az ipari anaerob Clostridium acetobutylicum poliketideket használ a sejtek differenciálódásának szabályozására

baktériumtörzsek és

C. az acetobutylicumot ATCC 824 anaerob kamrában (Coy laboratóriumi termékek) tenyésztettük, 97% nitrogén és 3% hidrogén atmoszférával. A 2xytg medium67 16 g/L triptont, 10 g/L élesztőkivonatot, 5 g/L NaCl-t és 10 g/L glükózt tartalmazott (hacsak másként nem jelezzük), a pH-értéket 5-re állítva.2 folyékony közeg esetén és 5.8 szilárd közeg esetén (15 g/L agart is tartalmaz). Clostridialis táptalaj (CGM)68 tartalmazott 30 g/L glükóz (hacsak másként nem jelezzük), 6,25 g/L élesztő kivonat, 2,5 g/L ammónium-szulfát, 1,25 g/L NaCl, 2,5 g/L aszparagin, 0,95 g/L egybázisú kálium-foszfát, 0,95 g/L kétbázisú kálium-foszfát, 0,5 g/l magnézium-szulfát-heptahidrát, 13 mg/L mangán-szulfát-heptahidrát, és 13 mg/L vas-szulfát-heptahidrát, amelynek pH-ja 6,4-re van állítva. A P2 közeg69 80 g/L glükózt tartalmazott (hacsak másként nem jelezzük), 1 g/L élesztőkivonatot, 2,2 g/l ammónium-acetátot, 0.5 g/L kálium-foszfát-egybázisú, 0,5 g/L kálium-szulfát-kétbázisú, 0,2 g/L magnézium-szulfát-heptahidrát, 1 mg/L para-amino-benzoesav, 1 mg/L tiamin-hidroklorid, 10 6G/l biotin, 10 mg/L mangán-szulfát-heptahidrát, 10 mg/L vas-szulfát-heptahidrát és 10 mg/L NaCl, a pH 6,4-re igazítva. A clostridialis bazális táptalaj (CBM)70 10 g/L glükózt, 0,5 g/L egybázisú kálium-foszfátot, 0,5 g/L kétbázisú kálium-foszfátot, 4 g/L triptont tartalmazott, 0.2 g/L magnézium-szulfát-heptahidrát, 10 mg/L mangán-szulfát-heptahidrát, 10 mg/L vas-szulfát-heptahidrát, 1 mg/L para-amino-benzoesav, 1 mg/L tiamin-hidroklorid és 2 db 6,9-re beállított pH-értékű biotin. Szilárd CGM lemezekhez 15 g / L agart adtunk. A CBM-S (folyékony sporulációs vizsgálatokhoz használt) azonos volt a CBM-Mel, kivéve 50 g/L glükózt, és 5 g / L CaCO3-t adtak hozzá közvetlenül a kultúrák beoltása előtt. Az E. coli TOP10-et (Thermo Fischer Scientific) Luria-Bertani (LB) táptalajon termesztették 37 C. A megfelelő Clostridium törzsekhez a táptalajt eritromicinnel (ery; szilárd táptalajok esetében 40, folyékony táptalajok esetében 80, folyékony táptalajok esetében 80, illetve tiamfenikollal (szilárd és folyékony táptalajok esetében 5, stb.) egészítettük ki. Kanamicint (Kan; 60 6G/mL) vagy kloramfenikolt (Cm; 25 6G/mL) adtak az E. coli táptalajhoz az indikációnak megfelelően. A Clostridium és az E. coli törzsek fennmaradtak, mivel a 20% V/v glicerin állományok -80 ca. C.

