egyetlen mutáció a kloramfenikol-acetil-transzferáz erősen konzervált régiójában lehetővé teszi az izobutil-acetát előállítását közvetlenül cellulózból a Clostridium thermocellum segítségével, magas hőmérsékleten

baktériumtörzsek és plazmidok

baktériumtörzsek és plazmidok a vizsgálatokat a 2.táblázat tartalmazza. Clostridium thermocellum dsm1313 Ft (M1354) törzset használtunk gazdaszervezetként az észter előállításához magas hőmérsékleten. Meg kell jegyezni, hogy a hipoxantin-foszforibozil-transzferáz gén (hpt, Clo1313_2927) deléciója a vad típusú DSM1313-ban lehetővé teszi a géntechnológiát a 8-azahipoxantin (8-AZH) ellenszelekcióval; ennek a deléciónak Nincs ismert káros hatása a sejtnövekedésre és az anyagcserére . A CATSa-t tartalmazó pnw33n plazmid termostabil, és különböző macskák C. thermocellumban történő expresszálására használták. A pET plazmidokat molekuláris klónozásra és enzimexpresszióra használták E. coli-ban.

vegyszerek és reagensek

minden vegyszert a Sigma-Aldrich (MO, USA) és/vagy a Thermo Fisher Scientific (MA, USA) cégtől vásároltak, kivéve, ha máshol szerepel. A molekuláris klónozáshoz restrikciós enzimeket és T4 ligázt nyertek a New England Biolabs – ból (MA, USA). Phusion Hot Start II DNS polimerázt használtunk polimeráz láncreakció (PCR).

táptalaj és tenyésztés

a molekuláris klónozáshoz és a fehérje expresszióhoz az E. coli törzseket megfelelő antibiotikumokat tartalmazó lizogén táptalajban (LB) tenyésztették, hacsak másként nem jeleztük. A CATSa in vivo jellemzésére E. coliban M9 hibrid táptalajt használtunk 20 g / L glükózzal. A C. thermocellum tenyészethez MTC minimális táptalajt vagy CTFuD-NY táptalajt használtunk a kísérletekben meghatározottak szerint. Az optikai sűrűséget (OD) spektrofotométerrel mértük 600 nm hullámhosszon (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

többszörös szekvencia-igazítás analízis

többszörös szekvencia-igazítás (MSA) analízist végeztünk MEGA7 alkalmazásával . A fehérjeszekvenciákat a ClustalW igazította és az ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr) vizualizálta . A 3u9f , a 4cla és a 2xat fehérjeszerkezeteinek legfontosabb jellemzőit a CAT_SALTI , a CAT3_ECOLIX és a CAT4_PSEAE-ből nyertük ki.

molekuláris modellezés és dokkoló szimulációk

háromdimenziós (3D) struktúrák

a CATSa és az alkoholok 3D szerkezetét először svájci modell és Moe (Molecular Operating Environment software, version 2019.01) ‘Builder’ eszközeivel állították elő. A kettős szubsztrátummal határolt CATSa komplex (azaz acetil-CoA-izobutanol–CATSa) 3D szerkezetét úgy nyertük, hogy egy izobutanolt extraháltunk az izobutanol–CATSa komplexből, majd hozzáadtuk az acetil–CoA-CATSa komplexhez. Az összes szerkezetet a MOE ‘QuickPrep’ eszközével készítettük el alapértelmezett paraméterekkel, majd az amber10:EHT erőtér energiaminimalizálásával tovább optimalizáltuk.

