a Klemizol és a szerotonin jelátvitel modulátorai elnyomják a rohamokat Dravet-szindrómában

absztrakt

a Dravet-szindróma katasztrofális gyermekkori epilepszia, korai rohamokkal, késleltetett nyelvi és motoros fejlődéssel, alvászavarokkal, szorongásszerű viselkedéssel, súlyos kognitív deficittel és fokozott halálozási kockázattal. Elsősorban az scn1a gén de novo mutációi okozzák, amelyek neuronális feszültséggel aktivált nátriumcsatornát kódolnak. Az SCN1A homológban mutációval rendelkező zebrahal a spontán görcsaktivitást összegzi, és utánozza a Dravet-szindrómában megfigyelt görcsös viselkedési mozgásokat. Itt megmutatjuk, hogy a zebrafish scn1 mutánsok gyógyszerkönyvtárainak fenotípusos szűrése gyorsan és sikeresen azonosítja az új terápiákat. Bizonyítjuk, hogy a klemizol kötődik a szerotonin receptorokhoz, és antiepileptikus aktivitását a szerotonin jelátviteli útvonalakra ható gyógyszerek, például a trazodon és a lorcaserin utánozhatják. Ezekkel a zebrafish megállapításokkal egyidejűleg öt, orvosilag kezelhetetlen Dravet-szindrómás beteget kezeltünk klinikailag jóváhagyott szerotonin receptor agonistával (lorcaserin, Belviq), és ígéretes eredményeket figyeltünk meg a rohamok gyakoriságának és/vagy súlyosságának csökkenése szempontjából. Eredményeink gyors utat mutatnak a zebrafish preklinikai felfedezésétől a célazonosításon keresztül a Dravet-szindróma lehetséges klinikai kezeléseihez.

Bevezetés

a katasztrofálisnak minősített gyermekkori epilepsziák gyakran genetikai mutációval társulnak. Ezek közül a Dravet-szindróma több mint 600 de novo mutációhoz kapcsolódik egyetlen génben, az SCN1A-ban (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). A Dravet-szindrómában szenvedő gyermekek már 6 hónapos korukban görcsrohamokat, késleltetett nyelvi és motoros fejlődést, alvászavarokat, szorongásszerű viselkedést és súlyos kognitív deficitet mutatnak (Dravet, 2011). Az autizmus spektrum zavar tüneteiről is beszámoltak (Li et al., 2011) és az epilepsziával járó hirtelen megmagyarázhatatlan halálozás (SUDEP) kockázata ebben a populációban 15-szer magasabb, mint más gyermekkori epilepsziáknál (Kearney, 2013). A rendelkezésre álló antiepileptikumok nem nyújtanak megfelelő rohamkontrollt, és a reszektív idegsebészeti eljárások általában nem választhatók. A Dravet-szindróma Új kezelése továbbra is fontos kielégítetlen szükséglet, annak ellenére, hogy a kannabidiol (Epidiolex) és a stiripentol (Diacomit) korlátozott klinikai vizsgálataiban bizonyos szintű hatékonyság állt fenn, ami kognitív vagy étvágybiztonsági aggályokkal járhat (Perez et al., 1999; Chiron et al., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky et al., 2016).

mutációk az SCN1A-ban, a feszültségfüggő nátriumcsatorna pórusképző (Nav1.1) alegységét kódoló génben a Dravet-szindrómában szenvedő betegek közel 85%-ánál azonosították (Dravet, 2011). A Nav1.1 csatornák hozzájárulnak a neuronális membránok gyors depolarizációjához az akciós potenciál generálása során (Hodgkin et al., 1952). A Nav1.1-ben a funkcióvesztés mutációjára heterozigóta egerekben spontán és hőmérséklet-érzékeny rohamok alakulnak ki az élet korai szakaszában, és idő előtt elhalnak a 25.születés utáni nap körül (Yu et al., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Ezekben és a kapcsolódó Scn1a-hiányos egerekben végzett akut elektrofiziológiai vizsgálatok a nátrium áramsűrűségének csökkenését és a GABA-expresszáló gátló neuronok (de nem gerjesztő fő sejtek) szubpopulációjának tüzelési aktivitásának ezzel összefüggő csökkenését sugallják, ami csökkent szinaptikus gátlással és hálózati hiperexcitabilitással végződik (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Ez az ‘interneuronopathia’ hipotézis összhangban van a katasztrofális gyermekkori epilepsziák más formáival, és egerekben megerősítették, ahol az Scn1a szelektíven törlődött a parvalbumint vagy szomatosztatint expresszáló interneuron szubpopulációkból (Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). Autista-szerű viselkedésről is beszámoltak ezekben az egerekben (Han et al., 2012). Érdekes módon az indukált pluripotens őssejt-technológiával nyert humán gerjesztő és gátló neuronok kezdeti tanulmányai Dravet-szindrómában szenvedő két beteg feszültség-aktivált nátriumáramának hiányáról számoltak be mindkét sejttípus esetében, ami vagy homeosztatikus kompenzációra utal a kritikus agy-specifikus nátriumcsatorna korai funkcióvesztése, vagy további mechanizmusok, amelyek hozzájárulnak az ezekben a betegekben megfigyelt epilepsziás fenotípushoz (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013).