Plazmidszerkezet

oligonukleotidokat integrált DNS-technológiák szolgáltatták (5.Kiegészítő táblázat). Az összes PCR-reakcióhoz Phusion polimerázt (NEB) alkalmaztak. A C. acetobutylicum ATCC 824-ből származó genomi DNS izolálásához lúgos lízis módszert alkalmaztunk71. A C. acetobutylicumot egy éjszakán át 2xytg közegben, állófázisban tenyésztettük (OD600 > 2,0), ekkor 10 mL tenyészetet centrifugáltunk 3500 g-on 15 percig (szobahőmérsékleten). A felülúszót eldobtuk, és a sejtpelletet reszuszpendáltuk 5 mL beállított pufferben (75 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). A lizozimot 2 mg/mL végső koncentrációhoz adtuk, majd az oldatot óvatosan elkeverjük. Az elegyet inkubáltuk 37cc-n 60 percig, 15 percenként végzett enyhe keveréssel. Az inkubációs periódust követően 660 ml lízis puffert (1 M NaOH, 10% m/v SDS) adtunk hozzá, majd az oldatot alaposan elkeverjük. A proteináz K-t 0,5 mg/mL végkoncentrációhoz adtuk, majd az oldatot 55 6CC hőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. ezt az inkubációs időszakot követően egyenlő térfogatú fenol-kloroformot (1:1) adtunk hozzá, majd az oldatot inverzióval 5 percig kevertük. Ezt követően az oldatot 3500 ft-on centrifugáltuk 15 percig (szobahőmérsékleten), majd a felső vizes fázist pipettázással eldobtuk. A szerves fázishoz 3 M nátrium-acetátot adtunk (10% v/v végső oldatban). A genomi DNS kicsapásához 2 térfogat etanolt adtunk hozzá, majd az oldatot összekeverjük. A kicsapódott genomi DNS-t üveghorog segítségével gyűjtöttük össze, és 70% – os etanollal mossuk. A kimosott DNS-t ezután nitrogéngázon 15 percen át szárítottuk, alacsony TE pufferben reszuszpendáltuk (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), majd 50 KB-os inkubálással feloldottuk.

a pko_mazf_mod plazmid felépítéséhez (ami később a pko_pks sablonjaként szolgált) a pkon_fo és a pKON_Ro primereket használták a PKO_MAZF sablon15 5,0 kb-os régiójának PCR-amplifikálására. Erre a lépésre egy 677 bp régió eltávolításához volt szükség a pKO_mazF gerincéből, amelyet PCR-rel nem tudtunk amplifikálni. Az 5,0 kb-os PCR-terméket gélen tisztítottuk, az 5′ és 3′ végeken pshai-val emésztettük, ligáltuk, hogy pKO_mazF_mod képződjön, majd E. coli TOP10-vé alakítottuk át. A transzformáns klónokat tisztított plazmid teszt emésztéssel szűrtük, majd Sanger szekvenálással igazoltuk a végső pKO_mazF_mod klón szekvenciáját. A pko_pks plazmid felépítéséhez (a pks gén C. acetobutylicumból történő törléséhez) egy 3,8 kb-os régiót, amely colE1-et, repL-t, bgaR-t és mazF-et tartalmazott, PCR-amplifikáltuk a pKO_mazF_mod-ból pko_f és pKO_R primerek felhasználásával. ezenkívül uhr_fo és UHR_Ro primereket, valamint DHR_Fo és DHR_Ro primereket használtunk az upstream és downstream homológ régiókat képviselő 1 kb-os régiók PCR-amplifikálására (UHR és DHR) a PKS gént (ca_c3355) a C-ből. acetobutylicum ATCC 824 genomi DNS sablon. A kloramfenikol / tiamfenikol rezisztencia gént és konstitutív promoter-t (P ptb a C. acetobutylicum-ból) PCR amplifikáltuk a PKO_MAZF_MOD-ból cmr_f és CMR_R primerekkel (1,1 kb régió). Ezt a négy PCR terméket Gibson assembly-n keresztül ligáltuk, és E. coli TOP10-vé alakítottuk át. A transzformáns klónokat tisztított plazmid teszt emésztéssel szűrtük, és Sanger szekvenálással igazoltuk a végső pKO_pks klón szekvenciáját. PAN315 plazmid építéséhez (szükséges a pko_pk-k és pko_pk-k metilezéséhez a C-vé történő átalakítás előtt. acetobutylicum), a pan172 plazmidból származó 6,4 kb-os régiót pAN1_F és pAN1_R primerekkel amplifikáltuk, és egy 1,0 kb-os régiót, amely a pCOLA_Duet vektorból származó kanamicin rezisztencia gént tartalmazta, kan_fo és KAN_Ro primerekkel amplifikáltuk. A gélből kivont PCR-termékeket Gibson assembly-n keresztül ligáltuk, és E. coli TOP10-vé alakítottuk át. A transzformáns klónokat tisztított plazmid teszt emésztéssel szűrtük, és Sanger szekvenálással igazoltuk a végső pAN3 klón szekvenciáját. A pcko_pks plazmid felépítéséhez (a pks gén expressziójához a C konstitutív krotonáz promoter alatt. acetobutylicum), CPKS_Fo és CPKS_Ro primereket használtak az 5,4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks gén (CA_C3355) PCR-amplifikálására a Gibson összeszereléshez megfelelő túlnyúlásokkal. A pwis_empty vector71 gerincet (amely a többszörös klónozási hely előtt álló konstitutív crt promoter-t tartalmazta) PCR-amplifikáltuk pwis_f és pWIS_R primerekkel, így 5,0 kb-os terméket kaptunk. A két géllel tisztított PCR terméket Gibson assembly-n keresztül ligáltuk, és E. coli TOP10-vé alakítottuk át. A transzformáns klónokat tisztított plazmid teszt emésztéssel szűrtük, és Sanger szekvenálással igazoltuk a végső pCKO_pks klón szekvenciáját.

