a CNP és az NT-proCNP összehasonlító mérése emberi vérmintákban: módszertani értékelés

Bevezetés

C-típusú natriuretikus peptid (CNP), amelyet 1990-ben Sudoh et al., a natriuretikus peptid család legősibb tagja . A CNP szelektíven stimulálja a humán natriuretikus peptid receptort 2 (NPR2), amely aktiválja a cGMP-függő kinázt (cGK) a cGMP intracelluláris koncentrációjának emelésével . Ezenkívül a CNP megköti az NPR3-at, viszont az adenilát-cikláz Gi-proteinfüggő gátlásával deaktiválja az a protein-kinázt . A CNP anti-proliferatív és migrációellenes tulajdonságokkal rendelkezik, és endothelium eredetű relaxációs faktorként is azonosították . Továbbá a CNP gátolja a neointimális restenosist, csökkenti a vaszkuláris constrictív átalakulást és a szív ischaemia-reperfúziós sérülést . A CNP fontos szerepet játszik a csontnövekedésben, a szaporodásban, az idegnövekedésben, a re-endothelizációban, valamint a vese -, hasnyálmirigy-és szívműködésben . Ezenkívül a CNP – t nemrégiben elismerték, hogy részt vesz az ateroszklerotikus plakkképződés kialakulásában .

a CNP funkciók sokasága miatt ez a peptid az elmúlt években egyre nagyobb érdeklődést mutatott a kardiovaszkuláris kutatások iránt. A vérminták CNP-koncentrációjára vonatkozó vizsgálatok azonban következetlenek. Ezek közül a vizsgálatok közül néhány a CNP vagy amino-terminális pro-peptid (nt-proCNP) koncentrációját mérte szérummintákban, mások pedig plazmamintákat használtak . Sajnos a vérvétel és az azt követő mintavétel lehetséges késedelmeiről még nem számoltak be. Az eddig rendelkezésre álló szakirodalomban nem állnak rendelkezésre adatok a CNP/NT-proCNP koncentrációk különbségéről a szérum és a plazma minták között. A vérminta-feldolgozás késleltetésének hatása továbbra sem tisztázott. Ezenkívül a CNP koncentrációja a szérummintákban és a plazmában jelentősen különbözött (1.táblázat). Ezért a tanulmány célja a következő módszertani kérdések megválaszolása volt: (1) A szobahőmérsékleten tárolt vérminták késleltetett feldolgozása torzítást okoz? (2) van-e különbség a CNP vagy NT-proCNP szérum és plazma koncentrációja között? (3)ezek a különbségek időfüggő?

módszerek

12 férfi önkéntest vizsgáltunk (átlagéletkor 29 6 év, normál testsúly, nincs gyógyszeres kezelés, nincs kardiovaszkuláris vagy egyéb betegség, 3 dohányos). Minden vizsgált alanytól tájékozott beleegyezést kaptunk. Az éhomi vérminták hármasát minden önkéntestől reggel 8 órakor vették. A vérmintákat a 7,5 ml-es S-Monovette alkalmazásával gyűjtöttük össze (Sarstedt, N Xhammbrecht, Németország), amely vagy véralvadási aktivátort (kaolint) tartalmaz szérummintákhoz, nátrium-citrátot plazmamintákhoz vagy kálium–EDTA-t teljes vérmintákhoz. A kiindulási analízishez szükséges összes mintát azonnal centrifugáltuk 2000 ft-on 10 percen át 4 ft-on, a felülúszót pedig -70 ft-on tároltuk az analízisig. A középtávú elemzésekhez (30 perc vagy 2 óra) a plazmamintákat 2000 db-On centrifugáltuk g 10 percig szobahőmérsékleten. A felülúszót eltávolítottuk és szobahőmérsékleten 30 percig vagy 2 órán át tároltuk. A véralvadást követően a szérummintákat a plazmamintákkal azonos módon dolgoztuk fel. A felülúszót 30 percig vagy 2 órán át szobahőmérsékleten tároltuk. A teljes vérmintákat szobahőmérsékleten tároltuk centrifugálás nélkül. 30 perc vagy 2 óra elteltével a teljes vérmintákat 2000 ft-on centrifugáltuk 10 percig 4 ft-on. a felülúszót eltávolítottuk és -70 ft-on tároltuk az elemzésig. A CNP koncentrációját a CNP-22 EIA Kit (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Németország) segítségével mértük a gyártó protokollja szerint. Az NT-proCNP koncentrációt az NT-proCNP EIA Kit (Biomedica, Bécs, Ausztria) segítségével mértük a gyártó protokollja szerint. Az egyirányú ANOVA-t a csoportok összehasonlítására használták. Páros összehasonlításokhoz a t-tesztet alkalmaztuk. Az adatok a következők szerint jelennek meg: azt jelenti, hogy a standard deviáció (SD) vagy a 95%-os konfidencia intervallum (95% – CI). A statisztikai szignifikanciát p < 0,05 értéknél feltételezték. Az adatokat a MedCalc használatával elemeztük 60.0.1.0 Verzió (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium).

