ciszplatin ototoxicitás citokineket és STAT6 jelátviteli hálózatot foglal magában

reagensek

ciszplatint és 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-Il)-2, 5-difenil-tetrazolium-bromidot (MTT) vásároltak a Sigma Chemical Co-tól (Sigma, St Louis, MO, USA). A műanyag tenyésztési anyagokat a Becton Dickinson and Company-tól (Franklin Lakes, NJ, USA) vásárolták. A Dulbecco módosított esszenciális táptalaját (DMEM), magzati szarvasmarha szérumot (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) és más szövettenyészeti reagenseket a Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Rekombináns egér IL-4 és IL-13 proteint, IL-4, IL-13, TNF -, IL-1 -, IL-6-elleni antitesteket és enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (Elisa) készleteket (QuantikineR) vásároltak citokinekre az R&D Systems Inc. – től. (Minneapolis, MN, USA). Ezeket az antitesteket immunhisztokémiához 1:200 koncentrációban használtuk. A P-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) és IkB elleni antitesteket a Santa Cruz Biotech Inc. – től vásárolták. (Santa Cruz, Kalifornia, USA).

sejttenyészet és életképesség

a feltételesen halhatatlanná vált HEI-OC1 hallósejtek létrehozását és jellemzését korábbi jelentésünkben írtuk le 1. Az OHC-specifikus markerek, például a Math1 és a miozin 7a expressziója arra utal, hogy a HEI-OC1 sejtek OHC prekurzorokat képviselnek. A HEI-OC1 sejteket 10% FBS-t tartalmazó magas glükóz DMEM-ben (Gibco BRL) tartottuk fenn. Az alábbiakban ismertetett kísérletekhez a HEI-OC1 sejteket a következő megengedő körülmények között tenyésztettük: 33 db C és 5% CO2 DMEM-Ben, 10% FBS-sel kiegészítve. A sejteket (3 db 604 db sejt/24 lyukú lemez kútja) 20 db 64 mm-es ciszplatinnal inkubáltuk 24 órán át. a sejt életképességének meghatározásához MTT-t (0,25 mg) adtunk egy 1 ml-es sejtszuszpenzióhoz 4 órán át. a sejtek mosása és három PBS-sel (pH 7,4) végzett mosás után az oldhatatlan formazan terméket DMSO-ban oldottuk. Az egyes tenyészetek optikai sűrűségét (OD) ezután mikrolemez-olvasóval (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) mértük 590 nm-en. A kontrollsejtek OD-ját a 100% – os életképesség jelzésére vettük. A különböző citokinek hatásainak vizsgálatához citokinek elleni semlegesítő antitesteket adtunk a tenyészetekhez 30 percig, majd 20 db 6369

állatokat

STAT4−/− (backcross generáció N10), STAT6−/− (backcross generáció N6) és WT BALB/C egereket vásároltunk a Jackson laboratóriumból (Bar Harbor, ME, USA). A homozigóta STAT4 és STAT6 Ko egereket PCR-rel azonosították. A KO egerek nem mutattak fejlődési rendellenességeket. A kísérleteket 6 hetes egereken végezték, és az összes egeret 3 napon belül megegyezték az életkorral. Az egereket szokásos kereskedelmi étrenddel etettük, miközben 20-22 oc környezeti hőmérsékleten és 50 oc 5% relatív páratartalom mellett 12:12 h fény:sötét ciklus alatt egy specifikus kórokozóktól mentes létesítményben helyeztük el őket. Minden állatkísérletet a Wonkwang Egyetem Orvostudományi Karának állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyott jóvá.

luciferáz reporter assay

a sejteket átmenetileg transzfektáltuk NF-kB luciferáz reporter plazmiddal a transzfekciós reagens, Lipofektamin 2000 alkalmazásával. 36 óra inkubálás után a sejteket 12 órán át ciszplatinnal kezeltük semlegesítő citokin antitestek jelenlétében. A sejteket ezután kétszer PBS pufferrel mostuk, majd reporter lízis pufferben lizáltuk (Promega, Madison, WI, USA). A lizátum egy 20-6L alikvot-ját ezután összekeverjük 100 6L luciferáz vizsgálati reagenssel, majd a kibocsátott fényerősséget autolumat lb953 luminométerrel mérjük (EG és G Berthold, Bad Wildbad, Németország). Végül a luciferáz aktivitást három példányban mértük, átlagoltuk, majd a galaktozidáz vizsgálati rendszer (Galacto-Light, Tropix Inc., MA, USA) a gyártó utasításai szerint.