a pet24b_pks plazmid előállításához az 5,4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks gént (CA_C3355) a C. acetobutylicum genomi DNS-ből pks_fo és PKS_Ro primerek segítségével amplifikáltuk. A kétszeresen emésztett pET24b vektort (ecori/xhoi emésztett) kétszeresen emésztett pks PCR termékkel (EcoRI/XhoI emésztett) ligáltuk, majd a ligációs terméket E. coli TOP10-vé alakítottuk át. A transzformáns klónokat tisztított plazmid teszt emésztéssel szűrtük, és Sanger szekvenálással igazoltuk a végső pET24b_pks klón szekvenciáját.

a C. acetobutylicum Elektrotranszformációja

a C. acetobutylicummá történő transzformáció előtt a pko_pks vektort a pAN3-mal együtt transzformáltuk E. coli TOP10-vé elektroporáció útján. Ez az eljárás lehetővé tette a C. acetobutylicumban aktív natív restrikciós módosító rendszer leküzdéséhez szükséges pKO_pks metilezését 72. Az e plazmid tisztítása. coli pKO_pks / pAN3 folyékony tenyésztést végeztünk, majd a kapott plazmid keveréket C. acetobutylicum elektroporációjához használtuk a korábban publikált módszer72 alkalmazásával, amelyet itt részletezünk. Az elektrokompetens sejtek előállításához egyetlen C. acetobutylicum kolóniát egy 2xYTG-os lemezről (több mint 1 hetes) hővel sokkolták 80 KB 10 percig, és 10 mL CGM beoltására használták. Miután egy éjszakán át inkubáltuk 37cc-n, és elérte a közepes exponenciális fázist (OD600 0,4–0,9), 6 mL tenyészetet használtunk 54 mL friss 2xytg beoltására. Ezt a szubkultúrát 37-nél inkubáltuk kb, amíg el nem érte az OD600 1-et.2 (~5 óra), ekkor a szubkultúrát 3500 g-on 20 percig (4 c) centrifugáltuk. A felülúszó eltávolítását követően a sejtpelletet 20 mL jéghideg elektroporációs pufferben reszuszpendáltuk (EPB; 270 mM szacharóz, 5 mM NaH2PO4, pH 7,4). Az újraszuszpendált sejteket 3500 ft-on centrifugáltuk 10 percig (4 Ft), a felülúszót eldobtuk, és a sejtpelletet 20 mL jéghideg EPB-ben reszuszpendáltuk. A végső pelletálás után, 3500 ft-on 10 percen át (4 ft-on) végzett centrifugálással a felülúszót eldobtuk, és a pelletet 2,3 mL jéghideg EPB-ben reszuszpendáltuk. Ezt a végső reszuszpendálást használtuk az elektrokompetens sejtek állományaként. Az elektro-transzformációkat úgy végeztük el, hogy először (jég felett) 500 db Kompetens sejtet és ~20 db (összesen 1-5 db) plazmid DNS-oldatot keverünk. Az elegyet 0,4 cm-es elektroporációs küvettába helyeztük, majd 15 percig jégen inkubáltuk. Az elektroporációkat a következő paraméterekkel hajtottuk végre: feszültség, 2000 V; Kapacitás,25 ft; ellenállás, végtelen!). Elektroporációt követően a mintákat 1 mL 2xYTG-ban reszuszpendáltuk, és egy 9 mL 2xytg-ot tartalmazó csőbe helyeztük. Inverzióval történő keverés után a tenyészeteket 37 6CC-on 4 órán át hagytuk visszanyerni. a visszanyerő tenyészeteket 3500 g-on centrifugáltuk 15 percig (szobahőmérsékleten), majd a felülúszót eldobtuk. A sejtpelletet reszuszpendáltuk 500 db 6xytg-ben, majd 100 db 2xytg-os szilárd lemezre bevontuk a megfelelő antibiotikummal kiegészítve. A lemezt 37cc-n inkubáltuk 2-3 napig, majd a transzformáns kolóniákat PCR-alapú ellenőrzésnek vetettük alá.

