BSA, majd 180 µM dNTPs terjedni kezdett a 20 perc 30 °C-on, majd mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C. A λ exonuclease emésztés (50 µl), amely: 10 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reakció puffer, a 0,1% Triton-X-100, 5% DMSO volt inkubáljuk 30 percig 37 °C-on; akkor mossuk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 4 °C.
DNS eluálódnak a gyanta, valamint a fordított kereszt-összekötő, valamint Proteináz K kezelést végeztek (40 µl) tartalmazó: 30 6G proteináz K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, és 0,5% SDS inkubáltuk 16 órán át 65 oc-on. a felülúszót ezután egy új csőbe helyeztük, és Agencourt AMPure mágneses gyöngyökkel (Beckman Coulter) tisztítottuk a gyártó utasításait követve (1,8 db térfogat).A mintát az Ampergyöngyökből 20 6L vízben eluáltuk, majd oldatban a következő enzimatikus lépéseket hajtottuk végre. A második adapter lekötésével (teljes reakciótérfogat 40 6L): az újraszuszpendált DNS-hez 1200 U T4 DNS-ligázt, 1 db T4 DNS-ligáz puffert, 375 nM-es adaptert (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) adtunk, majd 1 órán át inkubáltuk 25 db C-on.
a mintát ezután PCR-rel amplifikáltuk. PCR amplifikációhoz (teljes reakciótérfogat 40 6L); az újraszuszpendált DNS-hez 2 U fúziós Melegindítású polimerázt (Thermo scientific), 1 o phúziós HF puffert (Thermo scientific), 200 m dNTPs-t, 500 nM-t adtunk primerenként (P1.3 és P2.1), majd 18 cikluson keresztül erősítették (20 másodperc 98 KB-os denatúránál, 1 perc 52 KB-os lágyításnál, 1 perc 72 Kb-os hosszabbításnál). A reakció egynegyedét további hat cikluson keresztül amplifikáltuk (összesen 24), és a könyvtárak jelenlétét 2% – os agaróz gélen végzett elektroforézissel határoztuk meg. Méretválasztás: 200-500 bp PCR terméket géltisztítottunk egy 2%-os agaróz gélből a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) segítségével.
Megjegyzés: megállapítottuk, hogy a géltisztítástól eltérő módszer alkalmazása ebben a szakaszban elfogadhatatlanul magas szintű adapter dimereket eredményez a végső mintában. A géltisztítás hatékonyan elválaszthatja az adapter dimert (150 bp fragmentum) és a ChIP-exo könyvtár kisebb töredékeit (200 bp fragmentum = 150 bp adapterek + 50 bp betét).
DNS-szekvenálás
nagy áteresztőképességű DNS-szekvenálást végeztünk egy NextSeq 500-zal párosított végű módban, 2 db 40 bp-s olvasást produkálva. A szekvenciaolvasásokat ezt követően az élesztő (sacCer3) és a humán (hg19) genomokhoz igazítottuk a bwa-mem (v0.7.9 a)24 használatával. Az igazított olvasmányokat szűrtük, hogy eltávolítsuk a nem egyedi igazításokat és PCR duplikátumokat. A PCR duplikátumokat azonos Read_1 és Read_2 szekvenciákkal rendelkező szekvenciaolvasásokként definiáltuk.
adatok rendelkezésre állása
a vizsgálatból származó összes szekvenálási fájl és peak fájl az NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) címen érhető el gse110681 és GSE114606 csatlakozási szám alatt. A koordinátafájlok, a szkriptparaméterek és az ehhez a papírhoz használt számok létrehozásához használt egyedi kód letölthető a következő címről: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.
minden más adat ésszerű kérésre rendelkezésre áll a szerzőktől.