a hasadt kaszpáz-3 antitest a kaszpáz-9-szerű DRONC aktivitás markere Drosophila

a hasadt kaszpáz-3 antitest jelölése a DCP-1 drice kettős mutánsokban

a hasadt kaszpáz-3 specificitásának értékelésére antitest, elemeztük a szem Imaginális lemezeit a harmadik instar lárvákból. A vad típusú szem imaginális lemezekben az antitest néhány haldokló sejtet észlel, amelyek szétszóródnak a lemezen (1a.ábra). Meglepő módon, a szem korongok kétszeresen Mutáns A null allél dcp-1prev és drice_con1 (ref.14, 15), a hasadt-kaszpáz-3 antitest még mindig címkézi a sejteket (1b ábra). Címkézés a dcp-1Prev driceben 61 kettős mutánsok klaszterekben fordulnak elő (1b ábra), hasonlóan ahhoz, amit korábban megfigyeltek, amikor a sejthalált a kaszpáz-3 inhibitor P35 expressziója blokkolta.3 Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a hasadt kaszpáz-3 antitest még mindig kimutatja az epitópot a kaszpáz-3-szerű DCP-1 és DRICE fehérjék hiányában. Mindazonáltal, mivel az apoptózis ebben a szakaszban nem fordul elő meghatározott mintában, bizonytalanok voltunk ezen címkézési jelek specifitásában.

ezért GMR-hid transzgéneket, egy jól jellemzett apoptotikus modellt 5 használtunk a hasított kaszpáz-3 antitest specifitásának további vizsgálatára. A pro-apoptotikus gén GMR-vezérelt expressziója révén a HID specifikusan a fejlődő szem hátsó felében, a GMR-hid transzgének két különböző hullámban indukálják az apoptózist, amint azt a hasadt kaszpáz-3 antitest és a TUNEL labeling28 mutatja (1C,d ábra). A hasadt kaszpáz-3 antitest specificitásának értékeléséhez megvizsgáltuk a GMR-hid szemlemezeket, amelyek kétszeresen mutánsak voltak a dcp-1prev és a drice_61 szempontjából. A várakozásoknak megfelelően a DCP-1prev és a drice5 (6) vesztesége teljesen megszünteti a TUNEL-pozitív apoptózist A GMR-hid lemezeken (1F.ábra). Meglepő módon azonban a DCP-1prev driceben a DCP-1 kettős mutáns GMR-hid szemlemezek továbbra is erős immunreaktivitást mutattak hasadt-kaszpáz-3 antitesttel (1e.ábra). Így a hasított kaszpáz-3 antitest nem, vagy nem csak a DRICE-t és/vagy a DCP-1-et detektálja. Megjegyezzük azonban, hogy a hasadt kaszpáz-3 antitest jelölési megjelenése megváltozik a DCP-1 és a DRICE hiányában (hasonlítsa össze az 1C és e ábrát). A címkézési jel már nem korlátozódik két különálló hullámra (1C ábra), hanem kitölti a szemkorong teljes hátsó rekeszét, és interommatidiális sejtekre korlátozódik (1e ábra). A CM1 antitest címkézés hasonló változásáról számoltak be a kaszpáz inhibitor P35 expressziója után.3 a jelölési mintának ez a változása valószínűleg annak a ténynek köszönhető, hogy a DCP-1prev driceben lévő sejtek a kettős mutáns GMR-hid szemkorongokban nem pusztulnak el (1F Ábra), és így a hasadt-kaszpáz-3 antitest által detektált epitópot fenntartják. Fontos azonban megjegyezni, hogy ez az elemzés kimutatja az epitóp kimutatását kaszpáz-3-szerű fehérjék DCP-1 és DRICE hiányában a hasadt kaszpáz-3 antitest által.

a hasadt kaszpáz-3 antitest immunreaktivitása a dronc és ARK apoptoszóma komponensektől függ

