ClpP proteáz aktiválás eredménye az átszervezés az elektrosztatikus kölcsönhatás hálózatok a bejáratnál pórusok

kötési mód az ACP1 EcClpP

hogy tisztázza a szerkezeti alapja ClpP aktiválás ACP128, struktúrák NmClpP és EcClpP (ábra. 1a) komplexben ACP1 analógokkal kerestük. Míg az nmclpp kötött ACP1-es szerkezetét ismételt kísérletek ellenére nem sikerült elérni, az EcClpP+ACP1-06 komplex szerkezetét 1,9-re határoztuk meg. 1b, c, 1. táblázat), amely egy tetradekamert tartalmaz az aszimmetrikus egységben (a-N láncok). Az ecclpp axiális hurkait alkotó N-terminális maradékok elektronsűrűsége egy alegység (B lánc) kivételével nem egyértelmű. A korábban publikált struktúrákban ezek az axiális hurkok nagyon rugalmasak, és általában rendezetlenek a kristályban aktivátorok hiányában vagy a kristálycsomagolás kizárásának23. Egyértelmű elektronsűrűséget figyeltek meg egyetlen ACP1-06 molekulánál a D és E alegységek által alkotott zsebben, amely a vegyület két különböző konfigurációját mutatja (ábra. 2a, b). Mindkét konfigurációt az elektronsűrűségben modelleztük, amelyben az első konfiguráció a vegyület trifluor-metil-piridin részét hidrofób zsebben helyezi el (lefelé konfiguráció), míg a második az oldószernek kitett hidrofób zsebből (felfelé konfiguráció) (ábra. 2a). A fennmaradó 13 hidrofób zseb kétértelmű elektronsűrűséget mutat az ACP1-06 esetében. Mind a 14 ACP1-06 molekulát modelleztük és finomítottuk mind a fel, mind a Le konfigurációban 0,5-es kihasználtsággal, ami minden ligandum esetében javított elektronsűrűséget eredményezett.

az ACP1-06 kötési módjai (ábra. 2B-d) közelítse meg a különböző bakteriális Clpp-k kristályszerkezeteiben megfigyelt Adep-eket (ábra. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Megjegyezzük, hogy a csoportunk által szintetizált vegyületek ACP1-YY és ADEP-YY számozottak, míg a más csoportok által végzett vizsgálatokból származó vegyületek megnevezése a megfelelő publikált cikkekben található. Az ACP1-06-tal való Összes protein-érintkezés nem poláros jellegű, kivéve két figyelemre méltó elektrosztatikus kötést, amelyek (1) Az Y76 fenolos hidroxil oldallánca és az ACP1-06 amid-oxigénje, és (2) az R206 guanidinil oldallánca (az EcClpP-ben az utolsó előtti Arg) és az ACP1-06 szulfonil-oxigénje között fordulnak elő (ábra. 2b). Az utóbbi két kölcsönhatás az ACP1-06 mindkét konfigurációjában jelen van. Ezenkívül az R206 (e lánc) egy szomszédos alegység (D lánc) E65-tel való Ionos kötésével stabilizálódik (ábra. 3a, b).

a lefelé konfigurációban az ACP1-06 trifluor-metil-piridin része egy hidrofób üreget foglal el, amelyet az L62, T93 és F96 (D lánc), valamint az Y74, Y76, I104, L203 és L128 (e lánc) alkot (ábra. 2b és 3b). Ez ugyanaz az üreg, amelyet a különböző ADEP analógok clpp-vel kristályosított exociklusos Phe maradékának gyűrűje foglal el, például az NmClpP + ADEP-0419-ben (ábra. 2e, f) vagy az EcClpP+ADEP1 struktúrák40 (ábra. 2c, d). Ezzel szemben az up konfigurációban a trifluor–metil-piridin rész a C-S kötés körül forog, és oldószernek van kitéve, miközben van der Waals érintkezésbe kerül az Y74, I104, F126 és L203 (e lánc) (ábra. 2b és 3b). A drágakő-dimetil-rész az Y74 (e lánc) lapos gyűrűjéhez halmozódik, míg a meghosszabbított alifás lánc Orto-klór-szubsztituált fenilgyűrűvel végződik, nem poláros horonyban ül a szomszédos alegységek két spirálja között (ábra. 3b). Ezt a kötési hasadékot az L62 (D lánc), az F63 (D lánc), az A66 (D lánc), az L37 (E lánc), a V42 (E Lánc) és az E40 (e lánc) nem poláros része képezi (ábra. 2b és 3b).