transzfekció siRNS konstrukciókkal

az egér STAT4, STAT6 és kontroll kódolt siRNS ellen tervezett siRNS-eket a Santa Cruz Biotechnology-tól vásárolták. A siRNS-ek sense szálai a STAT4 és STAT6 ellen a következők. A STAT4 siRNS konstrukció az siRNS három szekvenciájának halmaza a következők szerint: Duplex 1 Sense szál: 5 ‘- IndexTermGUA GCU Gua GUA AU UCA a-3′, Duplex 2 Sense szál: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA a-3′, és Duplex 3 Sense szál: 5′-IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA A-3’ (mRNS csatlakozási szám: NM_011487). A STAT6 siRNS konstrukció az siRNS három szekvenciájából áll, a következők szerint: Duplex 1 Sense szál: 5 ‘- IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC A-3′, Duplex 2 Sense szál: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG a-3′, és Duplex 3 Sense szál: 5’-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG A-3 ‘ (mRNS csatlakozási szám: NM_009284). A sejteket átmenetileg transzfektáltuk 100 nM siRNS-konstrukcióval X-tremeGENE siRNS-transzfekciós reagensben (Roche Applied Science, Penzberg, Németország) a gyártó protokollja szerint. 33 6CC-on és 5% CO2-on 36 órán át történő inkubálás után a sejteket 24 órán át ciszplatinnal kezeltük. Az expresszió interferenciáját immunoblot analízissel igazolták.

gyulladásgátló citokinek mérése ELISA-val

a gyulladásgátló citokinek szekréciójának mérésére a ciszplatinnal kezelt sejtekből a tenyészet felülúszóit minden időpontban betakarítottuk, majd a szekretált gyulladásgátló citokinek szintjét ELISA-val határoztuk meg (Kvantikin citokin készletek; R& D Systems Inc.) a gyártó utasításai szerint.

előállítása citoszolos és nukleáris kivonatok

sejteket mossuk jéghideg PBS, lekapartuk és centrifugáljuk 1 000 db g 5 percig 4 db C. a sejt pellet ezután reszuszpendáljuk 200 ml lízis puffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid, és 0,5 mm-es fenil-metil-szulfonil-fluorid mm ditiotreitol), majd 15 percig jégen inkubáltuk. Az inkubáció végén 10 db 10%-os NP-40-et adtunk hozzá, és a csövet 10 másodpercig örvényeltük. Centrifugálás után 13 000 g-on 1 min-en 4 6CC-n, a felülúszót (citoszolos extraktumot) összegyűjtöttük és-80cc-on tároltuk, míg a pelletet tovább dolgoztuk, hogy megkapjuk a magkivonatokat. A pelletet ezután újraszuszpendáltuk extrakciós pufferben (5 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM fenilmetilszulfonil-fluorid, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreit és 25% (vol/vol) glicerin), és 30 percig inkubáltuk 4 (Vol / vol) C hőmérsékleten. a nukleáris kivonatokat 13 000 (vol) g-on végzett centrifugálással izoláltuk 30 percen keresztül 4 (vol) C-on. A felülúszót ezután eltávolítottuk, és -80 C-on tároltuk, amíg western blot elemzésre nem használták. Végül a fehérjekoncentrációt Lowry módszerrel határoztuk meg.