két lehetőség van arra, hogy a hasadt kaszpáz-3 antitest miért jelöli a DCP-1 drice kettős mutáns sejteket, bár nem apoptotikusak. Először is, előfordulhat, hogy az antitest nem mutat ki apoptotikus epitópot; vagy másodszor, az antitest kimutathat egy apoptotikus epitópot, amely a DCP-1 és a DRICE előtt vagy azzal párhuzamosan keletkezik. Hogy megkülönböztessük ezeket a lehetőségeket, megvizsgáltuk a GMR-hid szemkorongok mutánsát a dronc és az ARK apoptoszóma komponensek szempontjából, amelyek a DRICE és a DCP-1 előtt hatnak. A dronc és az ark mutáns GMR-hid szemkorongokban mind a TUNEL,mind a hasadt kaszpáz-3 ellenanyag-címkék blokkolva vannak (1 g,h; 3a, b ábra). Ezek az adatok megerősítik, hogy a hasított kaszpáz-3 antitest valóban apoptotikus epitópot detektál a Drosophilában. Továbbá, mivel nem képes kimutatni az apoptotikus epitópot a dronc és ark mutánsokban, de nem a DCP-1 drice kettős mutánsokban, pontosabb a hasított kaszpáz-3 antitestet a dronc aktivitás markerének tekinteni, nem pedig az effektor kaszpáz aktivitását a haldokló Drosophila sejtekben.

a tripeptid ETD a hasadt kaszpáz-3 antitest által detektált apoptotikus epitóp

a hasadt kaszpáz-3 antitest által detektált epitóp a DRONC aktivitásától függ. Lehetséges, hogy az antitest közvetlenül felismeri az aktivált DRONCOT. Alternatív megoldásként az is lehetséges, hogy a hasított kaszpáz-3 antitest egy ismeretlen szubsztrát aktív DRONC általi hasításával keletkező epitópot detektál, függetlenül a DRICE-tól és a DCP-1-től.

e két lehetőség megkülönböztetése érdekében a katalitikus cisztein (Cys163) maradékait a humán kaszpáz-3 (kaszpáz-3 peptid) Asp175 hasítási helyére igazítottuk a Drosophila kaszpázok megfelelő régióival (2a.ábra; Lásd még ref. 3). A kaszpáz-3 peptid (ETD) legtöbb C-terminális maradéka a DRICE-ben és a DCP-1-ben konzerválódik (2a.ábra). A kaszpáz-3-hoz hasonlóan ez a hasítási hely legalább a DRICE, 29 és esetleg a DCP-1 aktiválásához. Érdekes megjegyezni, hogy az N-terminális, a kaszpáz-3 peptid kétharmada a legmagasabb hasonlóságot viseli a DRONC-hoz; kilenc maradékból hat konzervált (2a.ábra). A kaszpáz-3 peptidnek ez a része kevésbé konzervált a DRICE, a DCP-1 és a fennmaradó Drosophila kaszpázokban. Bár a DRONC nagy és kis alegységei közötti hasítás nem szükséges az aktivitásához, 30, 31 És in vivo nem fordulhat elő, figyelembe vettük annak lehetőségét, hogy a kaszpáz-3 peptid N-terminális része ellen irányuló antitestek közvetlenül kimutathatják az aktív DRONCOT a haldokló sejtekben.

blokkoló peptideket használtunk annak értékelésére, hogy a kaszpáz-3 peptid mely epitópjait detektálja a hasított kaszpáz-3 antitest a haldokló Drosophila sejtekben. A blokkoló peptidek szekvenciáit a 2b. ábra mutatja, A 2A.ábrán aláhúzva. Az a blokkoló peptid (TETD) a DRICE-ből és a DCP-1-ből származik,a b blokkoló peptid (CRGDEYDLG) pedig a dronc legnagyobb hasonlóságú régiójának felel meg (2A., b. ábra). A C peptid egy kontrollpeptid, amely megfelel a dronc-ban a B peptiddel közvetlenül szomszédos maradékoknak (2A., b. ábra). A D peptid egy másik kontroll peptid, amely nagyon hasonlít az A peptidhez, és a DRONC prodomainjából származik a 113.pozícióban. Ha a dronc prodomainje ezen a helyen hasad, akkor az ESD-t a C-terminálisán tárja fel, amely nagyon hasonlít a kaszpáz-3 peptid (ETD, a peptid) C-terminálisához, és így a hasadt-kaszpáz-3 antitest kimutathatja.

a blokkoló peptideket a hasított kaszpáz-3 antitesttel 60 perccel a szem imaginális lemezeivel történő inkubálás előtt kevertük. A blokkolási kísérletek eredményeit a 2b. ábra foglalja össze, az A és B peptidek esetében pedig a 2C–f.ábra. Az A peptid elegendő a hasadt kaszpáz-3 antitest teljes immunreaktivitásának blokkolásához a GMR-hid-ben és a DCP-1 drice kettős mutáns GMR-hid szemkorongokban (2C., d. ábra). Ezzel szemben a B peptid nem szünteti meg az antitest immunreaktivitását ezekben a lemezekben (2e,f ábra). A C és D kontrollpeptidek szintén nem gátolják a hasadt kaszpáz-3 immunreaktivitást (2b.ábra; az adatok nem láthatók).

