a Chp1 kromodomain megköti a H3K9me farokot és a nukleoszóma magot, hogy heterokromatint gyűjtsön

plazmidok és törzsek építése

a chp1cd mutánsokat expresszió és tisztítás céljából inverz PCR-rel állítottuk elő az S2 kiegészítő táblázatban felsorolt primerek felhasználásával, a pet28a CHP1 kromodomain plazmid . A heterokromatin rescue assay-eket chp1 wt-t és chp1 mutáns fehérjét tartalmazó plazmidok endogén promoter alá juttatásával végeztük egy CHP1 6. számú törzsben (SP170, Lásd az S3 kiegészítő táblázatot). a CHP1 teljes hosszúságú gént és annak endogén promoterét (-949 bp a chp1+ kódoló szekvencia kezdetétől) klónozták a pREP1 plazmidban. a CHP1 kromodomain mutánsokat inverz PCR-rel, az S2 kiegészítő táblázatban felsorolt primerek felhasználásával állítottuk elő, és a jelzett CHP1 ++ törzsben transzformáltuk.

a genomi integrációhoz a pREP1 plazmidot úgy módosítottuk, hogy az nmt1+ promótert a következő integrációs kazettával helyettesítsük: (SphI) régió a Chp1 gén 5’—nél (I kromoszóma, 2215500-2215055) (AscI)- HphMX6 rezisztencia kazetta—(SphI) Chp1 endogén promoter (I kromoszóma, 2214829-2214664)—Chp1 kódoló szekvencia – (BamHI) CHP1 terminátor (I. kromoszóma, 2210976-2210582) (bamhi). Az integrációs kazettát (mind a chp1+, mind a chp1LOOP1B/2b kazettát) ezután PCR amplifikáltuk és elektroporációval SP101, SP170 és SP64 törzsekké alakítottuk át. Ezután a sejteket igen+ Higromicin (50 mg ml−1 Higromicin) lemezeken választottuk ki. Az egyes kolóniákat izoláltuk, PCR-t szűrtünk és szekvenáltunk a HphMX6 rezisztencia kazetta és a LOOP1B/2b mutációk genomiális behelyezéséhez.

plazmidokat tartalmazó törzseket tenyésztettünk Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu táptalajon. Az ebben a vizsgálatban használt összes törzset és plazmidot az S3 és S4 kiegészítő táblázat sorolja fel.

Fehérjetisztítás

His6-SUMO-Chp1CD és az összes CD mutáns e-ben volt kifejezve. coli BL21 (DE3)(pLys) és ni-NTA gyanta alkalmazásával affinitáskromatográfiával tisztítják (GE Healthcare, Freiburg, Németország). A His6-SUMO-Chp1CD trombin hasítási helyet tartalmaz két címke között .

összesen 0,2 mM-es IPTG-t adtak hozzá a fehérje expressziójának indukálásához, majd 18 o/n-es növekedés következett be.a sejteket centrifugálással kinyertük, és lízis pufferben (20 mM 4-(2-hidroxietil) – 1-piperazinetánszulfonsav (HEPES) pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), 20 mM imidazol) újra szuszpendáltuk. Gyorsfagyasztás után a sejteket felolvasztottuk és 30 percig inkubáltuk lizozimban az ultrahangos kezelés előtt (Branson Sonifier 250-output 4, duty cycle 40). A szuszpenziót centrifugáltuk (12000 g, 20 perc 4 CAC-on), és a felülúszót a ni-NTA gyantához adtuk, amelyet előzőleg kiegyenlítettünk kötőpufferben (20 mM HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM imidazol), és 30 percig inkubáltuk 4 Ca-n, forgatás alatt. A gyantát ezután 5 db-ot kötőpufferrel mostunk, és a fehérjéket eluációs pufferben eluáltuk (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM imidazol). A Chp1CD wt-t és a mutánsokat ezután O/N-vel dializáltuk egy pufferben, amely 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl-t, 1 mM DTT-t tartalmaz. A His6-SUMO-Chp1CD-t ezután gélszűréssel (Superdex 75 pg; GE Healthcare) tovább tisztítottuk, majd 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT-t tartalmazó pufferben dializáltuk.