dokkolási szimuláció

dokkolási szimulációk elvégzéséhez a potenciális kötési zsebet a Moe ‘Site Finder’ eszközével kerestük. A legjobban pontozott helyet , összhangban a jelentett katalitikus helyekkel, további vizsgálatokhoz választották ki. A dokkolási szimulációkat a korábban leírtak szerint hajtottuk végre . Röviden, Az acetil-CoA-t és az egyes alkoholt az indukált fit protokoll alkalmazásával dokkoltuk a háromszög Matcher elhelyezési módszerrel és a London GmbH pontozási funkcióval. A dokkolási szimulációk után a legjobban értékelt kötési pózt választottuk ki, amely a maradék és a szubsztrát közötti kritikus kölcsönhatást mutatja a gyökér-Közép-négyzet-eltérés (rmsd) < 2 ++ értéknél. Például az acetil-CoA dokkoláshoz azt a kötési pózt választottuk, amely a ser-148 hidroxilja és a CoA N71 Hidroxilja közötti hidrogénkötést mutatja . Az alkohol dokkolásához azt a kötési pózt választottuk, amely a HIS-189 N3 és az alkohol hidroxilja közötti hidrogénkötést mutatja .

In silico mutagenezis analízis

az acetil-CoA–izobutanol–CATSa komplex in silico mutagenezis analízisét a korábban leírtak szerint végeztük . Pontosabban, a MOE ‘alanin scan ‘és’ maradék scan ‘ eszközeit használták a mutagenezis potenciális maradékanyag-jelöltjeinek azonosítására.

molekuláris klónozás

Plazmidszerkezet

a plazmidokat ligázfüggő módszer és/vagy Gibson-összeállítás standard molekuláris klónozási technikájával állítottuk elő az 1.kiegészítő fájlban felsorolt primerek felhasználásával: S1 táblázat. A konstruált plazmidokat hősokk-transzformációval vezették be az E. coli TOP10-be. A szelektív lemezen izolált kolóniákat PCR szűréssel és plazmid tisztítással végeztük. A tisztított plazmidokat Sanger szekvenálással ellenőriztük, mielőtt átalakult volna E. coli BL21 (DE3). A hely által irányított mutagenezist a QuickChange alkalmazásával hajtottuk végre 6 hely által irányított mutagenezis protokoll csökkentett átfedési hosszúsággal vagy Gibson összeszerelési módszerrel . A C. thermocellum engineering, a phs005 plazmidot először megépítették, majd pHS0024-re módosították. a pHS0024-nek nincs hpt-je az operon után, míg a plazmid más szekvenciái megegyeznek a pHS005-tel.

transzformáció

a hagyományos kémiai transzformációs és elektroporációs módszereket alkalmazták az E. coli és a C. thermocellum transzformációjára. C-Re. thermocellum, a módszert azonban kissé módosítottuk az itt leírtak szerint. Először a C. thermocellum M1354-et (2.táblázat) tenyésztettük 50 mL CTFuD-NY táptalajban 50 Kb-on anaerob kamrában (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., VAGY USA). Az OD–val rendelkező sejttenyészetet 0,8-1,0 tartományban szobahőmérsékleten 20 percig hűtöttük. Ezen a ponton túl minden lépést a kamrán kívül hajtottak végre. A lehűtött sejteket 6500g és 4CC-n 20 percen át gyűjtöttük. A sejtpelleteket kétszer mossuk Jéghűtött Milli-Q vízzel, majd 200 ml 250 mM-es szacharózból és 10% (v/v) glicerinből álló transzformációs pufferben reszuszpendáljuk. Az elektrokompetens cellák több 30 6c alikvotját azonnal − 80cc-n tároltuk további felhasználás céljából. Az elektroporációhoz az elektrokompetens sejteket jégen felolvasztottuk, majd 500-1000 ng metilezett plazmidokkal inkubáltuk 10 percig. Ezután a sejteket jéghűtéses 1 mm-es gap elektroporációs küvettába (BTX Harvard apparátus, MA, USA) helyeztük át, majd két egymást követő exponenciális bomlási impulzus következett 1-gyel.8 kV, 350-25 Ft. Az impulzusok általában 7,0–8,0 ms időállandót eredményeztek. A sejteket azonnal újraszuszpendáltuk előmelegített friss CTFuD-NY-ben, és anaerob körülmények között (90% N2, 5% H2 és 5% CO2) 50 oc-on kinyertük egy gumikupakkal ellátott Balch-csőben. 0-12 óra kinyerés után a sejteket olvadt CTFuD-NY agar táptalajjal kevertük, kiegészítve 15 6G/mL tiamfenikollal. Végül a közepes sejtes keveréket petri-csészébe öntöttük, és az anaerob kamrában megszilárdultunk. A lemezt inkubáltuk 50 C-ig 1 hétig, amíg a telepek meg nem jelennek. A transzformációs hatásfok 2-100 kolóniaképző egység volt/db / db plazmid (CFU / db / db plazmid).