bár az egerek és az ember által indukált pluripotens őssejt-eredetű neuronok hozzájárulnak a Dravet-szindróma mögöttes patofiziológiájának megértéséhez, ezek a rendszerek nem alkalmasak az új terápiák gyors azonosítására e modellek variabilitása és a kvantitatív mérések reprodukálhatósága miatt. Mivel a zebrafish ideális gerinces Modellrendszer kis molekulájú fenotípus alapú képernyők végrehajtására (MacRae et al., 2015), és alkalmasak a genetikai manipulációkra, erőfeszítéseinket egy zebrafish nátrium-csatorna mutánsra összpontosítottuk. Az SCN1A ortológusban, az scn1Lab-ban funkcióvesztéses missense mutációt hordozó zebrafish mutánsokat egy mutagenezis képernyőn azonosítottuk (Schoonheim et al., 2010). Az ősi teljes genom duplikációja miatt a zebrafish scn1Lab mutánsok haploinsufficient a Nav1.1 számára, és hasonlóak az Scn1a+/− egerekhez vagy a Dravet-szindrómás betegekhez. A mutáns lárvákban már 3 nappal a megtermékenyítés után (dpf) görcsös viselkedést és rövid interiktális és hosszú időtartamú poliszpike-iktal-szerű elektrográfiai kisülést figyeltek meg, 4 és 7 dpf közötti robusztusabb roham-fenotípusokká fejlődve (Baraban et al., 2013; Hong et al., 2016). A mutáns lárvák idő előtt elpusztulnak, metabolikus hiányt mutatnak (Kumar et al., 2016), és ellenáll számos antiepileptikumnak (AED) (Dinday et al., 2015). A Dravet-szindróma klinikai kezeléséhez hasonlóan a rohamok aktivitásának némi csillapítása valproáttal, benzodiazepinekkel, bromidokkal, stiripentollal, valamint ketogén étrenddel (Baraban et al., 2013). Az scn1Lab mutáns zebrafish lárvák és egy kétlépcsős fenotípus alapú szűrési stratégia segítségével több mint 2300 vegyületet szűrtünk. A klemizolt, az első generációs hisztamin receptor (H1) antagonistát a viselkedési és elektrográfiai rohamok aktivitásának hatékony gátlójaként azonosították (Baraban et al., 2013). Az antihisztaminok azonban ellenjavallt gyermek epilepsziás populációkban (Miyata et al., 2011) és a zebrafish H1 receptor analógja kevesebb mint 50% – os hasonlóságot mutat az emberrel (Peitsaro et al., 2007). Itt preklinikai zebrafish modelleket használunk annak bizonyítására, hogy a klemizol, de nem antihisztaminok, antiepileptikus hatást fejtenek ki. Az scn1 mutáns zebrafish ligandumkötése és további célzott gyógyszerszűrése alapján SZÁMOS szerotonin (5-HT) modulátort azonosítottunk a rohamok elnyomásában, köztük két (trazodon és lorcaserin) FDA által jóváhagyott vegyületet. A Dravet-szindrómás gyermekeknek a lorcaserint (Belviq) egy engedélyezés előtti kezelési program keretében írták fel, és néhány betegnél csökkent görcsaktivitást eredményezett. Javasoljuk, hogy az 5-HT jelátvitel modulációja új terápiás beavatkozást jelent ennek a katasztrofális gyermekkori epilepsziának.