hangtompító vizsgálatok

a hangtompító vizsgálatokhoz szükséges sejteket OD 0,7–1−re növesztettük, majd normalizáltuk a tenyészet 1 607 sejt ml-1 végső koncentrációjára. Tízszeres soros hígítást végeztünk úgy, hogy a legnagyobb sűrűségű folt 1 db 105 sejtet tartalmazott. A sejteket nem szelektív (igen) és 5-fluoro-orotikus sav (5-FOA 1 g l-1 5−FOA) lemezeken észleltük. A lemezeket 32 6-3 napon át inkubáltuk, majd leképeztük. A sejtekben ura4 riporter gén van behelyezve a pericentromer imr ismétlődésekbe (heterokromatikus lokusz). Amikor az ura4 riporter gént elnémítják, a sejtek 5-FOA tartalmú táptalajon növekedhetnek. Amikor a heterokromatin elvész, az ura4 riporter gén expresszálódik, és a sejtek nem képesek növekedni az 5-FOA táptalajon.

az RNS-szintek kimutatása qPCR–rel (RT-qPCR)

élesztő tenyészeteket (10 ml) OD600-ra neveltünk 0,7-1,5. A sejteket ezután újra szuszpendáltuk 500 6L lízis pufferben (300 mM NaOAc pH 5,2, 1% nátrium–dodecil-szulfát) és 500 ml fenol-kloroformban, és 65 oc-on inkubáltuk 10 percig állandó keverés mellett. A vizes frakciót a fenol–kloroformtól centrifugálással (10 perc, 20 000 g) elválasztottuk, majd etanolt kicsaptunk. A nukleinsavakat DNáz I-vel (Roche, Bázel, Svájc) kezeltük 30 percig 37cc-n, majd 15 percig 75cc-n hő inaktiválás. A komplementer DNS-t 100 ng RNS és 1 pmol DNS-oligo felhasználásával szintetizáltuk III-as Felső indexszel (Invitrogen, Darmstadt, Németország) standard körülmények között. Az RNS-szinteket QPCR-rel számszerűsítettük a Biozym DyNAmo Flash qRT-PCR kit használatával, és euchromatikus tdh1 génre normalizáltuk.

RNS elektroforetikus mobilitási eltolódási vizsgálatokat

az RNS eltolódási vizsgálatot a korábban közölt feltételek szerint végeztük . Összesen 0.66 pmol 32P radioaktívan jelölt 30 nt centromer RNS-t inkubáltunk 10 MHz-es CHP1 kromodomainnal (vad típusú és mutáns) egy 20 mM-es trisz-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT és 3% glicerint tartalmazó pufferben. A 100 nt DG centromer transzkripcióval rendelkező RNS EMSA esetében 2 pmol 32P radioaktívan jelölt RNS-t inkubáltunk 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) a Chp1CD fehérje (wt és LOOP1B/2b mutáns) pmol-Jai 15 6L végtérfogatban. A h3k9me3 peptidet (Eurogentec, K ons, Németország) 1:1 Chp1CD – H3K9me peptidhez adtuk, amint arról beszámoltunk . Az inkubálást 1 órán át jégen végeztük, majd a mintákat (20 6L végtérfogat) 10%-os akrilamid-TBE natív gélre töltöttük (bisz-akrilamid arány 1:29). Az in vitro RNS-lehúzásokhoz 1 db (vad típusú és LOOP1B/2b mutáns) szumo-Chp1CD-t (vad típusú és LOOP1B / 2B mutáns) kötöttünk 15 ml ni-NTA gyantához (GE Healthcare), és a H3K9me3Nucleosome-ot adtunk hozzá a Chp1cd-H3K9me3Nucleosome komplex Kötőpufferben történő összeállításához (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol). Háromszor 50 db 60 ml kötő pufferrel végzett mosás után 2 db 32P-vel jelölt 100nt dg RNS-t adtunk hozzá, majd a chp1cd-nukleoszóma gyantával jégen inkubáltuk 1 órán át. a gyantát lassú sebességgel (60 g, 10 s) centrifugáltuk, és az átfolyást összegyűjtöttük. A gyantát háromszor mossuk legalább 3 db (v/v) kötőpufferrel, és a Chp1CD-nukleoszóma-RNS komplexet 300 mM-es imidazol puffer (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 300 mM imidazol) hozzáadásával eluáljuk, 1 órán át inkubáljuk jégen, 5 perces keveréssel (kötött frakció). A mintákat 10%-os TBE natív akrilamid gélre (bisz-akrilamid arány 1:29) töltöttük, és 2 órán át futtattuk 10 mA-n, 4 kb-n.egynapos expozíció után a géleket a TyphoonFLA9000 phosphoimager segítségével szkenneltük.