a CATSa és variánsainak In vivo jellemzése E. coli-ban

a CATSa és variánsainak in vivo jellemzéséhez az E. coli-ban a korábban leírtak szerint nagy sejtsűrűségű tenyészeteket végeztünk 2 g/L különböző alkoholok hozzáadásával. Az észterek in situ extrakciójához mindegyik csövet 25% (v/v) hexadekánnal fedtük le. A CATSa és variánsainak fehérjeexpressziójának igazolására 1% (v/v) törzssejtet tenyésztettünk egy éjszakán át 37 6CC és 200 rpm sebességgel 15 mL-es tenyészcsövekben, amelyek 5 mL LB táptalajt és antibiotikumot tartalmaztak. Ezután az éjszakai tenyészetek 4%-át (v/v) átvittük 1 mL lb-t tartalmazó közegbe antibiotikum egy 24 lyukú mikrolemezben. A tenyészeteket inkubáló mikrolemez–rázógéppel (Fisher Scientific, PA, USA) 37 6CC és 350 rpm sebességgel tenyésztettük, amíg az OD elérte a 0,4-0,6 értéket, majd 0-val indukáltuk.1 mM-es izopropil-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) 4 órán át, Légzéskönnyű tömítő membránnal a párolgás és a keresztszennyeződés megelőzésére (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). A fehérjemintákat a gyártó utasításai szerint B-per teljes reagenssel (cat# 89822, Thermo Scientific, MA, USA) nyertük, és SDS-PAGE-vel elemeztük.

Enzimjellemzés

His-tag Tisztítás

az enzimexpresszióhoz egy éjszakán át tartó tenyészetet egy 1:50 arány 1 mM-es IPTG-t és antibiotikumot tartalmazó friss LB-táptalajban, majd 18 db (legfeljebb 20 óra) egy éjszakán át tartó inkubálás 200 fordulat / perc sebességgel. Az indukált sejteket centrifugálással gyűjtöttük be 4CC-n és 4700cc-n 10 percig. A sejtpelletet ezután egyszer Millipore vízzel mossuk, majd a B-per teljes reagensben reszuszpendáljuk. 30 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után az elegyet 17 000 6g-on 2 percig centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtötték és nyers kivonatként jelölték meg. A HIS-tag tisztításához a nyers kivonatot hispur Ni–NTA superflow agarózzal inkubáltuk egy tételben, ahogy a gyártó javasolja. Ezután a gyantát legalább három térfogatú mosópufferrel mossuk, amely 50 mM-es trisz-HCl-t (pH 8,0), 300 mM-es NaCl-t, 10 mM-es imidazolt és 0,1 mM-es EDTA-t tartalmaz. A gyantához kötött fehérjéket 300 db 60 mM–es trisz-HCl-t (pH 8,0), 50 mM-es NaCl-t, 300 mM-es imidazolt és 0,1 mM-es EDTA-t tartalmazó eluációs pufferrel eluáltuk. Az eluált mintát ezután sótalanítottuk és egy 10 kDa molekulatömegű cut-off Amicon szűrőoszlopon keresztül koncentráltuk. Végül a fehérjemintát 200 mm–es 20 mm-es Tris-HCl pufferben szuszpendáltuk (pH 8,0). A fehérjekoncentrációt Bradford-vizsgálattal mértük, a bovin szérumalbumin (BSA) referenciafehérjével.