a pks gén deléciója és genetikai komplementációja

a pks gén célzott KO-ja (ca_c3355) C-ben. az acetobutylicum ATCC 824-et a korábban közzétett módszer15 alkalmazásával értük el. Részletesen, 5 6G metilezett pKO_pks / pAN3 plazmid keveréket alakítottunk át C. acetobutylicum – vá a fent leírt módszerrel. A 2xytg-os folyékony közegben 4 órán át történő visszanyerést követően a sejtpelleteket centrifugálással gyűjtöttük össze (3500 Ft, 15 perc, szobahőmérséklet), 0,5 mL 2xytg-os friss folyadékban reszuszpendáltuk, majd a reszuszpendált sejttenyészetből 100 Ft-ot szilárd 2xytg + 5 Ft/mL Th + 40 mM-es laktózlemezeken bevontunk. Ilyen bevonási körülmények között várhatóan csak azok a sejtek maradnak életben, amelyek átestek a kívánt kettős keresztezett homológ rekombinációs eseményen. A vektor gerincének ellenválasztását a laktóz-indukálható promoter (P bgaL) biztosítja, amely a mazf toxin gént a pKO_pks vektor gerincén hajtja. Ezt a galvanizálási eljárást követően nagyjából 10 kolóniát figyeltünk meg a 2xYTG + 5 6G/mL Th + 40 mM-es laktózlemezeken. Ebből a 10 kolóniából négyet kétszer újraindítottak és kolónia PCR-vizsgálatnak vetettek alá. Négy alapozó készletet használtunk a kolónia PCR-ellenőrzésének alapjául, amint azt a kiegészítő ábra részletezi. 2.

a PKS genetikai komplementációs törzs előállításához a PKS C. acetobutylicum elektroporációját pCKO_pks/pAN3 plazmid keverékkel a fent leírtak szerint végeztük. Az elektroporációt és a visszanyerést követően a tenyészeteket szilárd 2xytg + 5 Ft/mL Th + 40 Ft/mL táptalajon vontuk be. A 2xytg + 5 Ft/mL Th + 40 Ft/mL ery táptalajon végzett kétszeri újracserélés után a pcko_pk-kat hordozó potenciális kolóniákat PCR-rel szűrtük át pcko_f és pCKO_R primerek alkalmazásával.

LC-HRMS metabolomikai analízis

a vad típusú és a PPC C. acetobutylicum nem célzott metabolomikai összehasonlításaihoz az egyes törzsek egyes kolóniáit 80 KB hőmérsékleten 10 percen át hevítettük, és 10 mL folyékony CGM (30 g/L glükóz) beoltására használtuk. Egynapos inkubációt követően (stagnáló) az OD600 ~1,0 eléréséig ezeket a tenyészeteket 10 mL folyékony CGM (80 g/L glükóz) beoltására használtuk 10% – os oltóanyaggal szubkulturálás céljából. Után ~5 h (OD600 ~1.0) stagnáló növekedés esetén a szubkultúrákat négyszeres lombik fermentációk beoltására használtuk (70 mL CGM, 80 g/L glükóz + 5 ^ l habzásgátló 204, 3% inokulum) mágneses keverőrudakon keresztül keverve. A fermentációs közeghez kalcium-karbonátot (6 g/L) adtunk pH-puffereléshez. Az összes tenyésztést 37 C. C. a végső fermentációs tenyészet kivételével az összes PPK-tenyészetbe körülbelül 5 GB / mL Th került, mivel ismert, hogy bizonyos antibiotikumok megzavarják az ABE fermentációs fázisokat. Az egyes replikációkból vett fermentációs táptalajból (1 mL) mintákat korai állófázisban vettünk, és 3 mL 2:1 arányú kloroform metanollal extraháltuk. A keverékeket vortexeltük, centrifugálással szétválasztottuk (2700 Ft, 10 perc), majd a kloroformban gazdag alsó réteget egy üveg injekciós üvegbe helyeztük. Ezeket a szerves kivonatokat nitrogéngázzal szárítottuk, reszuszpendáltuk 100 db 6520 pontos tömegű QTOF LC-MS eszközre, Agilent Eclipse Plus C18 oszloppal (4,6 db 100 mm). 2-98% ch3cn (vol/vol) lineáris gradienst használtunk 40 perc alatt H2O-ban 0,1% hangyasavval (vol/vol) 0,5 mL/perc áramlási sebességgel. Az xcms16 metabolomikai elemzési platformot (Scripps Research Institute) használták a vad típusú és a ppks törzsek metabolomjainak összehasonlítására a négyszeres LC-HRMS adatok alapján. Az MS csúcsok egyedülállóak a PK-k számára (ábra. 1a) A következő paraméterek alkalmazásával azonosították: p-érték < 0,01, hajtásváltozás > 10,0, csúcsintenzitás > 5000.