az EcClpP mind az ACP1-06, mind az ADEP1 – hez kötött szerkezeteiben megtalálható az R36 és az E40 közötti intrasubunit sóhíd, ahol az ADEP1 közeli alifás farka vagy az ACP1-06 klórral szubsztituált fenilgyűrűje hidrofób kölcsönhatást képez az E40 oldalláncával (ábra. 3b, c). A két aktivátort a hidrofób helyen két különálló hidrogénkötési minta stabilizálja tovább. Míg az ACP1-06 A szulfonilcsoportja és a C-terminális R206 maradék közötti oldószernek kitett Ionos kölcsönhatás révén biztosított (ábra. 3B), az ADEP1-et két hidrogénkötés tartja a helyén az Y76 hidroxilcsoportjával, amely a hidrofób helyen van elzárva (ábra. 3c). Az oldószer által közvetített hidrogénkötés az E65 és az ADEP1 n-Acil Phe oldalláncának karbonilcsoportja között tovább erősíti az EcClpP-vel való kölcsönhatását (ábra. 3c). Ez az extra hidrogénkötés, valamint a ciklikus depszipeptidgyűrű nagyobb mérete, amelynek nagyobb felülete van der Waals kölcsönhatásokat képez az ACP1 kisebb trifluor-metil-piridin csoportjához képest, az Adep-knél általában szigorúbb kötődést eredményezhet, mint az ACP1s28.

az EcClpP + ACP1-06 szerkezetben megmagyarázhatatlan elektronsűrűséget találtunk mind a 14 alegységben, amely a katalitikus triád S111 nukleofil maradékából származik, ami kovalens módosításra utal (kiegészítő ábra. 1a, b). A sűrűség körülbelül derékszögben, az S111 oldalláncoktól ellentétes irányban terjed. A kiterjedt erőfeszítések ellenére nem lehetett meggyőzően felszerelni peptidekkel, Acil-keton termékekkel vagy különféle ismert szerin proteáz inhibitor molekulákkal.

az ADEP kötési módja az NmClpP-hez

az NmClpP-nek rövidebb a pro-szekvenciája az N-terminálisnál, míg a C-terminálisnál négy extra maradék van az EcClpP-hez képest (ábra. 1a). Bár az NmClpP-t N-terminális His6-tag-et hordozó teljes hosszúságú fehérjeként fejeztük ki, ismételten megfigyeltük a ni-nitrilotriecetsav gyantához való kötődés hiányát. A tisztított fehérje N-terminális szekvenálása során kiderült, hogy az érett NmClpP az Y6 maradéknál kezdődik (ábra. 1a), jelezve az autoproteolízist, hogy felszabadítsa N-terminális pro-szekvenciáját (1MSFDN5).