kromatin immunprecipitáció

Élesztőkultúrákat (100 ml) 0,7 OD600-ra növesztettünk, és szobahőmérsékleten 3% – os formaldehiddel térhálósítottuk 15 percen keresztül a leírtak szerint . A reakciót 125 mM-es glicinnel 10 percig szobahőmérsékleten leállítottuk. A sejteket újra szuszpendáltuk 500 .. l lízis pufferben (50 mM HEPES pH 7,5, 1.5 M nátrium-acetát, 5 mM MgCl2, 2 mM etilén-diamin-tetraecetsav, 2 mM etilén-glikol-tetraecetsav, 0,1% NP-40, 20% glicerin) tartalmazó proteáz inhibitorok (proteáz inhibitor koktél tabletta, Roche, teljes, etilén-diamin-tetraecetsav mentes). A fagyasztott sejteket lizáltuk az MP Biospec gyöngyverővel. A lízis után az extraktumot 35 mp-en szonikáltuk 30 másodpercig (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgium), majd 13 000 g-on 15 percig forgattuk, hogy megkapjuk a kromatin felülúszót. A bemeneti DNS-hez a felülúszó 50 6L-ét használtuk. Immunprecipitáció esetén a felülúszókat a fehérjekoncentráció alapján normalizáltuk, és anti-dimetilezett H3K9 antitesttel vagy anti-Chp1 antitesttel (H3K9me2, Abcam no. Ab1220 és Chp1, Abcam no. Ab18191), mágneses Dynabeadeken immobilizálva, 2 órán át 4 6c-on. a gyöngyöket és az immobilizált fehérjét 5 ml lízis pufferrel mossuk. A fehérjéket 150 db elúciós pufferrel (50 mM-es trisz-HCl pH 8,0, 10 mM-es etilén-diamin-tetraecetsav, 1% – os nátrium-dodecil-szulfát) inkubálva eluáltuk 65 dB 65 percig. A keresztkötéseket egy éjszakán át tartó inkubálással megfordítottuk, majd az RNS lebomlását RNáz A–val, a fehérje lebomlását proteináz K-vel végeztük.a DNS-t ezután fenol-kloroform extrakcióval és etanolos kicsapással nyertük vissza, és QPCR-rel számszerűsítettük. A normalizáláshoz a tdh1 euchromatikus gént használtuk. A kromatin immunprecipitációs vizsgálatokban használt oligonukleotidokat az S2 kiegészítő táblázat sorolja fel.

nukleoszóma in vitro feloldás és (H3K9me3) metiláció

a Nukleoszómákat Xenopus laevis hisztonokkal és a korábban leírt 601 szekvenciával oldottuk fel . Az In vitro metilezést a leírtak szerint végeztük . A +42 Da csúcsot az eredeti publikációban megfigyelték, és ez nem szennyeződés (Matt Simon, personal communication and descripted in ).