anyagok és módszerek

zebrafish karbantartás

Rohamfigyelés

5 dpf-nél az egyes zebrahal lárvákat egy tiszta, lapos fenekű, 96 lyukú mikrolemez egyetlen kútjába helyeztük, amely embrionális táptalajt tartalmazott. A lárvákat véletlenszerűen választottuk ki, mivel a nemek meghatározása ebben a szakaszban nem lehetséges. A mikrolemezeket a DanioVision mozgáskövető készülék belsejébe helyezték, és szobahőmérsékleten 20 percig akklimatizálták. Minden egyes kúthoz 10 perces felvételi periódus alatt helyváltoztatási parcellákat kaptunk az EthoVision XT szoftvert futtató DanioVision rendszer segítségével (DanioVision, Noldus Informatika); a háttérnél sötétebb objektumok azonosítására szolgáló küszöbérték-észlelési beállításokat minden kísérlethez optimalizálták. A rohamok pontozását a pentilénetetrazol által kiváltott rohamokra megállapított következő háromfokozatú skála alkalmazásával végeztük (Baraban et al., 2005): 0.szakasz, nincs vagy nagyon kevés úszási tevékenység; I. szakasz, fokozott, rövid úszási aktivitás; II. szakasz, gyors örvényszerű köröző úszási viselkedés; és III. szakasz, paroxizmális egész test klonus-szerű görcsök, és rövid testtartás elvesztése. A vad típusú halakat általában a 0. vagy az I. szakaszban pontozzák. A parcellákat a megtett távolság (milliméterben) és az átlagos sebesség (milliméterben másodpercenként) alapján elemezték. Amint arról korábban beszámoltunk (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), a sebességváltozások voltak a rohamok viselkedésének legérzékenyebb vizsgálata.

az elektrofiziológiai vizsgálatok során a zebrahal lárvákat rövid időre lebénították (1 mg/ml) és immobilizálták 1,2% agarózban; a helyi mezőpotenciál-felvételeket az előagy struktúráiból nyerték egyelektródástechnikával, amint azt korábban leírtuk (Baraban et al., 2005; Hong et al., 2016). Agarózba ágyazott helyi terepi potenciális felvételi munkameneteket kaptunk 10 nak nek 30 perc minden hal esetében 1 kHz-en. Az iZAP rendszer (Hong et al., 2016) a zebrafish hosszú távú, nem invazív monitorozására használták bénító szer hiányában. A rendszer önállóan csapdába ejti a zebrafish lárvákat több integrált felületi elektróda alatt a mikrofluidikus kamrákban. az scn1Lab lárvákat folyamatosan monitoroztuk 5 órán keresztül. az elektromos térpotenciált folyamatosan 1 kHz – en rögzítettük, kivéve az összetett kezelés és mosás közegcseréjének 2-3 perces szüneteit. A rögzített adatokat Matlab segítségével elemeztük mezőpotenciál grafikonokhoz és frekvenciaelemzéshez.

Compound library screening

a kábítószer-szűréshez használt vegyületeket a Selleck Chemicals-tól vásárolták, és 10 mM-es DMSO oldatokként biztosították. Selleck ioncsatorna Ligand könyvtárát (Catalogue #L2700), GPCR összetett könyvtárát (Catalogue #L2200) és egy testreszabott 5-HT moduláló könyvtárat használtak a szűréshez. A könyvtári vegyületeket az 1. Kiegészítő táblázat sorolja fel. Az összes gyógyszerkönyvi képernyőn a vegyületeket kódolták, és kísérleteket végeztek olyan nyomozók, akik vakok voltak a vegyület természetére. A mozgási viselkedés kiindulási felvételeit az embrióközegben lévő mutánsokból nyertük, a fent leírtak szerint; ezután egy második mozgási ábrát kaptunk, miután az oldatot tesztvegyületre változtattuk, és 20 perces egyensúlyi időszakot végeztünk. A mozgásvizsgálatokhoz használt vegyületeket embrionális táptalajban oldottuk fel, és 250 mm-es koncentrációban vizsgáltuk, a végső DMSO-koncentráció 2,5% volt.