Western blot analízis

Western blot analízist végeztünk az alábbiak szerint. Röviden, a sejteket betakarítottuk és kétszer mossuk jéghideg PBS-sel. A teljes és a nukleáris / citoszolos frakcionált lizátumokat ezután elektroforézisnek vetettük alá 12% SDS-poliakrilamid géleken 3 órán át 20 mA-n, majd nitrocellulózba helyeztük át őket. A membránt ezután 5% (wt/vol) szárított tejfehérjében inkubáltuk PBS-ben, amely 0,05% (vol/vol) Tween-20-at (PBS-T) tartalmaz 1 órán át, majd PBS-T-ben mostuk, majd tovább reagáltattuk primer antitesttel (1:1 000) 1 órán át. ezután a membránt alaposan megmossuk PBS-T-vel, majd HRP-hez konjugált nyúlellenes IgG antitesttel inkubáltuk (1:3 000) 1 órán át. kiterjedt mosások után a membránon lévő fehérjeszalagokat a kemilumineszcens reagensekkel vizualizáltuk a gyártó utasításai szerint (supersignal szubsztrát; Pierce, Rockford, IL, USA).

ciszplatin ototoxicitás In vivo kísérlete

minden egeret véletlenszerűen két, egyenként hat egérből álló csoportra osztottunk. Az 1. csoportba tartozó állatok, amelyeket kontrollcsoportnak tekintettek, intraperitoneális PBS injekciót kaptak. A 2. csoportba tartozó állatoknak ciszplatint (4 mg/ttkg) adtak Intraperitoneális injekció formájában 4 egymást követő napon keresztül. Az állatokat ezután altatásban ölték meg CO2 gáz felhasználásával a végső ciszplatin injekciót követő napon, amely után a jobb fül időbeli csontját eltávolították.

az ABR mérése

a hallási küszöb további elemzéséhez az ABR-t a ciszplatin végső kezelése előtt és 24 órával azután mérték. Ezután összehasonlították az ABR küszöbértékek változását a kezelés előtti és utáni kezelés között. Az egereket ketamin (40 mg/ttkg) és xilazin (10 mg/ttkg) koktéllal érzéstelenítettük, és az ABR felvétel során melegítőpárnával melegen tartottuk. Egy szubdermális (aktív) tűelektródát helyeztek a csúcsra, míg a földelt és a referenciaelektródákat szubdermálisan helyezték be a laza bőrbe az ellenkező fülek csúcsa alatt. A tesztingerek váltakozó fázishang-kitörésekből álltak 4, 8, 16 és 32 kHz frekvencián. A jeleket Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) SigGen szoftver segítségével generálták. Minden hangkitörés (1 ms időtartam) egy Blackmann ablakon keresztül volt kapuzva, és 0,5 ms emelkedés-esés ideje volt fennsík nélkül. Az ingereket minden tesztelési munkamenet előtt kalibráltuk úgy, hogy a hangszóró kimenetét az állatok fejmagasságába helyezett mikrofonnal rögzítettük. Az ABR hullámformákat átlagoltuk 300 hangszakadásra adott válaszként minden vizsgált frekvencián. Minden frekvencián a jel amplitúdóját automatikusan 10 dB-es lépésekben csillapítottuk 90 dB SPL-ről, amíg az ABR hullámok 100-3 000 Hz-es szűrőbeállításokkal rögzített nyomokban eltűntek. A küszöb megítélését két független, kísérletileg vak megfigyelő végezte el az ABR nyilvántartásai alapján.

a Corti explants szervének felszíni előkészítése

az összes egeret a végső ciszplatin injekció utáni napon ölték meg. A temporális csontot 4% – os paraformaldehidben rögzítettük 16 órán át, 4 6CC-n, majd 0,1 M PBS-sel öblítettük. A temporális csontot további 10% – os EDTA-val vízkőmentesítettük PBS-ben 3 napig. A csigát gondosan boncolták ki. Ezután a stria vascularist és a spirális ínszalagot levágták, így Corti szerve maradt. A csiga középső fordulatát tritc-vel jelölt falloidinba (Sigma P1951, 1:100) merítettük PBS-ben 20 percig. Három PBS-sel végzett mosás után a mintát fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk a TRITC megfelelő szűrőinek felhasználásával (gerjesztés: 510-550 nm, emisszió: 590 nm).