bioreaktor fermentációk

összehasonlítani a vad típusú Abe fermentációs profilok és a PKS C. acetobutylicum, bioreaktor fermentációt hajtottunk végre DASGIP bioreaktorokban (4 db GPI 100 edény, Dasgip Bioblock rendszer) 500 mL üzemi térfogattal. Egy éjszakán át tartó tenyészeteket (10 mL CGM, 30 g/L glükóz, stagnál, 34 Kb C) hővel sokkolt C. acetobutylicum egyes kolóniáival beoltva az OD600 ~1 eléréséig tenyésztettük. Ezután egy 10% – os inokulumot használtunk egy szubkultúra elindításához (30 mL P2 közeg, 80 g/L glükóz, stagnáló, 34cc), majd a szubkultúrát inkubáltuk az OD600 ~1 eléréséig. A 30 mL-es szubkultúrákat ezután aszeptikusan átvittük az egyes Dasgip Bioreaktorokba, amelyeket 500 mL P2 táptalajjal (80 g/L glükóz, 100 ~ l habzásgátló 204, 34 ~ C) előre betöltöttünk. A fermentációkat 54 órán át hagytuk folytatni, periodikus mintavételezéssel az optikai sűrűség méréséhez, a fermentációs termék elemzéséhez, valamint az 1., 2. és 3. vegyületek mennyiségi meghatározásához. A hőmérsékletet az erjedés során 34 6CC-on tartottuk, a keverést 200 rpm-en történő keveréssel biztosítottuk, a pH-t pedig 5,0 felett tartottuk 3 m NH4OH automatikus hozzáadásával. Az anaerob körülmények fenntartása érdekében az oxigénmentes nitrogéngázt 2 sL/h sebességgel sparráltuk az erjedés időtartama alatt. Az 1., 2. és 3. vegyületek mennyiségi meghatározásához 1 mL fermentációs táptalajt 3 mL etil-acetáttal összekeverünk, örvénylünk, centrifugálással elválasztjuk (2700 db g, 10 perc, szobahőmérséklet), majd a felső szerves réteget izoláljuk. A szerves réteget rotációs bepárlással szárítottuk, reszuszpendáltuk 200 Ft-ban metanol, és 20 Ft-ot injektáltunk egy Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (DAD-val) eszközre, amely Agilent Eclipse Plus C18 oszlopot (4,6 ft 100 mm) kapott. 2-98% ch3cn (vol/vol) lineáris gradienst használtunk 40 perc alatt H2O-ban 0,1% hangyasavval (vol/vol) 0,5 mL/perc áramlási sebességgel. Az 1., 2. és 3. vegyületeket UV-abszorpcióval (240 nm) azonosítottuk, amint azt az ábra mutatja. 1b, és számszerűsítették az integrált csúcsterület (abszorbancia 240 nm-en).

fermentációs analitikai eljárások

spektrofotométert használtunk a sejtek sűrűségének meghatározására az optikai sűrűség 600 nm-en történő mérésével (OD600). A C elemzéséhez Biorad Aminex HPX-87H oszloppal (300 mm 6,8 mm) ellátott Shimadzu kiemelkedő UFLC rendszert használtunk. acetobutylicum fermentációs húsleves glükóz és fermentációs termékek (acetát, butirát, Laktát, aceton, butanol és etanol) koncentrációjához. A fermentációs táptalaj mintáit (1 mL) először 10 000g-n 3 percig tartó centrifugálással pelletáltuk, majd a felülúszót 0,22 mikronos PVDF fecskendőszűrővel szűrtük. A szűrt felülúszó (20 6L) mintákat 0,01 N kénsav mozgófázissal injektáltuk az UFLC rendszerbe, amely 0,7 mL/perc sebességgel áramlott, oszlophőmérséklete 35 C volt, és 35 percig kromatográfiás vizsgálatnak vetettük alá. Az analitokat törésmutató-detektorral (a glükóz, acetát, Laktát, butanol és etanol koncentrációjának számszerűsítésére) és diódarendszer-detektorral (a butirát (208 nm) és az aceton (265 nm) koncentrációjának számszerűsítésére) detektálták.