korábban meghatároztuk az NMCLPP szerkezetét az ADEP-0419-vel. Ebben a tanulmányban meghatároztuk az apo-NmClpP szerkezetét 2,0-re, az NmClpP-t pedig kötött ADEP-14-re 2,7-re (ábra. 1b, c, kiegészítő ábra. 1c, 1. táblázat). Az Apo-NmClpP szerkezete az aszimmetrikus egységben tetradekamert tartalmaz, és a 14 N-terminális axiális hurok egyikére sem mutat egyértelmű sűrűséget. Gyenge elektronsűrűség figyelhető meg a g133-G137 maradékok által alkotott hurkoknál a fogantyú tartományának 68 szálában (ábra. 1a). Az nmclpp+ADEP-14 kristály aszimmetrikus egysége két tetradekamert tartalmaz (kiegészítő ábra. 1d). A kristálycsomagolás miatt nem figyeltek meg elektronsűrűséget az 1-22 maradék mind a 28 alegység esetében (ábra. 1C, kiegészítő ábra. 1d). Ezen túlmenően, a 68-szál (maradékok 130-137; ábra. 1a) csak részben látható az összes alegységben. Az ADEP-14 az NMCLPP-hez hasonló konfigurációban van kötve, mint az ADEP-04 (ábra. 2e, f és 3e, f). Röviden, Az ADEP-14 difluor-fenil része egy hidrofób zsebet foglal el, amelyet egy alegység Y67, L95, L97 és L119, valamint egy szomszédos alegység V49, L53, T84 és F87 alkot (ábra. 3e). A pipekolsav-rész hattagú gyűrűje oldószernek van kitéve, és az F117 fenilgyűrűje és az L97, L119 és L196 hidrofób oldalláncai stabilizálják (ábra. 3e). A további metil-szubsztitúció a depszipeptid gyűrű allo-treonin maradékán (ábra. 1b) oldószernek van kitéve. Az ADEP-04-hez hasonlóan az ADEP-14-et az erősen komplementer hidrofób zsebben két hidrogénkötési kölcsönhatás biztosítja az Y67 fenolos hidroxilcsoportja, a difluor-fenilalanin maradék aminocsoportja és az alanin-karbonilcsoport között a depszipeptidgyűrűben, valamint az oldószer által közvetített hidrogénkötés az E56-Tal (ábra. 3e, f). Az adep-14 oktadiénsav oldallánca az egyik alegység L53, F54 és S57, valamint a szomszédos alegység R27, L28, E31, I33, F35 és Y67 által alkotott keskeny hidrofób csatornában helyezkedik el (ábra. 3e).

az ACP1 – és az ADEP-kötés különböző alloszterikus hatásokat eredményez a ClpP hordó

az ecclpp és az NmClpP apo – és vegyületkötésű formáinak struktúráit alkalmazva (ábra. 1c), megvizsgáltuk az aktivátor kötésekor fellépő alloszterikus hatásokat. Amint azt a kiegészítő ábra mutatja. 2, az aktivátorkötés ékként működik, ami két szomszédos alegység oldalirányú elmozdulását okozza. Az ACP1-06 kötés által okozott globális konformációs változás mértéke (rmsd = 0,84 ons az apo-EcClpP-hez viszonyítva) hasonló az ADEP-04-hez (rmsd = 0).Az apo-NmClpP-hez képest 73 (az Apo-NmClpP-hez viszonyítva), de kevesebb, mint az ADEP-14-hez képest (az rmsd = 2,47 (az apo-NmClpP-hez viszonyítva). Érdekes módon az elmozdulás iránya eltér az aktivátorok két osztálya között (kiegészítő ábra. 2 és kiegészítő Filmek 1-4). A két Adep között az ADEP-14 nagyobb általános szerkezeti zavart okoz az NmClpP hengerben (hasonlítsa össze a kiegészítő filmeket 3 vs.4). Az ADEP-kötés az nmclpp apikális felületének tágulását eredményezi, amelyet az egyenlítői régió szűkülete kísér. Ennek a mozgásnak a forgása az AE hélixből és a 68 szálból álló fogantyútartományban van. Ez a jelenség minden eddig ismert Adep-kötésű ClpP-szerkezetben megfigyelhető,a ClpP-henger 15,18,19,23, 40 különböző mértékű tömörítésével. Ezzel szemben az ACP1-06 Az EcClpP-hez való kötődés az összes alegység befelé irányuló mozgását okozza, ami a ClpP henger meghúzását eredményezi (1.Kiegészítő film). Így a struktúrák azt mutatják, hogy az ACP1s és az ADEPs aktiválja a ClpP-t különböző alloszterikus hatások indukálásával.