immunhisztokémiai festés és TUNEL assay

az eltávolított halántékcsontot 4% paraformaldehidben rögzítették 16 órán át, majd 10% EDTA-val vízkőmentesítették PBS-ben 2 hétig, majd dehidratálták és paraffinviaszba ágyazták. Az 5 MHz-es szakaszokat xilolban deparaffinizáltuk, majd etanol-koncentrációval rehidráltuk. Az immunhisztokémiai vizsgálathoz immunhisztokémiai készletet (DAKO LSAB Universal K680, Carpinteria, CA, USA) használtunk, és az eljárásokat a gyártó utasításai szerint végeztük. Az endogén peroxidázt ezután 3% – os hidrogén-peroxiddal blokkoltuk 5 percig szobahőmérsékleten (RT). Miután a szakaszokat PBS-ben mostuk, a nem specifikus kötődést 1% szarvasmarha szérum albuminnal blokkoltuk 1 órán át. primer antitesteket (1: 200 hígítva) ezután hozzáadtunk a tárgylemezekhez, majd az inkubálás 1 órán át folytatódott. PBS-sel végzett ismételt mosás után a szakaszokat biotinilezett szekunder antitesttel inkubáltuk 30 percig, majd 30 percig torma-peroxidázt tartalmazó szekunder antitesttel borítottuk. Végül a szekciókat frissen elkészített szubsztrátoldatban (3 mg 3-amino-9-etil-karbazol 10 ml nátrium-acetát pufferben (pH 4,9), 500 ml dimetil-formamid, 0,03% hidrogén-peroxid) festettük 5 percig. Az immunfestett sejtek magjait ezután Mayer hematoxilinjével (Sigma-Aldrich Co.). Az apoptotikus sejteket in situ detektáltuk a TUNEL assay felhasználásával (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Németország). Röviden, egy szakaszt depaffinizáltak és rehidratáltak. Inkubálás után 20 6G/ml proteináz K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Németország), az endogén peroxidáz blokkoltuk inkubáljuk a mintákat 2% H2O2 metanolban 30 percig rt. ezután a szövetrészeket PBS-ben mossuk, és 1 órán át inkubáljuk jelölőoldattal 37 C. a magokat ezután propidium-jodiddal (0,5 0 g/ml, molekuláris szondák) 10 percig rt. a PBS-szel történő mosás után a mintát egy rövid idő alatt megvizsgáltuk fluoreszcens mikroszkóp.

reverz transzkriptáz-PCR amplifikáció

a cochleáris PCR esetében a bal fül temporális csontját gyorsan betakarítottuk és Rnalaterbe merítettük (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) használatig -20 C. Ezután az egész cochleae-t boncolták ki, és a teljes RNS kivonására használták TRIzol (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó protokolljai szerint. A teljes RNS extrahálása után Trizol (Invitrogen) alkalmazásával egyszálú cDNS-t szintetizáltunk a teljes RNS-ből. Ezután a PCR-t Taq DNS-polimerázzal (Takara, Takara Shuzo, Japán) végeztük úgy, hogy a mintákat 30 ciklusnak vetettük alá, 95 kb 40 mp-re, 58 kb 40 mp-re, és 72 kb 50 mp-re. a PCR-termékek tíz mikroliterét ezután 1,2% – os agaróz gélen elválasztottuk, és UV-fény alatt vizualizáltuk. A PCR amplifikációhoz használt primerek szekvenciái a következők voltak: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, fordított, 5 ‘-IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3’).

statisztikai elemzés

minden kísérletet legalább háromszor végeztünk, és minden jelentett érték a három példányban végzett analízisek átlagát jelenti. A többváltozós statisztikai analízist varianciaanalízissel és Duncan tesztekkel végeztük az SPSS 11 (Chicago, IL, USA) statisztikai szoftver segítségével. Az eredmények jelentőségének meghatározásához kétirányú ANOVA-t és/vagy egyirányú ANOVA-t használtunk. A statisztikai eredményeket egy mesterszintű biostatisztikusa vizsgálta felül. P < 0 értékek.05 statisztikailag szignifikánsnak tekinthető.