a pozitív találati jelölés kritériumai a következők voltak: i.az átlagos sebesség 40% – os csökkenése; és ii. a vizsgált halak legalább 50% – ánál a 0. vagy I. stádiumú roham viselkedésének csökkenése a mozgásterületen. A mozgásvizsgálatban pozitív találatként besorolt valamennyi vizsgálati vegyületet a toxicitás szempontjából sztereomikroszkópon történő közvetlen megjelenítéssel értékeltük 90 perc gyógyszer-expozíciót követően. A toxicitást (vagy mortalitást) úgy határozták meg, hogy a vizsgált halak legalább 50% – ánál nem volt látható szívverés vagy mozgás a külső stimulációra adott válaszként. A hiperexcitabilitást olyan vegyületként határozták meg, amely a vizsgált halak legalább 50% – ában az úszási sebesség és/vagy a III.stádiumú roham aktivitásának 60% – os növekedését okozza. Az elsődleges mozgásszűrőn azonosított pozitív találatokat a mozgásszűrési módszerrel igazoltuk egy második vizsgálatban, független zebrafish tengelykapcsolóval. A vegyületeket ezután külön vásárolták meg a Sigma-Aldrich – től, és harmadik alkalommal tesztelték a mozgásszűrési módszerrel a zebrafish független tengelykapcsolóján. Azokat a gyógyszereket, amelyek csökkentették az átlagos úszási sebességet a küszöb felett, és nem voltak toxikusak a három független mozgásvizsgálatban, tovább elemeztük az elektrofiziológiai vizsgálat segítségével. Az elektrofiziológiai vizsgálatokban a gyógyszereket először 250-es koncentrációban igazolták 6m mozgásvizsgálattal, majd ugyanazt a zebrafish-t lokális mezőpotenciál-felvétel segítségével értékelték. Az összes szűrést kódolt vegyületekkel végezték, és a kutatók elemezték a vegyület azonosságát.

filogenetikai analízis

humán HTR2 és zebrafish htr2 fehérjeszekvenciák filogenetikai analízisét a PhyML szoftverrel az SH-szerű valószínűség-Arány tesztparaméterek (http://www.phylogeny.fr/) alatt végeztük (Dereeper et al., 2008). A fehérjeszekvenciákat az ensembl humán HTR2A (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198) és zebrafish htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ensdart00000104569), HTR2CL1 (ENSDART00000024191) szekvenciák.

Kvantitatív, valós idejű mRNS expressziós analízis

a zebrafish htr2 gének expressziós szintjét 25 fejből vagy farkból, 5 DPF vad típusú vagy scn1Lab homozigóta mutáns lárvából, valamint az egyes vad típusú hím zebrafish egyedeinek boncolt agyából gyűjtött RNS-sel vizsgáltuk. A teljes RNS-t a gyártó protokolljának megfelelően Trizol (Invitrogen) reagenssel extraháltuk, majd DNase I-vel (Invitrogen) kezeltük. A tisztított mRNS-t retrotranszkripcióval cDNS – re írtuk át felső index alkalmazásával 6 III első szálú szintézis rendszer (Invitrogen) oligo(dT)20 keverékével. A zebrafish htr2 gének és a housekeeping gén eukarióta transzlációs megnyúlási faktor 1 alfa-1, mint az 1 (eef1a1l1) expressziós szintjét egy StepOne-nal határoztuk meg egy valós idejű PCR gép (alkalmazott Biosystems). A reakciókat 20 db 66 lyukú lemezeken 250 nm-es alapozóval és 3 db cDNS-sel végeztük SYBR (alkalmazott Biosystems) használatával. Az oligonukleotid szekvenciákat a 2. Kiegészítő táblázat tartalmazza. Az adatokat három független kísérletből elemezték. Az adatokat Ct-értékekben fejeztük ki, és az adatok alapján határoztuk meg a DCT-értékeket.

humán vizsgálatok

a zebrafish modellünkben lévő vegyületek sikeres azonosítása és a farmakokinetika megfontolása után a gyermekeket Belviq (lorcaserin) írták fel a Colorado Gyermekkórházban (IND 125307). Gyermekek jogosultak a Belviq GmbH-ra, ha SCN1A mutációval vagy Dravet-szindróma klinikai diagnózisával rendelkeztek, és néhány esetben legalább két gyógyszer, köztük a stiripentol, és a nátriumcsatorna-blokkolók kivételével, kudarcot vallottak. A gyermekeknek elektrokardiogramot és echokardiogramot kellett készíteniük a kezelés megkezdésekor és 6 havonta a készítmény alkalmazása során. Ezenkívül 3 havonta utólagos látogatásokat kellett végezniük a megfelelő növekedés biztosítása, valamint a további mellékhatások felmérése érdekében. 6 havonta laboratóriumi vizsgálatra volt szükség a hematológiai, a májfunkciós és a vesefunkció vizsgálatához. A Belviq GmbH adagját lefekvéskor 2,5 mg-mal kezdték, majd szükség szerint hetente fokozatosan növelték a maximális napi kétszeri 10 mg—os vagy napi 0,3 mg/ttkg-os adagig-attól függően, hogy melyik következett be előbb.