RNS izolálás és RNS-Seq analízis

a fermentációs táptalajból vett mintákat (10 mL) biológiai három példányban vad típusú bioreaktor fermentációkból, valamint a PKS C. acetobutylicum 26 órával az oltás után. A mintákat centrifugáltuk (4000 db g, 10 perc, 4 db C), majd a pelleteket reszuszpendáltuk és rnaprotect Cell reagensben (Qiagen) tároltuk. A teljes RNS-t egy rneasy Mini Kit (Qiagen) segítségével extraháltuk a gyártó utasításai szerint. Az oszlopon végzett DNáz kezelést DNase I (RNase-free) (NEB) alkalmazásával végeztük. Az RNS minőségellenőrzést, a könyvtárépítést és a könyvtári szekvenálást a Kaliforniai Egyetem-Berkeley QB3 funkcionális genomikai laboratóriuma és Vincent J. Coates genomikai szekvenáló laboratórium végezte. Az RNS minőségét és koncentrációját egy nanochip segítségével értékelték egy Agilent 2100 Bioanalizátoron. A bakteriális 16S és 23S rRNS-t RiboZero Kit (Illumina) segítségével távolítottuk el. A kapott messenger RNS-t (mRNS) átalakítottuk RNS-Seq könyvtárrá egy mRNS-Seq könyvtár építőkészlet (Illumina) segítségével. RNS könyvtár szekvenálást végeztünk egy Illumina HiSeq4000-en, 50 bp egyetlen végű olvasással. A szekvenálási leolvasásokat (50 bp) feldolgoztuk és leképeztük a C. acetobutylicum ATCC 824 genomra (NCBI csatlakozás NC_003030.1 és NC_001988.2 ) a CLC Genomics Workbench 9.0 használatával, alapértelmezett paraméterekkel. Azokat az olvasmányokat, amelyek nem igazodtak egyedülállóan a genomhoz, elvetették. A vad típusú és a PKS C. acetobutylicum közötti génexpresszió különbségeit ugyanezzel a szoftverrel számítottuk ki. A géneket differenciáltan expresszáltnak tekintették, a p-érték < 0,003 (párosítatlan t-teszt alapján, n = 3) és |normalizált hajtásváltozás |> 2,0. A p-értékek hamis felfedezési sebességkorrekcióit a CLC Genomics Workbench 9.0-ban számítottuk ki egy közzétett módszerrel73. Az RNS-Seq analízis eredményeit az 1. Kiegészítő adatok tartalmazzák. STRING analysis30-at végeztünk a feltételezett fehérje–fehérje kölcsönhatások meghatározására az RNS-Seq elemzéssel feltárt differenciálisan expresszált gének között.

fenotípus összehasonlító vizsgálatok

folyékony sporulációs vizsgálatokat végeztünk kisebb módosításokkal74. A mintákat biológiai triplikátumú folyékony tenyészetekből vettük 5 napos inkubálás után (30 mL CBM-S, 37 Kb C). A 20 db (60 db C, 10 perc), hőkristályos mintákat (101-106) 2xytg lemezeken észleltünk, és a kolóniákat 30 óra inkubálás után (37 db C) számoltuk ki a hőálló kolóniaképző egységek (cfu/mL) számának kiszámításához. A folyékony sporulációs vizsgálatban a PPK-k kémiai kiegészítésére tisztított klostrienózt (végső koncentráció 3,5 Ft) egészítettünk ki cbm-s tenyészetekben a beoltás időpontjában. Mivel a 3. vegyületet metanolban koncentrált oldatként adtuk hozzá, az összes többi folyékony sporulációs vizsgálati tenyészethez (vad típusú és nem kiegészített PPK) az ekvivalens térfogatú metanolt (60 6L) adtuk e hatás kontrollálására.

szilárd sporulációs vizsgálatokhoz egy korábban leírt módszert75 alkalmaztunk néhány módosítással. Részletesen, hővel sokkolt (80 6c, 10 perc) az egyes kolóniákat folyékony közegben (10 mL CGM, 37 C) tenyésztettük 24 órán át.a tenyészeteket 106-szorosával hígítottuk, és szilárd CBM-re vontuk. A mintavételt 1, 2, 3, 4 és 6 nappal a kezdeti bevonást követően végeztük. A mintavételhez három különálló kolóniát kombináltunk és alaposan reszuszpendáltunk 60 MHz-es folyékony CGM – ben. A reszuszpendált kolóniakeverékből 20 6L-t ezután hőre sokkoltunk (80 C, 10 perc), hígításokat (101-106) észleltünk 2xYTG lemezeken, és a kolóniákat 30 óra inkubálás után (37 C) számoltuk a hőálló kolóniaképző egységek (cfu/kolónia) számának kiszámításához. Minden mintát biológiai triplikátumként végeztünk.