In vitro Chp1CD-H3K9me3 mla nukleoszóma komplex képződés és elúció

összesen 5 db Chp1CD-t kötöttünk 15 db ni-NTA gyantához kötő pufferben (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCL, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol) 20 percig 4 db C-n. A gyantát egyszer öt térfogatú kötő pufferrel mostuk, és 10 db h3k9me3 metil-lizin analóg (MLA) nukleoszómát adtunk hozzá (az MLA nukleoszómákat korábban kötő pufferben dializáltuk) 20 ml végső térfogatban, majd 1 órán át inkubáltuk jégen, 5 percenként állandó újra-szuszpenzióval. Inkubálás után a gyantát centrifugáltuk (60 g 10 másodpercig), majd összegyűjtöttük az átfolyást. A gyantát ezután háromszor mossuk öt térfogatú kötőpufferrel. A SUMO-Chp1CD-H3K9me3Nucleosome komplexet trombin hozzáadásával eluáltuk (Sigma, München, Németország) 2 órán át jégen 20 OHL kötő pufferben. A komplex képződést ezután 15% akrilamid gélen végzett SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, majd negatív em folt segítségével értékeltük.

Chp1CD H3K9me3 peptidkötő vizsgálatok

összesen 1 db-hiszton H3 (1-21)- Ggk(Biotin) peptidet (Eurogentec) inkubáltunk 15 db streptavidin agaróz gyantával (Invitrogén) 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT-ben. Ezután körülbelül 5 db (wt és mutáns) chp1cd-T (wt és mutáns) adtunk hozzá 20 db 6CL végtérfogatban, és 1 órán át inkubáltuk jégen, azonos pufferfeltételek mellett. A gyantát háromszor megmossuk, majd a kötési hatékonyságot SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel értékeltük 15% akrilamid géleken. A kötés mennyiségi meghatározása az ImageJ szoftver használatával történt. Az egyes mutánsok kötődését WT Chp1CD-re normalizáltuk minden vizsgálathoz.

mikroszkópos termoforézis (MST)

az MST SUMO címkét eltávolították a Chp1CD konstrukciókból Ulp1 proteázzal. Összesen 100 db vad típusú és mutáns Chp1CD-t jelöltek fluoreszcens módon a MO-L003 monolit fehérje Jelölőkészlet kék-NHS (amin reaktív) segítségével a gyártó utasításai szerint (Nanotemper Technologies, München, Németország). Az 1: 1 fluoreszcencia: fehérje arányt a Nanodrop1000 szoftver ‘Proteins and Labels’ funkciójának felhasználásával becsülték meg, és minden Chp1 Kromodomént 15%−os SDS akrilamid gélen futtattak, hogy normalizálják a koncentrációt 0,1 mg ml-1-re.

a reakciókat 20 db 600 ng fluoreszcens Chp1CD-vel és növekvő mennyiségű-hiszton H3 (1-21)-Ggk(Biotin) peptiddel (Eurogentec) vagy H3k9me3nukleoszómával állítottuk össze egy 10 mM-es trisz-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT és 0,05% Tween-20 tartalmú pufferben. A H3K9me3Nucleosomes-binding assay-khez 10% – os végső koncentrációhoz glicerint adtunk. A H3K9me3 vizsgálatokhoz ezeket a hígításokat használtuk a következő mérésekhez: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 km, 800 m, 1,2 mm, 1,8 m. A H3K9me3Nucleosome vizsgálathoz a következő hígításokat használtuk a mérésekhez: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 db, 1,2 db, 1,4 db, 1,6 db, 2,4 db.

az MST futásokat standard kezelt kapillárisok (Nanotemper Cat#K002) alkalmazásával hajtottuk végre az NT-n.115 monolit eszköz. Az összes mérést 80% LED és 40% MST teljesítmény alkalmazásával végeztük, 30 s lézerrel időben és 5 s lézerrel kikapcsolva. Minden kísérlethez öt egyedi mérést végeztünk.