Hőeltolódási vizsgálat

a fehérje olvadási hőmérsékletének (TM) mérésére termofluor-vizsgálatot alkalmaztak a SYPRO Orange-val . Körülbelül 10-250 6G his-tag tisztított fehérjét összekeverünk 5 50 ml-es SYPRO Orange-val egy 96-os QPCR lemez végső térfogatában. A lemezt PCR sapkákkal lezártuk a vizsgálat lefuttatása előtt. A StepOne real-time PCR gépet (Applied Biosystems, CA, USA) használták a vizsgálat futtatásához a következő paraméterekkel: ROX reporter, ciklusonként 1 db C növekmény, 1 perc tartás minden ciklusban, és hőmérséklet-tartomány 20-98 db C. az adatokat összegyűjtöttük, exportáltuk és feldolgoztuk a Tm kiszámításához.

5,5′-ditiobisz-(2-nitrobenzoesav) (DTNB) vizsgálat

a reakciósebességet minden egyes macska esetében DTNB vizsgálattal határoztuk meg egy 384 lyukú lemezen. A reakció Össztérfogata 50 ml volt, a reakciópuffer 50 mM–es trisz-HCl-t tartalmazott (pH 8,0). Az acetil-CoA (CoALA Biosciences, TX, USA) és az alkoholok koncentrációját az egyes kísérletekben meghatározottak szerint változtattuk. A kloramfenikollal és az alkoholokkal szembeni reakciókhoz 0,05, illetve 10, 6 g/mL végső enzimkoncentrációt használtunk. A reakció kinetikáját úgy gyűjtöttük össze, hogy az abszorbanciát percenként 412 nm-en mérjük 1 órán át, 50 Kb-on mikrolemez-olvasóban (Synergy HTX mikrolemez-olvasó, BioTek). A reakciósebességet az a szabad koenzim (MP Biomedicals, OH, USA) standard görbéjéből származó kihalási együttható alkalmazásával számítottuk ki azonos körülmények között. Meg kell jegyezni, hogy mivel a lemezolvasó számára ajánlott maximális üzemi hőmérséklet 50 CA, a nagy áteresztőképességű enzimvizsgálatot magas hőmérsékleten CAT esetében csak az enzimkinetikai paraméterek meghatározására végeztük.

a reakciósebességek kinetikai paramétereinek kiszámítása

a Michaelis-Menten sebességtörvény paraméterei (Eq. 1) az egyes enzimekre az alábbiak szerint számítottuk ki. Először lineáris regressziót végeztünk egy mikrolemez-olvasóból gyűjtött adatokon a kezdeti reakciósebességek azonosításához, \(y_{i}\), különböző kezdeti szubsztrátkoncentrációkban, \(s_{i}\), ahol i = {1,2,…, n} az összegyűjtött adatpontok száma. Ezután ezek a kezdeti reakciósebességek és a kapcsolódó kezdeti szubsztrátkoncentrációk az összes ismétlésnél egyidejűleg illeszkedtek a Michaelis-Menten modellhez (Eq. 1) robusztus nemlineáris regresszió (Eq. 2) egy soft-L1-veszteség becslő (Eq. 3) a SciPy numerikus számítástechnikai könyvtár V1.2.0 végrehajtása szerint :

a legkisebb négyzetek probléma meghatározza a \(k_{\text{M}}\) és \(v_{ \text{max} }\) paramétereket azáltal, hogy minimalizálja a különbséget a modell által megjósolt reakciósebességek \(v_{i}\) és a mért reakciósebességek \(y_{i}\) (Eq. 2). A simító függvény \(\rho \ left (z\ right)\) arra szolgál, hogy a legkisebb négyzetprobléma ellenálljon a kiugró értékeknek (Eq. 3). A kiugró értékekkel szembeni elfogulatlan ellenállás és a hagyományos linearizációs módszerekből eredő hibák elkerülése miatt a robusztus nemlineáris regresszió biztosítja a Michaelis-Menten modell legpontosabb paraméterbecslését .