intézményi felülvizsgálati testület jóváhagyást kapott a visszamenőleges adatgyűjtéshez, beleértve a beleegyezésről való lemondást. Az adatokat a coloradói Gyermekkórház elektronikus orvosi nyilvántartásainak retrospektív felülvizsgálatából nyerték ki, beleértve a Belviq használata előtti és utáni életkorot, rohamtípusokat és gyakoriságot, a nemkívánatos eseményeket, a Belviq dózisát és az egyidejű gyógyszerhasználatot.

Statisztikai analízis

az adatokat az átlag (sem) átlagának (mean) standard error-jaként mutatjuk be, hacsak másként nem jelezzük. Két csoport összehasonlításához a hallgató t-tesztjét használtuk. Ha a varianciának nem volt normális eloszlása, akkor a nem paraméteres Mann-Whitney U-tesztet használtuk. Egyirányú ANOVA vagy Dunnett többszörös összehasonlító tesztje után az elemzéshez egy kontrollminta ellen, vagy Holm-Sidak páros többszörös összehasonlítások az eszközök között. A statisztikailag szignifikáns különbségeket csillagokkal jelöljük (*P < 0,05; * * P < 0,01).

eredmények

a klemizol hatása a rohamok viselkedésére zebrahalban

az scn1Lab mutáns lárvákat (5 dpf) klemizollal kezeltük 30 és 400 km közötti koncentrációban, majd automatizált mozgáskövető szoftver segítségével nyomon követtük a spontán rohamok viselkedésére gyakorolt hatást. A kezeletlen scn1Lab mutánsokon végzett 250 ismételt mozgáskontroll vizsgálat alapján az átlagos úszási sebesség (>1, 5 db) kiindulási értékhez viszonyított csökkenését határozták meg a görcsös viselkedés pozitív szuppressziójának küszöbértékeként. Klemizol (Ábra. 1A) mutatott antiepileptikus aktivitás 300 és 400 (30 perces expozíció) és 100 (90 perces expozíció) (ábra. 1B); a hosszabb expozíció a magasabb koncentrációknál mérgező volt. Annak megállapítására, hogy a klemizol képes-e elnyomni a spontán rohamok viselkedését egy második zebrafish scn1 mutánsban, átvilágítottuk a mutáns scn1Laa lárvákat (5 dpf) a mozgáskövetési vizsgálatban. A lárvák III. stádiumú görcsrohamként azonosítottak (pl. teljes test görcsök, nagy sebességű úszási aktivitás és rövid ideig tartó testtartás elvesztése; Fig. 1C) megerősítették, hogy elektrográfiai kisüléseket mutatnak interictal-és ictal-szerű komponensekkel az előagy későbbi terepi felvételein (ábra. 1D). Átlagos úszási sebesség lárvák azonosított S3 vagy ‘feltételezett scn1Laa mutánsok’ zebrafish szignifikánsan magasabb volt, mint a testvér kontrollok, vagy az összes lárvák vizsgált (ábra. 1E); a mutánsokat scn1laa homozigótákként igazolták post hoc PCR-rel. Ezután olyan gyógyszereket teszteltünk, amelyekről korábban kimutatták, hogy elnyomják a spontán rohamokat a Dravet-szindrómában és az scn1Lab mutánsokban (250 db stiripentol és 250 db diazepam), valamint 250 db lamotrigint (AED, amely súlyosbíthatja a rohamokat a Dravet-szindrómában). Amint az várható volt, a stiripentol és a diazepám, de a lamotrigin nem, szignifikánsan elnyomta a görcsroham viselkedését scn1Laa mutáns lárvákban; 250 MHz klemizol is hatásos volt ebben a vizsgálatban (ábra. 1F). Ezek a vizsgálatok együttesen azt mutatják, hogy a klemizol két különböző scn1 mutáns zebrafish vonalban elnyomhatja a rohamok viselkedését.