az adatokat a GraphPad Prism szoftver 6-os verziójával elemeztük.00 (GraphPad szoftver, San Diego, CA, USA) és a SigmaPlot szoftver 13.0 verziója (Systat szoftver, San Jose, CA, USA). A peptidkötő vizsgálatokhoz, ahol a görbék megkülönböztetett szigmoid tendenciát mutatnak, a Richards öt paraméter logisztikai aszimmetrikus szigmoid egyenletét illesztettük be, és automatikusan kiszámítottuk a Kd-t. A H3K9me3Nucleosome-kötő vizsgálatokhoz, mivel a nyers adatok trendje már nem volt szigmoid az összes elemzett fehérje esetében, egy harmadrendű polinom (köbös) egyenletet használtunk a vad típusú Chp1CD és a különböző mutánsok nyers adatpontjainak illesztésére és összehasonlítására. A Kd kiszámítása a GraphPad prism szoftver ‘interpolációs’ jellemzője alapján történt, az y tengely 50% – os kötött/nem kötött értékének felhasználásával.

nukleoszóma tripszin emésztés

farok nélküli nukleoszómákat állítottunk elő úgy, hogy rekonstruált nukleoszómákat inkubáltunk immobilizált TPCK-tripszin gyantával (Thermoscientic) 2 órán át szobahőmérsékleten egy pufferben, amely 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT . A triptikus emésztés nagyon meghatározott hiszton sávokat hoz létre, és részletesen leírták, hogy pontosan hol vágódik a tripszin .

Nukleoszómakötő vizsgálatokat végeztünk chp1cd mutánsokkal

a chp1cd vad típusú és mutáns nukleoszómakötő vizsgálatokat a Chp1CD-H3KC9me3 mla Nukleoszómakomplex képződéshez korábban leírtak szerint 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT, 40 mM imidazolban. A gyantákat és a bemeneteket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, 15% akrilamid gélekkel végeztük. Ezután az összes mintát immunoblottal elemeztük anti-H3 hisztonnal (AbCam, Cambridge, Egyesült Királyság, 1:1000) vagy anti-H3K9me3 antitesttel (AbCam, 1:1000), anti-kecske IgG-HRP-vel (BioRad, 1:3000) anti-nyúl IgG-HRP-vel (BioRad, München, Németország, 1:3000).

negatív folt elektronmikroszkópia

trombin elúció után a chp1cd–H3KC9me3 nukleoszómakomplexet 3 db (cu 400 mesh Q11916, Quantifoil, Gro ons, 6 nm-es szénfóliával bevont) rézrácson észleltük 45 másodpercig. egy gyors vízzel történő mosás után a rácsot 15 másodpercig inkubáltuk 2% – ban uranil-acetát. A negatív foltképeket FEI Morgagni transzmissziós elektronmikroszkópon gyűjtöttük össze.

Krio-EM a Chp1CD–H3KC9me3 nukleoszómák komplexen

Krio-EM rácsokat (Lyukas szénbevonatú rácsok, Cu 300 Mesh R3/3+1 nm szénréteg, Quantifoil) Vitrobot Mark IV (FEI cég) alkalmazásával állítottuk elő. A krio-EM adatokat Titan-Krios transzmissziós elektronmikroszkóppal (Fei Company, Hillsboro, OR, USA) 200 KeV-en, a CCD síkján pedig 113 000 MHz-es nagyítással F816 CMOS kamerával (TVIPS GmbH, Gauting, Németország) gyűjtöttük, amelynek eredményeként az objektumskálán pixelenként 1,2 db képpontméret alakult ki (a CCD pixelmérete 13,6 km volt). Az automatizált adatgyűjtéshez az EM-TOOLS szoftvert használták, és az adatokat 10 000-40 000 Ft-os defókusztartományban gyűjtötték.