ezek az adatok azt mutatják, hogy a hasadt kaszpáz-3 antitest specifikusan detektálja az epitóp ETD-t apoptotikus sejtekben. A Drosophila kaszpázok közül ez az epitóp csak a DRICE-ben és a DCP-1-ben van jelen, ezért nagyon valószínű, hogy az antitest valóban kimutatja ezeket az effektor kaszpázokat. Ezzel szemben az a tény, hogy a DRONC-eredetű B, C és D peptidek nem gátolják az immunreaktivitást, arra utal, hogy nem valószínű, hogy az antitest közvetlenül kimutatná az aktív DRONC-ot. Ezért, mivel a hasított kaszpáz-3 antitest nem veszíti el az immunreaktivitást a dcp-1 drice kettős mutánsokban (1e ábra), legalább egy másik fehérjét detektál, amely az ETD epitópot DRONC-függő módon teszi ki.

a DCP-1 ARK-tól független aktiválása helyreállítja a hasadt kaszpáz-3 immunreaktivitást

a 2.ábrán bemutatott elemzés azt sugallja, de nem bizonyítja, hogy a hasadt kaszpáz-3 antitest valóban kimutatja a hasadt DCP-1-et és a DRICE-t. Ennek a lehetőségnek a közvetlen teszteléséhez egy GMR-DCP-1 transzgént fejeztünk ki ark mutáns háttérben. A DCP-1-ből hiányzik a DCP-1 N-terminális prodomainje. Úgy gondolják, hogy a prodomain-deplécióban szenvedő DCP-1 könnyen elősegíti az önfeldolgozást, és a GMR kontroll alatt történő következetes expresszió szem ablációs fenotípust indukál.32 ezt a szem ablációs fenotípust az apoptózis indukciója okozza (3C,d ábra). A fent említettek szerint A GMR-hid háttérben lévő ark mutáns klónok nem indukálnak TUNEL-pozitív apoptózist (3b.Ábra), és a hasadt kaszpáz-3 antitestnek nincs immunreaktivitása ark klónokban (3a. ábra), ami arra utal, hogy sem a DCP-1, sem a DRICE, sem az ismeretlen DRONC szubsztrátok nem hasadnak ark mutáns klónokban. Ezért azt vizsgáltuk, hogy az APOPTOSZÓMA aktivitás hiányában, azaz ark klónokban a DCP-1 expressziója képes-e helyreállítani a hasadt kaszpáz-3 antitest címkézést. A vad típusú szövetekkel összehasonlítva (amelyeket a 3C,c’ ábrán GFP jelöl), a hasadt kaszpáz-3 pozitív sejtek száma erősen csökken az ark mutáns klónokban (3C,c’ ábra), ami arra utal, hogy az A-N-DCP-1 aktiválása legalább részben az apoptoszómától függ. Azonban az ARK mutáns klónok körülbelül 50%-a (n=32) A GMR-MNN-Dcp-1 háttérben hasított kaszpáz-3 immunreaktív sejteket tartalmaz (nyilak a 3C, c’ábrán). Ez nem valószínű, hogy címkézési műtárgy lenne, mert ezek a sejtek szintén TUNEL-pozitívak (3D ábra, d’). Ezért, mivel a DRONC inaktív az ark mutáns háttérben, ami arra utal, hogy a hasított kaszpáz-3 jelölési jelet nem az ismeretlen DRONC szubsztrát okozza, ez az elemzés azt mutatja, hogy a hasított kaszpáz-3 antitest valóban kimutatja a hasított DCP-1-et. Az is lehetséges, hogy a hasadt kaszpáz-3 antitest kimutatja a hasadt DRICE-t ebben a kísérletben, mert a DCP-1 proteolitikusan képes feldolgozni a DRICE-t, legalábbis in vitro.29, 32 a DRICE-szel nem lehetett hasonló elemzést végezni, mivel a GMR-DRICE és a GMR-MNN-drICE nem okoz szem ablációs fenotípust.32 Mindazonáltal, függetlenül attól, hogy a DCP-1 hasítja-e a DRICE-t in vivo vagy sem, tekintettel a DCP-1 és a DRICE szekvenciahasonlóságára a nagy alegység C-terminálisán, valamint a 2.ábrán látható peptidblokkoló adatokra, ez arra utal, hogy az antitest a hasadt DRICE-t is kimutathatja.