a Chimerism tesztet az allogén transzplantált recipiensek beültetésének és transzplantáció utáni nyomon követésének rutin dokumentálására használják. A Donor és a recipiens sejtek megkülönböztethetők a transzplantáció előtt meghatározott genetikai markerek tesztelésével.2 a nemhez nem illő transzplantációkban, amikor a recipiens és a donor különböző nemű, a női és férfi sejtek arányát általában a nemi kromoszóma markerek elemzésével határozzák meg, leggyakrabban halakkal.8,9 a változó számú tandem ismétlés (VNTR) vagy a rövid tandem ismétlés (STR) PCR-rel történő értékelése a legértékesebb módszer a kimérizmus meghatározására a nemekkel egyeztetett transzplantációkban.10 különböző módszereket fejlesztettek ki az MRD kimutatására. A csontvelő morfológiai elemzése azonosíthatja a maradék betegséget, amely a velőterület több mint 5% – át foglalja el, így hiányzik a korai felismeréshez szükséges érzékenység. Ezenkívül gyakran nehéz megkülönböztetni egy kis leukémia blaszt populációt a normál donorból származó hematopoietikus blasztoktól, amelyek a csontvelőt újratelepítik további markerek használata nélkül. A specifikus tesztek kimutathatják az MRD-t, ha van egy specifikus tumormarker, például egy specifikus citogenetikai rendellenesség, egy specifikus immunfenotípus, amelyet FACS-kkel lehet azonosítani, specifikus DNS-vagy RNS-szekvenciák, amelyek PCR-rel amplifikálhatók, vagy egy specifikus növekedési minta klonogén vizsgálatokban. Az MRD specifikus tumor markerének hiányában a kimérizmus tesztelése felhasználható a recipiens eredetű sejtek kimutatására. A recipiensből származó sejtek kimutatása nem mindig korrelál a relapszus kockázatával. A vegyes kimérizmushoz (MC) hozzájáruló recipiens sejtek a rosszindulatú klónhoz tartoznak, vagy lehetnek normális hematopoietikus sejtek, vagy akár stromális sejtek. A standard allogén transzplantáció utáni első hetekben a recipiens sejtek még mindig kimutathatók, ha érzékeny teszteket alkalmaznak.9,11 ezek többnyire T-sejtek, amelyek túlélik a kondicionáló rendszert. A gazdasejtek alacsony szinten (<1%) kimutathatók még a transzplantáció utáni időszakban is. Az MC-t gyakrabban észlelik a nem myeloablatív kondicionálás után.2 így a tumorspecifikus markerszondák valószínűleg jobbak és pontosabbak, mint a nem-mismatch szondák az MRD kimutatására.12 azonban még az MRD kimutatása tumor-specifikus tesztekkel sem mindig korrelál a relapszus kockázatával. Egészséges egyéneknél pozitív PCR-tesztekről számoltak be a BCR/ABL szempontjából.13 A t(14;18) transzlokációt a B-limfocitáktól eltérő vonalakban detektálták non-Hodgkin limfómában szenvedő betegeknél.14 Lehet, hogy az MRD küszöbértéke klinikailag szignifikáns. Számos betegségben, például AML-ben t-vel (8;21), 15 tartós remissziót figyeltek meg PCR-rel kimutatott MRD jelenlétében, míg másokban, például akut promyelocytás leukémiában, a PCR pozitivitás előrejelzi a visszaesést.16 Ez megint összefüggésben lehet a specifikus PCR-teszt érzékenységével és a klinikai szignifikanciára vonatkozó küszöbértékkel. A maradék rosszindulatú sejtek alvó állapotban lehetnek17 hiányzik a lehetőség, hogy hozzájáruljon a visszaeséshez, egy második genetikai változás hiánya vagy nyeresége miatt. Egyes betegségekben előfordulhat az érettebb sejtek részleges differenciálódása, és előfordulhat, hogy ezek a sejtek nem képesek szaporodni. Az MRD immunfelügyelet alatt állhat, vagy az MRD sejtek apoptotikus fázisban vannak, ami irreleváns a betegség kiújulása szempontjából. Az érzékeny PCR-tesztek nem őrzik meg a sejtek morfológiáját, ezért nem világos, hogy mely sejtek korrelálnak az MRD-vel ezekben a különböző körülmények között.