az aktivátorhoz kötött EcClpP és NmClpP szerkezetekben a gyűrű-gyűrű interfész elektrosztatikus kötései, amelyek stabilizálják a tetradekamert, a konformációs változások ellenére megmaradnak (kiegészítő ábra. 3). Sőt, az aktivátorkötéskor bekövetkező globális szerkezeti változás ellenére az EcClpP és az NmClpP ser-His-Asp katalitikus triádjai katalitikusan Kompetens geometriákat tartanak fenn, mivel az aktív hely közelében csak kisebb Ca gerinceltolódások fordulnak elő (kiegészítő ábra. 1a-c). A ClpP összes létező ACP1 – és ADEP-kötött szerkezetének elemzése azt mutatja, hogy a vegyületkötés az egyenlítői régió összehúzódását is eredményezi (kiegészítő ábra. 4).

számszerűsítettük a ClpP henger tömörödését ACP1 vagy ADEP kötéskor a megfelelő katalitikus kamrák térfogatának mérésével (kiegészítő ábra. 4). Az ACP1-06 kötés ~5%-kal csökkenti a katalitikus kamra térfogatát az apo-EcClpP-hez képest. ADEP1-az EcClpP-hez való kötődés a katalitikus kamra térfogatának hasonló csökkenését eredményezi. Ez megfigyelhető más aktivátorhoz kötött ClpP struktúrák esetében is, mint például az ADEP-14-hez kötött NmClpP, az ADEP-hez kötött BsClpP és az ADEP-hez kötött MtClpP1P2 heterooligomer komplex (kiegészítő ábra. 4).

a ClpP aktiválása az elektrosztatikus kötési hálózat átszervezését eredményezi az axiális pórusoknál

az apo-NmClpP szerkezetében két elektrosztatikus kötés az axiális pórus közelében stabilizálja bármely két szomszédos alegység interfészét (ábra. 3D, kiegészítő ábra. 5). Először is, az egyik alegység negatív töltésű E58 karboxilátcsoportja ionpárt képez a szomszédos alegység pozitív töltésű R27 guanidinium csoportjával. Másodszor, két szomszédos alegység S57 hidroxil-és E31 karboxilátcsoportjai hidrogénkötést képeznek. ADEP kötéskor ez a két nem kovalens kötés megszakad, míg az ugyanazon alegység R27 és E31 közötti Ionos kötése lerövidül, azaz megerősödik (ábra. 3e, f). Az apo-EcClpP-ben az E67 és az R36 között csak egy ionos kötés köt össze két szomszédos alegységet, mivel az NmClpP S57-Tel egyenértékű maradéka egy alanin az EcClpP-ben, és így nem képes hidrogénkötést kialakítani az E40-gyel (ábra. 3a). Az NmClpP-hez hasonlóan az ACP1 vagy az ADEP1 EcClpP-hez való kötése megszünteti az E67-R36 ionos kötést, és erősebb intrasubunit ionos kötést eredményez az R36 és az E40 között (ábra. 3b, c, kiegészítő ábra. 5).

ezen megfigyelések további igazolására nmclpp és EcClpP pontmutánsokat terveztünk, amelyek a fenti interszubunit elektrosztatikus kötések elvesztéséhez vezetnek. Amint az ábrán látható. 4a, míg a WT NmClpP nem tudta lebontani a fehérje kazeint, az NmClpP E58A mutáns nagyobb sebességgel bontja le a kazeint, mint az E31A mutáns. Fontos, hogy az e31a + E58A kettős mutáns aktivitása még nagyobb volt, mint az egyes mutánsoké. A kettős mutáns NmClpP aktiválódásának mértéke hasonló ahhoz, amelyet 1 db adep vagy 10 db acp1 jelenlétében figyeltek meg (ábra. 4a). Hasonló viselkedést figyeltek meg az EcClpP hasonló mutációkkal (E40A és E67A; ábra. 4b). Az adott EcClpP kettős mutáns nem oldható és nem vizsgálható.