eredmények

amint az 1a.ábra mutatja, a CNP kiindulási koncentrációja a szérum -, plazma-és teljes vérmintákban sorrendben 0, 997 0, 379 ng/ml, 1, 933 0, 699 ng/ml, illetve 0, 991 0, 489 ng/ml volt. A CNP plazmakoncentrációja minden időpontban szignifikánsan magasabb volt a szérum és a teljes vérmintákhoz képest (ANOVA, p = 0, 001 a vizsgálat megkezdésekor, p < 0, 001 30′ min. és p = 0,003 120 percnél.). Semmilyen időpontban nem figyeltek meg szignifikáns különbséget a szérum és a teljes vérminták között (ANOVA, p > 0, 05). Az NT-proCNP kiindulási koncentrációja a szérum -, a plazma-és a teljes vérmintákban sorrendben 58,5 (68,3) pg/ml, 60,3 (23,9) pg/ml és 50,7 (21,4) pg/ml volt (1b.ábra). A csoportok között egyetlen időpontban sem találtak szignifikáns különbséget (ANOVA, p > 0,05). A teljes vérmintákban a laktát koncentrációja szignifikánsan nőtt 2 óra elteltével a kiindulási értékhez képest (3, 2 0, 8 mm, vs.2, 0 0, 6 mM, p < 0, 001). Emellett a pH-érték 7,34 0-ról csökkent.03 kiindulási érték 7, 29, 0, 03, 2 óra elteltével (p < 0, 001).

megbeszélés

Vizsgálatunk kimutatta, hogy a CNP és az NT-proCNP stabil a szérumban és a teljes vérmintákban legalább két órán át szobahőmérsékleten. Következésképpen a CNP peptid stabilitását nagy valószínűséggel nem befolyásolja a minta feldolgozásának legalább két órás késleltetése. A ProCNP-ről már beszámoltak (a gyártó protokollja, a vérminták ismeretlen tárolási körülményei) legalább 2,5 órán át stabilnak kell lennie. Ennek megfelelően kísérleteink megerősítették az NT-proCNP stabilitását szobahőmérsékleten is. Az NT-proCNP koncentrációja minden mintatípusban állandó maradt az időtartam alatt legfeljebb 2 órán keresztül, jelezve ennek a fehérjének a tartós stabilitását. Az 1. táblázatban felsoroltak szerint az NT-proCNP átlagos koncentrációja (56,5 64.Az ebben a vizsgálatban mért 3 pg/ml érték a jelentett tartományon belül volt (lásd 1.táblázat) egészséges egyéneknél (3, 7-432 pg/ml).

az NT-proCNP-vel ellentétben a CNP koncentrációja szignifikánsan magasabb volt a plazmamintákban, mint a szérum és a teljes vérmintákban (1.ábra). Mindeddig sem csoportunk, sem a gyártók műszaki szolgálata nem talált bizonyítékot a mintatípusnak az e vizsgálatban használt ELISA-vizsgálatra gyakorolt hatására vonatkozóan. A vizsgálat megkezdésekor azonban a felülúszó plazma és a teljes vérminták azonosak voltak, kivéve az alkalmazott véralvadásgátló típusát. Ez az inhibitor a nátrium-citrát volt a plazma csoportban és az EDTA a teljes vérminta csoportban. A teljes vérminták hasonló eredményeket mutattak, mint a szérumminták (p = 0,98). Ezért a legvalószínűbb, hogy a nátrium-citrát jelentősen befolyásolhatja a CNP mért koncentrációját a plazmában, következésképpen meghamisítja az ezzel a technikával elért eredményeket.

váratlanul a CNP kiindulási koncentrációja mind a plazma, mind a szérum mintákban körülbelül ezerszer magasabb volt, mint más jelentésekben (1 .táblázat). Mindezen vizsgálatokban a radioimmunoassay-t (RIA-Kit) használták a CNP-koncentrációk meghatározására. Ezzel szemben két másik vizsgálatban a szérum-és plazmamintákban mért CNP-koncentrációk a dimenzió nagysága tekintetében összehasonlíthatók voltak eredményeinkkel . Érdekes, hogy az utóbbi tanulmányokban ugyanazt az ELISA-készletet használtuk, mint a vizsgálatunkban. Még a különböző belső és külső tényezők átfogó értékelése után sem sikerült kielégítő magyarázatot találni erre az eltérésre. Az exogén CNP alkalmazásával végzett kontrollmérések humán szérumban nem szignifikáns mérési hibát mutattak ki +7,8% (95%-KI: -). A referenciagörbéhez használt CNP-peptidet maga a gyártó (Phoenix) szintetizálta. Ezzel szemben az “exogén” kontrollként alkalmazott CNP peptidet Bachem biztosította. Amint azt mindkét gyártó biztosította, az aminosavak szekvenciái azonosak voltak, és mindkét peptidben diszulfidkötések képződtek.