a duet (Duet) rendszer a kombinált szimultán morfológiai és citogenetikai többparaméteres analízishez kínál néhány előnyt, amelyek segíthetnek az MRD detektálás relevanciájának feltárásában. Ez a rendszer automatikusan nagyszámú sejtet (diánként körülbelül 150000 sejtet) keres egyedi citogén vagy immunfenotípusú kis sejtes részhalmazok után. Növekszik az érzékenység a kis populációk kimutatására. Hígítási kísérletek sorozatában megmutattuk, hogy a hím sejt kimutatásának érzékenysége egy női sejtpopulációban nagyobb, mint 1:50000, azonban ennek a titernek a korlátozott specifitása miatt a legjobb kimutatás 1:10000 és 1:50000 között történik (lásd a függeléket). Amint azt az 1.betegből (utolsó elemzés) és a 2. betegből származó csontvelőminták elemzése is mutatja, A Duet 6 rendszer képes volt kimutatni az XY recipiens sejtek nagyon kis populációit, amelyeket a rutin FISH nem mutatott ki. A halak mennyiségi pontossága a megfigyelt gyakoriságtól és a pontozott sejtek számától függ, így több sejt pontozásával javul.18 ilyen nagy számú sejt pontozása nem praktikus a kézi FISH-nél, de a Duet GmbH automatikus rendszere fénymezős mikroszkóppal 10000 sejt/perc, fluoreszcens mikroszkóppal pedig 2000-10000 sejt/óra letapogatására képes, így támogatva a gyors és hatékony letapogatás és a fokozott érzékenység szükségességét.
az érzékeny tesztek gyakran csökkent specifitással és viszonylag magas álpozitív aránnyal társulnak. Standard FISH esetén hamis pozitív pontozás fordulhat elő a szonda nem specifikus hibridizációja miatt. A véletlenszerű térbeli asszociáció és az optikai fúzió miatt a kromoszómális transzlokációk hamis pozitív pontozása fordulhat elő.18 a duet (Duet) rendszer potenciálisan javíthatja a specifitást azáltal, hogy azonosítja a keresett populáció sejtjeinek morfológiáját. A halak pozitivitásának kimutatása, kis populációban, de egységes duettben a morfológiai megjelenés miatt valószínűbb, hogy valódi pozitív, mint amikor a pozitív sejtek szétszóródnak különböző, független vonalakban. Az MRD kimutatásának specifitása nem specifikus kiméra teszteléssel szintén javítható. Amint azt fentebb tárgyaltuk, a recipiens sejtek a rosszindulatú klónhoz tartozhatnak (mint az 1.betegnél), lehetnek normális hematopoietikus sejtek (3. beteg, 1. beteg az STI571-es kezelés után) vagy nem hematopoietikus/stromális sejtek (például osteoblastok, 2. beteg). A duet (Duet) rendszer lehetővé teszi ezen opciók morfológiai megjelenéssel történő megkülönböztetését. Az 1.beteg és két további beteg elemzésében (az adatok nem jelennek meg) megmutattuk, hogy a recipiens jellemzők (például az ellenkező nemű citogenetika) azonosítása a robbanásokban vagy az éretlen sejtekben előre jelzi a nyilvánvaló visszaesést, és néhány héttel vagy néhány hónappal megelőzi. Az 1. betegben külön FISH analízisek egy kis XY recipiens populációt (0,6%) és egy kis BCR/ABL pozitív populációt (0,8%) tártak fel, amely mindkettő figyelembe vehető a fish analízis álpozitív arányán belül. A duet-féle rendszer azonban kimutatta, hogy az XY recipiens sejtek nagy része Blast volt (és BCR/ABL pozitív volt ugyanazon sejteken végzett második FISH-teszttel), és így megjósolhatta, hogy a beteg visszaesésre van ítélve. Az érett hematopoietikus sejteken belüli kis recipiens populáció azonosítása nem jósolhatja meg a visszaesést. Három további betegnél (az adatok nem jelennek meg) dokumentáltuk folyamatos remisszió kis recipiens jelenlétében Érett morfológiájú populáció. Nagyobb léptékű, hosszabb nyomon követéssel végzett vizsgálatokra van szükség a reziduális gazdasejtek morfológiája és a relapszus kockázata közötti összefüggés megerősítéséhez olyan betegeknél, akiknél a malignus klón más egyedi markere nincs.