ezt követően meghatároztuk az NmClpP E58A és az NMCLPP E31A + E58A mutánsok Röntgenszerkezetét (1.táblázat). A katalitikus helyek mindkét mutánsban nem zavarnak (kiegészítő ábra. 1e). Az nmclpp e58a egyetlen mutánsban a mutáció megszünteti az E58–R27 ionos kötést, és erősebb intrasubunit R27-E31 kölcsönhatást eredményez, míg az S57 és az E31 közötti hidrogénkötés megmarad (ábra. 4c). Hasonló “ékhatás” figyelhető meg tehát a szerkezetben, amint azt az nmclpp mutáns Ca gerincének finom globális konformációs változása is mutatja (rmsd = 0,33 MHz a WT NmClpP-hez viszonyítva) (kiegészítő film 5). Mind az E31, mind az E58 alaninná történő mutációja a kettős mutáns nmclpp E31A + E58A (rmsd = 0,29 Anavar a WT NmClpP–hez viszonyítva) megszünteti a két stabilizáló interszubunit elektrosztatikus kölcsönhatást, valamint az nmclpp e58a egyetlen mutánsban jelen lévő R27-E31 intrasubunit ionos kötést (ábra. 4d és kiegészítő Film 6) és az ADEP-hez kötött NmClpP-ben (ábra. 3e, f). Így az NMCLPP E31A + E58A kettős mutáns ellentétben áll az adep-hez kötött NmClpP-vel az eliminált intrasubunit ionos kötéssel, de ennek ellenére aktivált fehérje, amelynek belső proteolitikus aktivitása összehasonlítható a kis molekulájú aktivált ClpP-vel (ábra. 4a). Az ADEP-hez kötött NmClpP-hez hasonlóan mind az nmclpp egy -, mind a kettős mutánsoknak csökkent a katalitikus kamra térfogata a ClpP hordó tömörítése miatt (kiegészítő ábra. 4).

a kötési hálózat ilyen átszervezése megfigyelhető az EKT-ben rendelkezésre álló összes aktivált ClpP-struktúra esetében, akár kis molekulájú aktivátorok jelenlétében, akár specifikus mutációk miatt (kiegészítő ábra. 6). Például a B. subtilis ClpP-hez (BsClpP), az S. aureus ClpP-hez (Saclpp), az M. tuberculosis ClpP-hez (MtClpP) és a Homo sapiens ClpP-hez (Hsclpp) kötődő kis molekulájú aktivátorok megszüntetnek egy vagy két interszubunit elektrosztatikus kötést az axiális pórus közelében, és erősebb, intrasubunit Ionos kölcsönhatást eredményeznek (kiegészítő ábra. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. Az MtClpP2-ben az nmclpp–ben az E58-R27 kölcsönhatásnak megfelelő interszubunit ionos kötés nem létezik18. Az Nmclpp E58 ekvivalens szermaradéka L66 az MtClpP2-ben, és nem képes részt venni az MtClpP2 K35-Tel (egyenértékű az NmClpP R27-tel) való Ionos kölcsönhatásban. Ehelyett az S65 és az E39 közötti részegység közötti hidrogénkötés stabilizálja az interfészt (kiegészítő ábra. 6g, h). Az MtClpP2-hez való ADEP kötés megszakítja az S65–E39 hidrogénkötést, és erősíti a K35 és az E3918 közötti intrasubunit ionos kötést.

