A chordin/Bmp jelek szerepe az emlősök garatfejlődésében és a DiGeorge-szindrómában/ fejlődésben

eredmények

Gastrulációs hibák Chrd – / – egerekben

A Chrd szekretált Bmp-kötő fehérje az egér csomópontjában és származékaiban, notochordban és pharyngealis endodermában expresszálódik(ábra. 1A-F). A Chrd fehérje négy ciszteinben gazdag (CR) domént tartalmaz, amelyek mindegyike képes a BMP-k megkötésére.a CR1 és a CR3 a legnagyobb affinitást mutatják a Bmp4 iránt, és antagonizálhatják a Bmp jeleketa Xenopus embriókba történő mRNS injekción(Larrain et al., 2000). A Chrd null alléljának generálásához elkészítettünk egy célzási konstrukciót transzlációs stop kodonokkal a három lehetséges olvasási keretben a jel peptid régiójában. A stop kodonokat egy kereteltolás követte, majd a CR1 után az IRES-lacZ és a PGK-neo kazetták beillesztése, amelyek tovább rontották a Chrd gént (ábra.1 g). Ebből a Chrdtm1DR allélból(a továbbiakban: Chrd-) származó átiratok nem voltak kimutathatók inchrd-/- embriók a csomópont szakaszában(ábra. 1J, nyílhegy).

a heterozigóta Chrd egerek életképesek és termékenyek voltak, és különböző fejlődési stages.At az E8. 5. napon megfigyeltük a reszorpciós csomók jelenlétét a terhes nők méhében, valamint a chrd-/- embriók várható számának kis csökkenését (50 felépült, 57 várható). Négygenotípusos homozigóta mutáns embriók egyértelműen csökkentették az embrionális régió méretét, amelyet az allantois megnagyobbodása kísért az embrió többi részének tiszteletben tartásával (ábra.2A, A’). A szövettani szakaszokban jelentős hypoplasiaa neurális lemez (ábra.2B, B’), hiánya somites és notochord (ábra. 2C, C’), és anabundance extraembrionális mezodermális sejtek az allantois (ábra. 2D,D’) voltak megfigyelhetők. A többi mutáns (46) morfológiailag nem volt megkülönböztethető heterozigóta és vad típusú alomtársaiktól. A négynormális mutánsok fenotípusa hasonló volt, de kevésbé hangsúlyos, mint a kettős homozigóta Chrd-ben megfigyelt Mezoderma ventralizációja; Nogmutánsok (Bachiller et al.,2000), amelyben emellett a neuralplate elülső csonkításai is jelen voltak.

a zebrafish és a Xenopus esetében a Chrd inaktiválása a ventrális Mezoderma kiszélesedését és a dorzális Mezoderma és a neuralplate redukcióját okozza (Schulte-Merker et al.,1997). Emlősökben a Mezoderma a gasztruláció során alakul kiaz epiblast sejtek nyomása a primitív csíkon keresztül. A primitív csík hátsó végén kilépő sejtek az extraembrionális régióba költöznek, ahol egy mezodermális vonalat hoznak létre (allantois, amnion és a tojássárgája vérszigetei), amely egyenértékű a Xenopus ventrális mezodermájával. Ezzel szemben, a sejtek található több elülső régiói thestreak belül maradnak az embrió megfelelő és termel a paraxiális, intermediateand lateral lemez Mezoderma a jövő törzs. A chrd-/- mutánsok korai fenotípusa, amelyben az allantois az embrionális Mezoderma költségén bővül, összhangban van az egér embrió korai ventralizációjával. Ennek a fenotípusnak az érintett állatok halálához kell vezetnie, mivel a későbbi szakaszokban nem találtak kóros allantois-val rendelkező homozigóta mutánst. Ennek a fenotípusnak a elemzése molekuláris jelölőkkelnem végezték el, mert olyan kevés abnormális embriót kaptak.