Granulóz akkumulációs vizsgálatokat jódfestéssel végeztük53. A közepes log fázisú (OD600 ~0,6) folyékony tenyészeteket (P2, 37 Kb C) szilárd 2xytg táptalajon, magas glükózszinttel (50 g/L) vontuk be a granulóztermelés lehetővé tétele érdekében. A lemezeket inkubáltuk 30 kb 4 napok, ekkor megfestették őket egy jódkristályos ágynak való kitettséggel 10 min. A lemezeket ezután 10 percig hagytuk lebomlani a képalkotás előtt. A granulóz akkumulációs vizsgálatban a PPK kémiai kiegészítésére a tisztított klostrienózt (a végső lemezkoncentráció 4,0 ppm) szilárd 2xytg lemezekbe ágyaztuk, mielőtt a PPK tenyészetet bevonjuk. Mivel a klostrienózt a 2xytg-os lemezekhez metanolban koncentrált oldatként adtuk (a megszilárdulás előtt az olvadt közegbe keverve), az ekvivalens térfogatú metanolt (6 ~ ml) adtuk az összes többi 2xytg-os lemezhez, amelyet a granulóz akkumulációs vizsgálatokban használtak ennek a hatásnak a szabályozására.

a C. acetobutylicum egyes kolóniáit CBM lemezeken 48 órán át (37 6CC) tanulmányozták és lefényképezték Leica MZ16 F boncoló mikroszkóppal, Leica DFC300 FX kamerával felszerelve.

Olajterpesztési vizsgálatokat végeztünk a korábban leírtak szerint76,77,78. Részletesen, egy 400 mL-es üvegpoharat (7,5 cm Belső átmérő) töltöttünk meg 300 mL vízzel, és egy 10 6 liter csepp paraffin lámpaolajat adtunk hozzá, és hagytuk, hogy 5 perc alatt (~25 mm átmérőjű) vékony filmre terjedjen a víz felszínén. Felületaktin, tisztított klostrienóz és kálium-foszfát puffer kontroll oldatokat készítettünk a megadott pH-n és koncentrációban (10 mM-es kálium-foszfát pufferben készítve). Körülbelül 10 6L mintát óvatosan adtunk az olajfólia közepéhez, és megfigyeltük az olajfóliára gyakorolt hatást. A felületaktív aktivitású minták várhatóan stabil kör alakú tisztító zónákat képeznek az olajfóliában, a nagyobb tisztító zónáknak megfelelő erősebb felületaktív aktivitással (vagy az olajfólia teljes diszperziójával a nagyon magas felületaktív aktivitás érdekében). Drop collapse vizsgálatokat végeztünk77,79, 80. A 96 mikrowell lemez polisztirol fedelén belül (8 mm belső átmérő) lévő kör alakú mikrowellákat (12,7 6,5 cm) vékony réteg paraffin lámpaolajjal vontuk be úgy, hogy mindegyik lyukba 2,0 6L paraffin lámpaolajat adtunk, és hagytuk, hogy a csepp egyenletesen eloszlasson a mikrowellen egy 1 órás időszak alatt. Felületaktin, tisztított klostrienóz és kálium-foszfát kontroll mintákat készítettünk, mint az olajterjesztési vizsgálatokhoz. Körülbelül 5 6 liter mintát óvatosan adtunk a mikrowell közepéhez. 5 perc elteltével megfigyeltük a csepp alakját és terjedési fokát. Míg a puffervezérlők várhatóan stabil gyöngyöket képeznek a mikrowell felületén, a felületaktív anyagot tartalmazó minták várhatóan összeomlanak és elterjednek a mikrowell felületén, erősebb felületaktív aktivitással, amely nagyobb cseppterjedésnek felel meg.