érdekes módon még az aktivált SACLPP Y63A variáns41, a hidrofób hely közepén található aktiváló mutációval, és ezért nem egyenértékű az itt bemutatott nmclpp aktiváló mutációival, támogatja a hidrogénkötő hálózat átszervezésének javasolt modelljét az axiális pórus körül a ClpP aktiválásakor (kiegészítő ábra. 6f). A saclpp Y63A mutáns szerkezetében az intersubunit ionpár (Q54–R23) közötti távolság megnő, míg az intrasubunit sóhíd (R23–D27) erősödik (kiegészítő ábra. 6d, f). Létrehoztuk az ekvivalens Y63A mutációt mind az EcClpP – ben, mind az NmClpP-ben. Az NmClpP Y67A mutáns oldhatatlan volt, míg az EcClpP Y76A aktivitása valamivel magasabb volt, mint az E40A mutánsé, de alacsonyabb, mint az E67A mutánsé (ábra. 4b).

a ClpP aktiválása az N-terminális axiális hurkok szerkezeti heterogenitásának csökkenését eredményezi

amint azt a fentiekben tárgyaltuk, az nmclpp+ADEP-04 komplex rendezett axiális hurokjában, amely a 6-1–2 hajtűfordulatot képezi, az ADEP kötés R27-et szabadít fel az E58-mal való interszubunit Ionos kötésből, és erősíti az aA spirál E31-jével az intraszubunit Ionos kötését (ábra. 5a). Következésképpen R27 ionos kötést képez D-vel23 az axiális hurok 6.szálának. Ez a stabilizáló kölcsönhatás a ClpP összes aktivátorhoz kötött szerkezetében megfigyelhető, ahol az axiális hurkok rendeződnek (ábra. 5a-e).

az EcClpP+ACP1-06 szerkezet esetében az axiális hurkok (14-31 maradványok) részben a kristályban vannak rendezve, csak 1 A 14 axiális hurokból, amelyek a 6-1–2 hajtűfordulatot alkotják (ábra. 1c-úgy tűnik, hogy a teljes megrendelést részben megakadályozzák a kristálycsomagolási hatások). Az a alegység rendezett axiális hurokjában az R36 felszabadulása az alegység közötti Ionos kötésből az E67-rel lehetővé teszi, hogy erősebb intrasubunit ionos kötést képezzen az aA spirál E40-jével (ábra. 5f). Azonban nincs stabilizáló Ionos kölcsönhatás között E22 a szál a 6. és R36 a hélix aA, valószínűleg a részleges rendezés (ábra. 5f). Egy további hidrogénkötés a D32 az a-2 szál és az S21 a hélix aA rögzíti az axiális hurok az EcClpP mag domén (ábra. 5f). Hasonlóképpen, az Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4 szerkezetben az axiális hurkok csak részben vannak rendezve21. Az aA hélix Arg-maradéka és a 6-1. szál negatív töltésű maradéka közötti konzervált hidrogénkötés nem látható a részlegesen rendezett EfClpP axiális hurkokban, bár az EfClpP-nek van potenciális hidrogénkötésképző szermaradéka a 6-1.szálon (T6), valamint a 6-1. és a 2. szálon (E9, Q10, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

a konzervált elektrosztatikus kölcsönhatások mellett a clpp fejdoménnel való kiterjedt hidrofób érintkezések stabilizálják az axiális hurkokat. Az ecclpp+ACP1-06-ban a nem poláros N-terminális maradványok az a-1 szálból és az azt megelőző strukturált tekercsből hidrofób kölcsönhatásban vesznek részt ugyanazon alegység aA hélixének nem poláros maradékaival, valamint egy szomszédos alegység aA’ és aB’ hélixeinek hidrofób felületein (kiegészítő ábra. 7a). Az aA, aB’, és a 6 ‘ hélixeken lévő nempoláris maradványok folyamatos hidrofób tapaszt képeznek az axiális pórus kerületén (kiegészítő ábra. 7b) 15.