izobutil-acetát előállítása C. thermocellumban

Cellobióz fermentáció

az izobutil-acetát előállítása cellobiózból C. thermocellum törzsekben kétlépcsős biokonverziós konfigurációval történt. A sejteket először 5 g/L cellobiózt tartalmazó MTC minimális táptalajban tenyésztettük gumikupakkal ellátott Balch csőben, amíg az OD el nem éri a 0,8–1 értéket.0. A sejteket 20 percen át szobahőmérsékleten hűtöttük, majd 4700 db g és 4 db C 20 percen keresztül centrifugáltuk. A felülúszó eltávolítása után a sejteket ugyanolyan térfogatú, 2 g/L izobutanolt tartalmazó friss MTC minimális táptalajban reszuszpendáltuk anaerob kamrában. A sejtszuszpenziót ezután 800 6L-re osztottuk egy 2,0 mL-es csavaros kupakkal ellátott mikrocentrifugacsőben, 200 ml-es hexadekán borítással. A sejteket 55cc-n inkubáltuk 24 órán át, majd gázkromatográfiát végeztünk tömegspektrométerrel (GC/MS) párosítva, hogy meghatározzuk az előállított izobutil-acetát mennyiségét.

cellulóz fermentáció

a cellulóz fermentációhoz módosított MTC táptalajt (C-MTC táptalajt) használtunk. A cellobióz helyett 20 g/L Avicel PH-101-et használtak egyedüli szénforrásként, és 10 g / L mop-ot adtak hozzá a pufferkapacitás növelése érdekében. A kezdeti pH-t 7,5 x 5 m KOH-ra állítottuk be és autoklávoztuk. Anaerob kamrában 0,8 mL éjszakai sejttenyészetet oltottunk be 15,2 mL C-MTC táptalajba (1:20 oltási arány) 4 mL ráhelyezett hexadekánnal. Mindegyik cső tartalmazott egy kis mágneses keverőrudat a cellulóz homogenizálására. A gumikupakkal ellátott Balch-csövet egy 55 6c hőmérsékleten beállított hőmérséklet-szabályozóval és mágneses keverőrendszerrel összekapcsolt vízfürdőben inkubáltuk. A pH-beállítást követően 70 6 m-es Koh-injekcióval 800 ml sejttenyészetből és 200 ml hexadekánrétegből mintát vettünk 12 óránként. a tenyészet pH–értékét a fermentáció során 6,4-7,8 tartományban tartottuk.

a sejtek növekedését pellet fehérje mérésével figyelték meg. A 800 MHz–es mintavételi térfogatból származó sejt-cellulóz pelletet Milli-Q vízzel kétszer megmossuk, majd 200 ml lízis pufferrel szuszpendáljuk (0.2 M NaOH, 1% SDS), majd egy órás inkubálás szobahőmérsékleten. Ezután az oldatot 50 6L 0,8 M HCl-lel semlegesítettük, majd 550 ml vízzel hígítottuk. Az elegyet 17.000 Ft-on centrifugáltuk 3 percig. A felülúszó fehérje koncentrációját a mosószerrel kompatibilis Bradford assay (Thermo Scientific, WA, USA) elemezte. A maradék pelletet egy órán át 98 db C-os kemencében forraltuk, mielőtt a maradék cellulózt számszerűsítettük volna.