a klemizol hatásmechanizmusának vizsgálata

az scn1lab mutánsok

tercier szűrés az ígéretes ólomvegyületek azonosítására a klinikán

5-HT receptor expresszió a zebrafish lárvákban

mivel a klemizol jelentős kötődési affinitással rendelkezik a HTR2A-hoz és a HTR2B-hez, és mind a trazodon, mind a lorcaserin 5-HT jelátviteli modulátorok, igyekeztünk megerősíteni ezen receptorok expresszióját a zebrafish-ban. A humán és a zebrafish htr2 receptorok fehérje szekvenciájának összehangolása evolúciós konzervációt mutatott a zebrafish ortológusokkal, a Htr2aa és a Htr2ab egyaránt 59,3% – os fehérje azonosságot mutatott az emberi HTR2A-val; és egyetlen HTR2B ortológus, a Htr2b 62,0% – os fehérje azonosságot mutatott. A htr2 expressziós szint mennyiségi meghatározása 5 dpf vad típusú vagy scn1Lab mutáns lárva izolált fejének vagy farkának felhasználásával dúsított htr2a és htr2cl1 expressziót mutatott ki a fejben. Hasonló eredményeket kaptunk a felnőtt vad típusú zebrafish agyból, mivel a mutáns lárvák nem élnek túl felnőttkorig (kiegészítő ábra. 4).

a rohamok gyakoriságának csökkenése Dravet-szindrómás betegeknél

a Dravet-szindróma katasztrofális gyermekkori epilepszia és ritka rendellenesség (http://www.rarediseases.org/), amely legyengítő kimenetelű, beleértve a kezelhetetlen epilepsziát, a súlyosan korlátozott kognitív fejlődést és a SUDEP kockázatát. Preklinikai adataink megerősítik, hogy az 5-HT jelátvitel modulációja elnyomhatja az SCN1A funkcióvesztéssel járó rohamokat mutációk. Mivel az azonosított 5-HT modulátorok az FDA által jóváhagyott, ismert biztonsági profilú vegyületek, az ezekkel az újrafelhasznált gyógyszerekkel történő kezelés megváltoztathatja a rohamok gyakoriságát Dravet-szindrómás gyermekeknél. Ez a transzlációs megközelítés olyan ritka és pusztító betegségeket céloz meg, amelyek esetében a nagyszabású klinikai vizsgálatok nem megvalósíthatók (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

mivel a klemizolt jelenleg nem gyártják vagy klinikai minőségű formában nem kapható, és a trazodon a koncentrációtól függően 5-HT receptor agonistaként vagy antagonistaként működhet (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998), úgy döntöttünk, hogy értékeljük a Belviq-t (lorcaserin) együttérző használat mellett off-label program a Dravet-szindrómás gyermekek kis populációjában. Kimutatták, hogy ezek a gyermekek legalább öt jóváhagyott AED-vel szemben rezisztensek. Öt gyermek (átlagéletkor: 11,8 év; tartomány: 7-18 év) heterozigóta delécióval az SCN1A-ban prospektív módon kezeltek Belviq-val, majd hosszirányban követték a coloradói Gyermekkórházban (Aurora, CO). A kezelési protokollt a Colorado orvosi intézményi felülvizsgálati testület (COMIRB) hagyta jóvá, a Dravet-szindrómás betegek szülei pedig írásban beleegyeztek gyermekük részvételébe. Retrospektíven áttekintettük az atonikus, myoclonusos és generalizált tónusos-klónusos (GTC) rohamok, mellékhatások és egyidejű AED-ek naplóban jelentett számát.

a Belviq-val kezelt Dravet-szindrómás gyermekek klinikai jellemzőit az 1.táblázat foglalja össze. Az öt Belviq-val kezelt beteg között nem volt haláleset, és a Belviq-val kezelt betegek jól tolerálták a kezelés abbahagyását okozó súlyos nemkívánatos események nélkül. Az off-label Belviq-kezelés során egy beteg kezdetben rohammentes volt 3 hétig, egy beteg rohammentes volt 2 hétig, egy harmadik betegnek pedig heti 1-2 rohammentes napja volt. Mind az öt betegnél csökkent a rohamok száma. A generalizált tónusos-klónusos görcsrohamok szignifikánsan csökkentek az 1-es, 2-es és 3-as betegeknél. Valójában a 2. beteg 90% – os csökkenést tapasztalt a generalizált tónusos-klónusos rohamokban, nincs szükség mentő gyógyszerekre. Két beteg továbbra is a Belviq-ot kapja, a rohamok gyakoriságának növekedése nélkül, és a várakozásoknak megfelelően a leggyakoribb mellékhatás az étvágycsökkenés volt. Az egyik beteg második alkalommal újraindította a gyógyszert átmeneti javulással rövid ideig, majd elvékonyodott.