összesen 2 480 mikrográfot választottunk ki a Chp1CD–H3KC9me3 komplexhez, illetve 991 mikrográfot a h3kc9me3 nukleoszóma kontrollhoz az egyrészecske-elemzéshez az Xmipp szoftvercsomag segítségével (S9A kiegészítő ábra) . Néhány ezer részecskét kézzel szedtek és gondosan megtisztítottak a zajtól. Ezeket a részecskéket ezután félautomata és automatikus részecskeszedésre használták az XMIPP – ben. A kontrasztátviteli funkciót a CTFFIND3 határozta meg . A kiválasztott egyes részecskéket SPIDER és RELION formátumokká alakítottuk át további elemzés céljából (S9b kiegészítő ábra). A kétdimenziós osztály átlagokat RELION szoftvercsomaggal generáltuk (S9C kiegészítő ábra) . A rossz osztály átlagokat eltávolították a további adatelemzésből. A háromdimenziós finomításokat később a SPIDER és RELION szoftvercsomagokkal végezték .

a felügyelet nélküli részecske-osztályozást véletlenszerű vetéssel végeztük a teljes sűrűségtérképekkel, a Spider szoftvercsomag fókuszált osztályozása nélkül. A fókuszált osztályozás alkalmazásának kísérletei erős torzítást és zajtúlfeszítést eredményeztek az érdeklődésre számot tartó régiókban. Ezért nem használtunk fókuszált osztályozást az elfogultság csökkentésére. A SPIDER-ben végzett kezdeti osztályozás során a C0–C6 és N0–N5 osztályokat a C0 és N0 térképek szögei alapján visszaprojektálták, és ez az osztály nem volt teljesen finomítva. Itt csak olyan osztályokat akartunk kiválasztani, amelyeknek további sűrűsége van a nukleoszómához kötve. A különböző chp1cd sűrűségű térképeket létrehozó részecskéket elkülönítettük és tovább osztályoztuk. Körülbelül 20 véletlenszerű vetési osztályozást végeztünk, amíg a részecskéket öt különböző csoportra osztottuk (S3 kiegészítő ábra). A C11–C15 osztályokat RELION szoftvercsomaggal finomították. A CHP1CD-H3k9me3 nukleoszóma komplexek (C15 osztály) és a nukleoszóma kontroll végső finomításait RELION szoftvercsomaggal végeztük. A végső finomításhoz a hivatkozást ~50-re szűrtük (RELION szűrő). Az általunk használt referenciának egyik jellemzője sem volt megfigyelhető a finomított rekonstrukciókban (a DNS kettős hélix nem oldódott meg, a fő horony nem látható, a 6-hélixek nem oldódtak meg). Ez azt jelzi, hogy nincs referencia torzítás a szerkezetünkben. A Nukleoszómakontroll felbontása elérte a 7,3 Xhamsteret a RELION és a C2 szimmetria automatikus finomításával (FSC 0,143 határérték két egymástól függetlenül finomított térképből). A Chp1CD-H3K9me3Nucleosome komplexet 10-re finomítottuk (két egymástól függetlenül finomított térkép FSC 0,143-as határa) szimmetria alkalmazása nélkül.

a helyi felbontást ResMap szoftverrel számítottuk ki (végső egyetlen kötet, minRes=7, maxRes=14, automask). A Resmap által meghatározott átlagos felbontás a Chp1CD-H3K9me3Nucleosome complex esetében 9,4^, függetlenül megerősítve a korábban meghatározott 10 (FSC 0,143) átlagos felbontást (1C ábra). A chp1cd-H3K9me3Nucleosome komplex lokális felbontása a nukleoszómára 9-10, a ligandumra pedig ~10 (2a.ábra). A végső rekonstrukciók Euler-szögeloszlását mind a nukleoszóma, mind a Chp1CD-H3k9me3nukleoszóma komplex esetében mutatjuk be (S9D kiegészítő ábra). Minden tájolás jelen van, előnyben részesítve a felső és oldalsó nézeteket.

molekuláris modelleket készítettek a Chimera szoftvercsomag felhasználásával, kristályszerkezetek merev test illesztésével . A sűrűségbe való illesztés A Chimera ‘Fit in Map’ és ‘fit in szegmensek’ opciókkal történt, csak kisebb kézi beállításokkal. Az összes krio-EM térkép szegmentálása és vizualizálása szintén a Chimera szoftverrel történt .