a rendszer viszonylag egyszerűen kezelhető, többnyire automatikus, a kiméra és az MRD kimutatására szolgáló más rendszerekkel, például a standard FISH és PCR rendszerekkel összehasonlítható, és alkalmas lehet nagyszabású tesztelésre. A rendszer hardverein és készletein kívül csak a nagy laboratóriumokban könnyen elérhető alapfelszereltségre van szükség (lásd a függeléket).
az utóbbi években a kiméra tanulmányozása a különböző sejtes részhalmazokban érdeklődést és népszerűséget váltott ki.19,20 ez rendkívül fontos a nem myeloablatív transzplantációk után.2 egyes csoportok kimutatták, hogy a T-limfocitákon belüli teljes kimérizmus szükséges a GVL indukciójához, ezért az MC ebben a sejtes alcsoportban a relapszus fokozott kockázatával járhat, különösen agresszív, gyorsan növekvő rosszindulatú daganatok esetén.2,19 a sejtes részhalmazok Kiméra tesztelése nehézkes és időigényes sejtválogatást igényel, amelynek elméleti lehetősége bizonyos sejtek elvesztése a folyamat során. Amint azt a függelék tárgyalja, a dia előkészítése a duet-hez a .. .. elemzés nem okoz veszteséget vagy csökkenést egyetlen sejtpopulációban sem. A duet! rendszer az MGG festett diát használja a limfociták és más sejtes részhalmazok lokalizálására, és immuncitokémiai foltokat (például anti-CD3 monoklonális antitesteket) is használhat ezeknek a sejteknek a lokalizálására. A második szakaszban a halak alkalmazhatók kiméra tesztelésre a nemhez nem illő transzplantációkban. A 3. beteg esetbemutatója azt mutatja be, hogy a rendszert hogyan alkalmazták a kimérizmus követésére egy nem myeloablatív transzplantáció után, és hogyan jósolta meg a ciklosporin megvonását követő teljes kimérizmusra való áttérés a GVHD és a GVT válaszok előfordulását.
ez a jelentés a duet használatára összpontosít a csontvelő-transzplantációt követő hosszú távú adatok, azonban sok más következmény is lehet. A rendszer segíthet azoknak a sejteknek és vonalaknak a tanulmányozásában is, amelyek egyedülálló citogenetikai vagy immunofenotípusos markereket hordoznak, mint például a BCR/ABL fúzió (amint azt az 1.betegnél láttuk), és korrelálja morfológiájukat a standard kemoterápia utáni relapszus kockázatával. Segíthet feltárni az MRD természetét különböző rosszindulatú daganatokban, és miért nem mindig jelzi előre az MRD kimutatása a visszaesést. Bizonyos körülmények között kis donor sejtpopulációkat vagy mikrokimerizmust lehet keresni. Például a szilárd szervátültetés után kimutatott szisztémás lympho–hematopoietikus mikrokimerizmus előrejelezheti az átültetett szerv toleranciáját és irányíthatja az immunszuppresszív terápiát.21 a köldökzsinórvér-allograftokat szennyező kis anyai populáció szintén hasonló módon kimutatható, és hatással lehet a transzplantáció utáni GvHD kockázatára.
összefoglalva, a malignus vagy recipienshez kapcsolódó markerekkel rendelkező kis sejtpopulációk morfológiai elemzésével a duet (Duet) rendszer javíthatja a kiméra és az MRD vizsgálat pontosságát, és meghatározhatja azok klinikai jelentőségét. Ez a rendszer további vizsgálatokat érdemel nagyobb léptékű vizsgálatokban.