ahhoz, hogy tisztább képet kapjunk a ClpP axiális hurkok konformációs heterogenitásáról, metil-TROSY NMR kísérleteket végeztünk. Kezdetben egyetlen cisztein mutációt vezettek be az nmclpp(T10C) axiális hurkaiba. Egyenletesen deuterált fehérjét állítottunk elő, majd 13C-metil-metántioszulfonáttal (MMTS) reagáltattuk. Ennek eredményeként egyetlen NMR látható 13ch3–s csoport kapcsolódik a cisztein oldallánchoz, ami S-metiltio-cisztein (MTC) maradék képződéséhez42. Ez a módszer megkönnyíti az oldatban lévő nagy komplexek szerkezetének és dinamikájának nyomon követését. A csatolt spin-szonda NMR-korrelációinak monitorozása az enzim szabad, aktivátorhoz kötött vagy mutált formáiban biztosítja az axiális pórusok oldatkonformációjának leolvasását.

kezdetben kontroll kísérleteket végeztünk annak biztosítására, hogy a T10MTC rész bevezetése ne zavarja az NmClpP szerkezetét. Röviden, 1H-13C heteronukleáris többszörös kvantum koherencia (hmqc) összefüggések a WT és T10MTC nmclpp jelölt 13ch3 az oldallánc ILVM maradékok egy egyébként teljesen deuterált háttér összehasonlítottuk, és megállapította, hogy gyakorlatilag azonos. Ezt követően az NmClpP T10MTC 1H-13C HMQC korrelációit különböző állapotokban kaptuk (ábra. 6a). Az apo-forma (kék kontúrok) nagyszámú korrelációval rendelkezik, ami szerkezetileg heterogén axiális hurkokat jelez. Az ADEP-28 kétszeres moláris feleslegének hozzáadása (az ábrán megadott aktivitás. 4a) a monomer ClpP felett jelentősen csökkentette a korrelációk számát (piros kontúrok), ami a merevítésre vagy a szerkezeti rendezésre utal. Ezzel szemben az ACP1-17 kötés (kétszeres moláris felesleg a monomer ClpP felett; ábrán megadott aktivitás. 4a) nem észlelhető változásokat eredményez a megfigyelt korrelációkban (zöld kontúrok), ami azt jelenti, hogy az axiális hurkok nincsenek hatással.

ezt a megközelítést a mutációk aktiválásának hatásának megfigyelésére is felhasználták (ábra. 4a, b) az axiális hurkokon. Ezekben a kísérletekben az aktiváló mutációkat a t10c (címkézés) mutáció hátterében vezettük be. Amint az ábrán látható. 6a, az NmClpP T10MTC/E31A mutáns (piros kontúrok) korrelációi valamivel kevésbé heterogének, mint a pszeudo WT forma, míg az NmClpP T10MTC/E58A mutáns (narancssárga kontúrok) korrelációi gyakorlatilag változatlanok. A két aktiváló mutáció egyidejű jelenléte (NmClpP T10MTC / E31A + E58A) sokkal drámaibb hatást fejt ki, mint az egyes mutációk, és eltávolítja az axiális hurkoknak megfelelő nagyszámú korrelációt (fekete kontúrok). Ez összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy a kettős mutáns aktívabb, mint az egyes mutánsok (ábra. 4a).

a ClpP aktiválása a fogantyú régió konformációs heterogenitásának csökkenését eredményezi

ugyanezt az NMR-alapú megközelítést alkalmazták az aktivátor kötésének és mutációinak a fogantyú régióra gyakorolt hatásának vizsgálatára. Az NmClpP I144MTC (helix aE) mutánsát az NMR apo-, ADEP-28-és ACP1-17-kötött formában készítette és tanulmányozta. Az apo-forma (kék kontúrok, ábra. 6a) mutat egy pár csúcsot, jelezve, hogy a fogantyú régiója egy pár egymás mellett létező konformációhoz kapcsolódik, amint azt az EcClpP4-ről szóló korábbi munkánkban láttuk. Érdekes módon az ACP1 és az ADEP hozzáadása az egyik csúcs eltűnéséhez vezet. Tekintettel arra, hogy az aktivátor kötőhelye disztális az NMR spin szondától, úgy tűnik, hogy az ACP1 vagy az ADEP kötés alloszterikusan választja ki a fogantyú tartományának egyik konformációját. Alternatív megoldásként az aktivátorok képesek lehetnek mindkét formát megkötni, de változást idézhetnek elő egyetlen állapotba.