a belső kontroll mérések eredményei azonban a következőképpen foglalhatók össze: Először is, a vizsgálatunkban elvégzett ellenőrző mérések azt mutatták, hogy az ELISA készleteket megfelelően használták, a gyártó utasításainak megfelelően. Másodszor, a kontrollmintákkal végzett mérések megerősítették az alkalmazott standard görbe alkalmasságát. Harmadszor, az exogén CNP-t tartalmazó kontroll szérumminták elfogadható pontosságot mutattak, és az eredmények a várt nagyságrenden belül voltak. Negyedszer, a CNP magasabb koncentrációja a plazmamintákban valószínűleg a nátrium-citrát okozta műtárgy.

amint arról a Clerico és munkatársai beszámoltak, a különböző RIA és KHV módszerek, például az ANP és a BNP eredményei között összehasonlíthatóan nagy különbségek is ismertek . Clerico és munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy ezeknek az eredményeknek a nagy eltérései nagy valószínűséggel az alkalmazott monoklonális vagy poliklonális antitestek specifikusságának, az alkalmazott immunoassay rendszer kialakításának (kompetitív vs .nem kompetitív vizsgálat), az alkalmazott analitikai mátrixnak (szérum vs. EDTA vs. heparinizált plazma), valamint a natriuretikus peptidek keringő formáinak sokaságának köszönhetők, amint azt korábban az ANP és a BNP immunoassays esetében jelentették. A torzítás ezen módszertani forrásai CNP és NT-proCNP vizsgálatok esetében is elképzelhetők, és így magyarázzák az idézett vizsgálatok eredményeinek nagy különbségét (1.táblázat).

a vizsgálat korlátai

elismerjük, hogy a 12-es minta mérete túl kicsi ahhoz, hogy megállapítsuk, hogy egyáltalán nincs különbség. Statisztikai szempontból azonban fontos lenne meghatározni, hogy mekkora különbségnek kell lennie ahhoz, hogy orvosi jelentőséggel bírjon. Tudomásunk szerint ez utóbbi még nincs egyértelműen meghatározva. Ezért az ábrán megadtuk az összes mérték átlagát és 95%-os konfidencia-intervallumát, hogy minden olvasó saját értelmezését is felhasználhassa az adatokból.

a szérum-és plazmakoncentrációkkal kapcsolatban meg kell említeni, hogy az 1.táblázatban közölt értékeket különböző módszerekkel (RIA, ELISA) mérték különböző betegségekben szenvedő betegeknél. Nagyon hasznos lett volna összehasonlítani a CNP-RIA-t a CNP-ELISA vizsgálatokkal közvetlenül ugyanazon minták felhasználásával, mert a nagyságrendben ezerszeres különbség továbbra is észrevehető. Sajnos a RIA vizsgálatok nem álltak rendelkezésre laboratóriumunkban. Az NT-proCNP koncentráció esetében az utóbbi összehasonlítást Olney és munkatársai vizsgálták, amelyek azt mutatták, hogy a kereskedelmi ELISA (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Bécs, Ausztria) a RIA értékek átlagosan 21% – át (11-52%) adták. Az ELISA-készlet referencia-standardjának ria-teszttel történő keresztvalidálása 15% – os eltérést mutatott .

összefoglaló

a CNP és az NT-proCNP méréseit nagy valószínűséggel nem befolyásolta a minta menetének vagy a vérminta típusának késése (kivéve a CNP-t a plazmamintákban). Plazmamintákhoz csak az EDTA antikoagulált vérminták voltak alkalmasak az ebben a vizsgálatban alkalmazott CNP ELISA vizsgálathoz. Következésképpen a CNP és az NT-proCNP koncentrációja klinikai alkalmazásokban alkalmazható a CNP hatásainak meghatározására. Azt is figyelembe kell venni, hogy az NT-proCNP koncentrációja, mivel csak az aktív peptid mellékterméke, elrejtheti a CNP valódi természetét. A mért CNP-koncentrációk eltérése azonban, amelyet RIA-vizsgálatokkal vagy ELISA-vizsgálatokkal határoztak meg, továbbra is megmagyarázhatatlan, de valószínűleg módszertani kérdéseknek tudható be. Ezért az ANP és a BNP számára ajánlott módon a CNP immunvizsgálatait a jövőben is szabványosítani vagy harmonizálni kell.