Vita

Klemizol, egy első generációs antihisztamin, amelyet az 1950-es években fedeztek fel (Zierz et al., 1952), potenciális terápiaként azonosították a Dravet-szindróma kezelésére scn1Lab mutáns zebrafish segítségével az újratervezett gyógyszerkönyvtárak szűrésére (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Itt megerősítettük a klemizol antiepileptikus aktivitását egy második scn1 zebrafish mutáns modell alkalmazásával. Sajnos a klemizol gyorsan metabolizálódik egerekben, plazma felezési ideje <10 perc (szemben az emberek 3,4 órájával) (Nishimura et al., 2013), korlátozza értékelését egérmodellekben. Sikeresen használják antihisztaminként (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) akut és krónikus vizsgálatokkal, amelyek alacsony toxicitási sorrendet jelentettek (Finkelstein et al., 1960), a klemizolt már nem gyártják, és jelenleg nem áll rendelkezésre off-label klinikai alkalmazásra. A preklinikai rágcsálómodellekben a klemizol hatékony értékeléséhez szükséges eszközök hiányában a zebrafish-t használtuk a célkötéshez (5-HT receptorok) és a kapcsolódó gyógyszerek azonosításához (trazodon és lorcaserin) megfelelő biztonsági profilokkal, amelyek megkönnyítik a gyors transzlációt a klinikai alkalmazás. Együttérző használat, a Belviq (lorcaserin) címkén kívüli felírása orvosilag kezelhetetlen Dravet-szindrómás betegek számára is leírják.

az antihisztamin H1-receptor antagonisták gyermekgyógyászati betegpopulációkban (Miyata et al., 2011) és ezeknek a gyógyszereknek a szűrése megerősítette, hogy képtelenek elnyomni (és egyes esetekben súlyosbítani) az scn1 zebrafish rohamait. A kötési adatok korábban ismeretlen klemizol affinitást tártak fel a HTR2A és/vagy HTR2B receptorok iránt. A célzott könyvtárak későbbi fenotípusos szűrése két 5-HT-moduláló vegyületet, a trazodont és a lorcaserint azonosított, amelyek képesek a viselkedési és elektrofiziológiai rohamok elnyomására a klemizolhoz hasonló módon. A Belviq (lorcaserin) egy FDA által jóváhagyott HTR2C agonista, amelyet krónikus súlykezelésre írtak fel (Thomsen et al., 2008). A desyrel (trazodon) szintén FDA által jóváhagyott antidepresszáns, amelyet általában alvászavarokra írnak fel (Mendelson, 2005). Gyakran osztályozzák HTR2A és HTR2C inverz antagonistaként és 5-HT felvétel gátlóként (Stahl, 2009). A patkányokon végzett vizsgálatok azonban arra utalnak, hogy a trazodon vagy metabolitja, a meta-klór-fenilpiperazin (mCPP) magasabb koncentrációban HTR2C agonistaként működhet (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). Nevezetesen, a krónikus trazodon-kezelésről korábban kimutatták, hogy védelmet nyújt az elektrokonvulzív indukált rohamok ellen egerekben (Chavan et al., 2010; Borowicz et al., 2012), alátámasztva az scn1lab mutáns zebrafish adatait. A klemizol 5-HT receptor által közvetített hatása szintén összhangban van egy közelmúltbeli fenotípusos szűrővel, ahol a szerotonerg jelátvitel modulátorai (beleértve a klemizolt is) hatékony kezelésnek bizonyultak a Machado-Joseph betegség preklinikai modelljében (Teixeira-Castro et al., 2015); és az itt végzett tanulmányok azt sugallják, hogy a klemizol és a trazodon további fejlesztést igényel a Dravet-szindrómában szenvedő betegek off-label tesztelésére.