mágnesezési csere kísérletek keverési késleltetési periódusokkal 100, 200, 300, 400, 500, és 600 ms 40C-nél nem volt képes kimutatni a WT NmClpP nyéltartományában megfigyelt konformerek közötti interkonverziót. Ez azt jelzi, hogy a cserefolyamat túl lassú az NMR általi jellemzéshez.

a SAXS kimutatja az aktivátor által indukált ClpP konformációs változásokat az oldatban

az oligomer állapot és a szerkezeti változások további vizsgálatára a vegyületkötéskor az apo-NmClpP és az NmClpP+ADEP-04 mintákat a saxs jellemezte (ábra. 6b – G és kiegészítő ábra. 8). Végső egyesített görbék ábrán látható. 6B, a kapott saxs profilok pedig az üreges szerkezetekéhez hasonlítottak43. Nem találtak jelentős változást az Általános hajtogatás szempontjából (kiegészítő ábra. 8), a gyration sugara (Rg) és az oligomer állapot, amikor az ADEP-04-et hozzáadtuk az NmClpP-hez (kiegészítő ábra. 8c). Az NmClpP saxs profilok további elemzéséhez és az Ab Initio struktúrák létrehozásához a Gnom programot használták a P(r) páros távolságelosztó függvények felépítéséhez. Az Apo-NmClpP p (r) finom jobb eltolást és nagyobb maximális méretet (Dmax) mutatott az ADEP-04-hez kötött NmClpP-hez képest (ábra. 6c és kiegészítő ábra. 8c). Ezt követően dummy atom modelleket (gátakat) állítottak elő a SAXS adatok felhasználásával az NmClpP megoldási struktúrák vizuális elemzésére (ábra. 6d-g). Tíz modell készült az apo-NmClpP és az ADEP-04-hez kötött NmClpP-hez, és a legvalószínűbbeket választották ki. Ezek a modellek azt mutatták, hogy összességében a két NmClpP oldatszerkezet hasonló (üreges hengerek). A megfelelő kristályszerkezetekkel való egymásra helyezéskor azonban könnyen megfigyelhetők voltak a nagy felbontású struktúrákkal megegyező különbségek (ábra. 6d, e). Az apo – és ADEP-04-kötésű NmClpP-k esetében mind a tíz gát axiális magasságának mérése 93,0 6,4-es apo-és 103,5 6,1-es Adep-04-es kötésű apo-formára vonatkozó értéket eredményezett. Hogy tovább erősítse ezt a megfigyelést, átlagolt gátak valószínűségi térképek és a legmagasabb DAs kihasználtsági térképek (ábra. 6f, g) elemezték. Az axiális magasságok az ADEP-04-hez kötött NmClpP-hez képest körülbelül 10 Ft-os növekedést mutattak Apo-NmClpP. Ezenkívül az ADEP-04-hez kötött NmClpP nagyobb axiális pórus kerületet mutatott, mint az apo-NmClpP (ábra. 6f, g). Így a saxs technika alacsony felbontása ellenére az eredmények azt sugallják, hogy az ADEP-04 kötődése az NmClpP-hez nem befolyásolja az nmclpp oligomer állapotát, hanem az axiális pórusok tágulását és az nmclpp+ADEP-04 gát felső és alsó részének megnövekedett kihasználtságát okozza (ábra. 6e, g) az apo-NmClpP-hez képest. Ez valószínűleg tükrözi azokat a konformációs változásokat, amelyek az Nmclpp N-terminális axiális hurkainak szerkezetének röntgen és NMR által megfigyelt heterogenitásának csökkenéséhez vezetnek.