perinatális letalitás

a várható Chrd-/-állatoknak csak 49% – a (95 a 194-ből) gyógyult meg születéskor, mindegyik ugyanazt a teljesen penetránsfenotípust mutatta. Ezek közül a többség halva született,de néhányan sikertelenül próbálták felfújni a tüdejüket. Külsőleg a homozigóta mutáns újszülöttek valamivel kisebbek voltak, mint vad típusú alomtársaik, és cianózist,mikrocefáliát és a külső fül csökkenését mutatták, amely abnormálisan közel volt a szemhez (ábra. 3A’).Szövettani vizsgálat (ábra.3B’ – C’) feltárta a thymus (t, a harmadik garat tasak származéka) és a másodlagos szájpad (p) hiányát, valamint a belső fül (ie) hypoplasia hiányát a mutánsokban. Az anterior lebeny és a pars intermedia of thepituitary mirigy(pi), mindkettő a dorsalis orális ektodermából származik, közvetlenül az anterior endoderma cephalic határánál, normálisak voltak (ábra. 3C, C’). Ez határozza meg az oropharynx fenotípusának rostrális határát, aalformációk a Chrd-expresszáló endoderma származékaira korlátozódnak. A pajzsmirigy, amely a ventrális garat endodermában alakul ki a foramen caecumnál, megkülönböztetett, de hipoplasztikus és szabálytalan alakú volt(th, ábra. 3C’). A pharathyroid mirigyek, a 3.és 4. garat tasakok származékai hiányoztak(az adatok nem jelennek meg), ami a DiGeorge-szindrómában szenvedő egyének újszülöttkori hypocalcaemiájával összhangban volt(DiGeorge, 1968). Megállapítottuk, hogy a Chrd – / – halva született egerek fenotípusa összefoglaljaaz ilyen egyénekben leírt jellemzők többségét.

csontrendszeri hibák

Chrd-/- újszülött állatok csontvázkészítményeiben a függelék és az ágyéki csontok normálisak voltak, de a koponya alapja és az elülső axiális csontváz többszörös hibákat mutatott. Az ideiglenes csontban bekövetkezett változások közé tartozott a squama temporalis (st) hiánya és a járomív rövidülése (ábra.4A, A’). Jelentős hypoplasiát figyeltünk meg a thehyoid csontokban, valamint a pajzsmirigy és a cricoid gége porcokban(ábra. 4B’), és anabormálisan kis állkapocs (ábra.4C’). A koponya alján az alisphenoid (as)normálisnak tűnt, de a középvonalban a basioccipital (bo) és a basisphenoid(bs) csontok összeolvadtak, és a presphenoid (ps) hipoplasztikus volt(ábra. 4D, D’). A szövettani leletekkel összhangban a palatinus polcok nem terjedtek ki mediálisan a másodlagos szájpad kialakítására. A fül, a dobhártya gyűrű és otic kapszulacsökkent, és deformálódott (ábra.4D’). Csontváz rendellenességeket is megfigyeltek a méhnyakbanés a gerincoszlop mellkasi régiói. Csigolyatestek (vb) voltakkisebb a Chrd-/- újszülötteknél(ábra. 4E’), a késleltetettfosszifikáció és alkalmi elvesztése más elemek a csigolyák, mint aspinous folyamatok, neurális ívek és az elülső ív az atlasz (ábra. 4E és Fig. 5A’).

A Chrd mutánsok csontvázhibái már kimutathatók voltak az E14.5-nél (ábra.5A, A’). A bazioccipital és a basisphenoid porcok összeolvadtak, és a basioccipital csontosodási központja keskenyebb volt, és kiterjesztették a basisphenoidba (ábra.5B, B’). Az elülső notochord, amely a vad típusú basioccipital középvonalában volt jelen, hiányzott a Chrd mutánsokban (ábra. 5B, B’). Az elülső notochord hiányát a nyaki régió szövettani vizsgálata igazolta az E14.5-nél (ábra.5F’).

A Chrd mutáció által érintett csontok nagyon különbözőekeredetű. A basioccipital tisztán somitikus eredetű; a basisphenoid részei a cephalic mesenchyme endokondrális csontosodásából származnak; a palatin a neurális címer-származtatott mezenchyme intramembranos csontosodásából származik; az otic kapszulák megkülönböztetik a paraxiális Mezoderma és a neurális címersejtek keverékét; és a hyoid szigorúan neurális címerből származik (Le Douarin and Kalcheim,1999). A vonalak ilyen sokfélesége közepette, úgy tűnik, hogy a fenotípus egyesítő elve a hibás struktúrák elhelyezkedése a Chrd-t kifejező axiális mezendoderma közelségében(ábra. 1E). Ez az értelmezés összhangban van a Chrd-/- állatokban az elülső notochord megfigyelt korai degenerációjával, valamint a prechordalis lemez és a mesendoderma származtatott jelek követelményével a fej vázának kialakulásához (Belo et al., 1998; Couly et al., 2002; David et al.,2002).