a maradék cellulóz mennyiségét fenol–kénsav módszerrel határoztuk meg, néhány módosítással. A felforralt mintát Milli-Q vízzel kétszer megmossuk, majd 800 MHz-es vízben szuszpendáljuk, hogy az eredetivel egyenértékű térfogatot kapjunk. A mintát 10 másodpercig pipettázással és örvényléssel homogenizáltuk, majd a homogenizált mintából 20 ml-t egy új, 2,0 mL-es mikrocentrifuga csőbe vagy 96 lyukú lemezre helyeztünk, és egy éjszakán át szárítottuk egy 55 KB-os kemencében. A szárított pelletet 200 db 95% – os kénsavban szuszpendáltuk, majd szobahőmérsékleten egy órán át inkubáltuk. Miután a pelletet teljesen feloldottuk, 20 db 5% – os fenolt adtunk hozzá, majd a kénsavoldattal elegyítettük. 30 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után a minta 100 MHz-ét egy új, 96 lyukú lemezre helyeztük át, majd 490 nm-en mértük az abszorbanciát. Az abszorbanciát ugyanezzel az eljárással kezelt Avicel PH-101 standard görbéjével alakítottuk át cellulózkoncentrációvá.

analitikai módszerek

nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC)

az extracelluláris metabolitokat nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) rendszerrel (Shimadzu Inc., MD, USA). 800 6L tenyészetmintát centrifugáltunk 17 000 g-on 3 percig, majd a felülúszókat 0,2 mm-es szűrőkön szűrtük át, és 10 mN H2SO4 mozgófázissal 0,6 mL / perc sebességgel futtattuk egy Aminex HPX-87H-N (Biorad Inc., CA, USA) oszlop 50 db C. törésmutató-detektort (rid) és ultraibolya detektort (UVD) használtak 220 nm-en a cukrok, szerves savak és alkoholok koncentrációjának megfigyelésére.

Gázkromatográfiát tömegspektroszkópiával (GC/MS)

észtereket mértünk MS-vel felszerelt GC-vel (HP 6890, Agilent, CA, USA) (HP 5973, Agilent, CA, USA). A GC rendszer esetében a zebron ZB-5 (Fenomenex, CA, USA) kapilláris oszlopot (30 m! 0,25 mm! 0,25!!!!!!!!!!!) használtuk az analitok elválasztására, és hordozóként héliumot használtunk 0,5 mL/perc áramlási sebességgel. A sütő hőmérséklete program az alábbiak szerint: 50 °C kezdeti hőmérséklet 1 °C/min földi akár 58 °C, 25 °C/min földi akár 235 °C, 50 °C/min rámpa legfeljebb 300 °C, 2-min sütni-ki-a 300 °C 1 µL a mintában szereplő hexadecane réteg volt fecskendeznek az oszlop a splitless módban egy injektor hőmérséklet 280 °C. Az MS rendszer esetében kiválasztott ionmódot (SIM) alkalmaztak az észterek kimutatására és mennyiségi meghatározására a következő paraméterekkel: (i) etil-acetát, m/z 45,00 és 61,00 4,2-4,6 perc retenciós idő (RT), (ii) izopropil-acetát, m/z 45 és 102 4,7-5,0 perc RT, (iii) propil-acetát, m/z 59 és 73 5,2-5,8 perc RT, (iv) etil-izobutirát, m/z 73 és 116 6,1-6,6 perc rt, (v) izobutil-acetát, m/z 61 és 101 6,6-7,6 perc rt, (vi) butil-acetát, M/Z 61 és 116 7,7-9,2 perc rt, (VII) izobutil-izobutirát, m/z 89 és 129 10,1-12.5 perc RT, (viii) benzil-acetát, m/z 108 és 150 13,1-13,8 perc RT, és (ix) 2-fenetil-acetát, m/z 104 és 121 13,8-15,5 perc RT. izoamil-alkoholt és izoamil-acetátot használtunk belső standard analitként. Az észtereket RT-vel azonosítottuk, és a csúcsterületek és a standard görbék alapján számszerűsítettük. A Standard görbéket hexadekánra hígított tiszta észterek alkalmazásával határoztuk meg 0,01 g/L, 0,05 g/L, 0,1 g/L, 0,5 g/L és 1 g/l koncentrációban.