eredményeink egyre több bizonyítékot szolgáltatnak a szerotonerg jelátvitel modulációjára, mint a rohamaktivitás erős szuppresszorára, különösen katasztrofális gyermekkori epilepsziákban, mint például a Dravet-szindróma. A közelmúltban 7-ből 10 beteg alacsony dózisú kezelés az 5-HT újrafelvétel-blokkolóval a fenfluramint 1 évig rohammentesnek jelentették (Ceulemans et al., 2016). E betegek közül kettőben egy vagy két szívbillentyű enyhe megvastagodásáról számoltak be, ami összhangban áll a fenfluramin és a pulmonalis hypertonia alkalmazása közötti lehetséges összefüggéssel (Douglas et al., 1981; Ceulemans et al., 2016). Emberben a HTR2A és a HTR2C a központi idegrendszerben expresszálódik, míg a htr2b expresszió a szívben dúsul (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Pontosabban, a HTR2C a gátló interneuronok szubpopulációján expresszálódik (Liu et al., 2007) és ezeknek a receptoroknak az 5-HT-vel történő aktiválása növeli a GABA által közvetített szinaptikus gátlást (Boothman et al., 2006), azaz az antiepileptikus hatásmechanizmus, amely számos általánosan felírt epilepszia elleni gyógyszer alapjául szolgál. Valójában a legtöbb preklinikai vizsgálat azt sugallja, hogy a HTR2A és/vagy HTR2C receptorok aktiválása antiepileptikus hatást fejt ki (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et al., 2015), amely egy ésszerű hatásmechanizmus, amely összekapcsolja a klemizolt, a lorcaserint, a trazodont és az 5-HT újrafelvétel-blokkolót, a fenfluramint (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). Érdekes módon a htr2b expressziója a zebrafish agyban viszonylag alacsony volt, ami arra utal, hogy ezek a gyógyszerek potenciálisan antiepileptikus aktivitást fejtenek ki HTR2A vagy HTR2C receptor aktiváció révén. Érdekes, hogy a Para nátriumcsatorna génben a k1270t SCN1A humán mutációt hordozó Drosophila Kopogtató legyekkel végzett vizsgálatok kimutatták, hogy az 5-HT prekurzorral (5-hidroxi-triptofánnal) történő kiegészítés megmenti a hő által kiváltott roham fenotípust (Schutte et al., 2014). Ezenkívül egy nemrégiben scn1lab mutánsokat alkalmazó tanulmány 13 5-HT jelátviteli vegyületet értékelt, valamint potenciális antiepileptikus szerepet javasolt az 5-HT jelátvitel modulátorai számára (Sourbron et al., 2016). Ez utóbbi zebrafish vizsgálatok azonban alapvetően eltérő protokollt alkalmaztak (24 óra versus 30-90 perc gyógyszer-expozíció), amelyet korábban nem validáltak a Dravet-szindrómában alkalmazott AED-k sikeres azonosításában (benzodiazepinek, valproát, stiripentol, bromidok és ketogén étrend). Ezenkívül a gyógyszerkoncentrációk mintegy 10-szer alacsonyabbak, mint amit bizonyítunk, hogy hatékonyak a zebrahalban (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015), valamint a TCB-2 hallucinogén antiepileptikus hatásának jelentése (ábra. 5), azt javasolja, hogy a különböző eljárásokat alkalmazó laboratóriumok adatainak közvetlen összehasonlítását óvatosan kell értelmezni.

összességében arra a következtetésre jutottunk, hogy a mutáns zebrafish megfelelő modell az új AED-ek gyors szűrésére és felfedezésére, amelyek megfelelő biztonsági profilokkal közvetlenül tájékoztathatják a veszélyeztetett betegpopulációk, például a Dravet-szindróma klinikai ellátását.

rövidítések

rövidítések
• 5-HT

  szerotonin

• AED

  epilepszia elleni gyógyszer

• dpf

  nappal a megtermékenyítés után

• GPCR

  G-fehérjéhez kapcsolt receptor

• iZAP

  integrált zebrafish elemző platform

Köszönetnyilvánítás

szeretnénk megköszönni a Baraban laboratory tagjainak, Brian Grone-nak és Matthew Dinday-nek, hogy e tanulmányok során folytatott megbeszélések.

finanszírozás

az S. C. B elismeri a NINDS R01 támogatási szám finanszírozását. NS079214, UCSF Catalyst Award és a Raymond & Beverley Sackler Központ szombati alap.

Kiegészítő anyag

Kiegészítő anyag elérhető a Brain online oldalon.