PKS fehérje tisztítása és in vitro elemzése

a his6-tagged PKS fehérje in vitro analízis céljából történő tisztításához a pET24b_pks-t E. coli BAP1-vé alakítottuk át. Egyetlen kolóniát oltottunk be 10 mL LB + 50 6G/mL kanamicinbe (Kan) az éjszakai növekedéshez 37 C. körülbelül 7 mL éjszakai tenyésztést használtunk 700 mL 50 g/mL Kan beoltásához, és a tenyészetet 240 fordulat / perc sebességgel és 37 Kb / C sebességgel ráztuk, amíg az OD600 0,5 értéket el nem érte. Miután a tenyészetet 10 percig jegesítettük, izopropil-tio-D-D-galaktozidot (IPTG) adtunk 0 végső koncentrációhoz.1 mM-t a fehérje expressziójának kiváltására, majd a tenyészetet 16 6CC-on 16 órán át inkubáltuk. a sejteket centrifugálással (5500 g, 4CC, 20 perc) kinyertük, 25 mL lízis pufferben (25 mm HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazol) reszuszpendáltuk, és jégen történő homogenizálással lizáltuk. A sejttörmeléket centrifugálással távolítottuk el (17 700 db g, 4 db C, 60 perc), majd Ni-NTA agaróz gyantát adtunk a felülúszóhoz (2 mL/L tenyészet). Az elegyet 4CC-n 1 órán át nutáltuk, gravitációs áramlási oszlopra töltöttük, és a PKS fehérjét az imidazol növekvő koncentrációival eluáltuk az a pufferben (20 mM HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). A tisztított PKS fehérjét koncentráltuk, és a puffert Vivaspin centrifugális koncentrátor segítségével a + 10% glicerin Pufferré cseréltük. A tisztított PKS fehérje alikvotjait alikvotáltuk és folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk. A hozzávetőleges fehérjehozam 5 mg/L (203 kDa) volt.

PKS terhelési vizsgálat 14C-vel jelölt szubsztrátummal, összesen 15 kb, 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0 térfogatban.5 mM CoA, 2-14C-malonsav (0,1 6c), 10 mm MatB, 17 mm PK és 50 mM HEPE, pH 8,0. 2 óra inkubálás után 25 6CC-nél, a mintákat egyenlő térfogat hozzáadásával leállítottuk 1 6c SDS mintapuffer. 4-15%–os TGX géllel (kritérium) végzett SDS-oldal analízist követően a gélt 2 órán át szárítottuk 50 6CC-on, majd egy tároló foszforszűrőn (20 25cc; Molekuladinamika) 5 napon át kitettük. A radioizotópos fehérjét egy Typhoon 9400 foszforimager-en (Storage Phosphor mode, 50 MHz felbontás; Amersham Biosciences) ábrázoltuk.

a PKS fehérje in vitro termékvizsgálataihoz (50 6L) 8 mm PKS-t inkubáltunk malonil-CoA-val (2 mM) foszfátpufferben (100 mM, pH 7,0) szobahőmérsékleten 2 órán át, hogy a 4.vegyületet előállítsuk, amelyet egy kémiai standarddal összehasonlítva azonosítottak. NADPH-t (2 mM) adtunk a vizsgálathoz, hogy az 5-ös és 6-os vegyületeket hozzuk létre, amelyeket a kémiai standardokkal összehasonlítva azonosítottak. Inkubálást követően a vizsgálati keverékeket kétszer extraháltuk 100 db 69% – os etil-acetát/1% – os ecetsavval (v/v). A szerves kivonatokat szárítottuk és reszuszpendáltuk 100 db 6120 db Quadrupole LC-MS-re (DAD-val), Agilent Eclipse Plus C18 oszloppal (4,6 db 100 mm). 2-98% ch3cn (vol/vol) lineáris gradienst használtunk 40 perc alatt H2O-ban 0,1% hangyasavval (vol/vol) 0,5 mL/perc áramlási sebességgel. A vizsgálati kivonatok LC-HRMS elemzését Agilent Technologies 6520 pontos tömegű QTOF LC-MS műszeren végeztük, Agilent Eclipse Plus C18 oszloppal felszerelve (4.6-100 mm ) a fent leírt oldószergradiens és áramlási sebesség alkalmazásával.

adatok rendelkezésre állása

az ebben a tanulmányban generált RNS-seq adatokat az ArrayExpress-ben (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) helyezték el az e-MTAB-6019 csatlakozási szám alatt. Minden egyéb releváns adat kérésre rendelkezésre áll a szerzőktől.