DiGeorge-szerű kardiovaszkuláris rendellenességek

a születéskor megfigyelt cianózis a szívműködési zavar jele lehet. Hogyezt tovább vizsgálják, az embrionális fejlődés különböző szakaszaiban boncolásokat végeztünk. Az E14.5, a szív ofChrd – / – állatok mutatott egyetlen hajó, ahelyett, hogynormál két, a szív kiáramlási traktus (ábra. 5D, D’, E, E’).Ez az állapot emberben perzisztens truncus arteriosus néven ismert, és fontos fejlődési rendellenesség DiGeorge-szindrómában szenvedő egyéneknél. A felszálló aorta és a pulmonalis törzs közötti elválasztás hiánya megnövelheti a jobb kamra munkaterhelését, ami hipertrófiát okozhat, valamint az E14.5 embrióban észlelt értágulat, ödéma és vérzés(ábra. 5C’). Mint inDiGeorge-szindróma, a szív-és érrendszer hibái túlmutattak a kiáramlási traktuson, és magukban foglalták a garat archartériáiból származó nagy ereket (ábra. 6). Az újszülöttrd mutánsokban a közös carotis artériák közvetlenül csatlakoztak a truncusarteriosushoz, ami a brachiocephalic artéria és az aortaív egy részének hiányát eredményezte (ábra. 6A-C).A pulmonalis artériák közvetlenül a proximális truncusarteriosusból származnak, ami közös pulmonalis törzs hiányát eredményezi(ábra. 6A-C). Ezenkívül laterális hibákat figyeltek meg, a mutánsok 40% – ának rendellenes jobbra fordulásával (ábra. 6, hasonlítsa össze a 6-ot a 6F-vel). Amikor a hátsó részből boncolást végeztünk, ezlátható, hogy a csökkenő aorta lateralitásától függően a jobb vagy a bal szubklavia artériák abnormális retrooesophagealposition-t fogadtak el (ábra. 6D-F). Hasonló hibákat írtak le a neurális címersejtek ablációival rendelkező Csaj embriókban (Kirby et al., 1983), valamint a DiGeorge congenic régióban(Lindsay et al., 1999; Merscher et al., 2001) ormutációk a Tbx1-ben és az Fgf8-ban(Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002; Jerome and Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Vitelli et al., 2002b).

születéskor a várható Chrd homozigóta mutánsoknak csak 49% – a voltfelfedezték. Azonban a várt 48 56 (86%) Chrd-/-embrió még mindig életben volt az E14.5-nél boncolt almokban, ez a gyakoriság nem jelentősen különbözik az E8.5-nél megfigyeltektől (88%). Az E14.5 utáni letalitás hirtelen növekedése egybeesik a cardiovascularis fenotípus teljes megnyilvánulásával, és arra utal, hogy a keringési rendellenesség a Chrd-/- embriók letalitásának fontos oka a késői terhesség alatt.

garat rendellenességek

a garat fenotípusának kialakulásának meghatározásához a coitum utáni különböző időpontokban a heterozigóta párokból származó terhes nőket boncoltunk. Az E9.0, astage, amelynél a Chrd a garat endodermájában fejeződik ki, a Chrd-/- embriókat a nyaki régió bemélyedésével lehet azonosítani (ábra.7A’, nyíl). A mutánsok otikus vezikulumait csökkentettüka normál átmérőjük felére (ábra.7A’, nyílhegyek), a második (hyoid) garat ív volthiányzik. Garat ívek három-hat soha nem alakult mutáns embriók (ábra. 7B ‘ és az adatok nem jelennek meg). A hiányzó vagy rosszul formált struktúrák vagy közvetlen prekurzorok, vagy induktív szerepet játszanak számos olyan szerv fejlődése során, amelyek a születéskor hibásak a Chrd – / – egerekben. Mivel az újszülött mutánsoknál megfigyelt fenotípusos rendellenességek többsége embriológiai eredetű a garat endodermájában és a garat perifériájában, számos olyan gén expresszióját elemeztük, amelyekről ismert, hogy fontos fejlődési szerepük van az emberi örökletes betegségben.

először a pax3 expresszióját vizsgáltuk, amely a neurális gerincben, a dorsalis neurális csőben és a somitokban(Goulding et al., 1991). Inhumans, a PAX3 mutálódik az 1-es és 3-as típusú Waardenburg-szindróma(Strachan and Read, 1994), valamint a SOX10-vel együtt a microphthalmia orMITF gén (Bondurand et al.,2000), a transzkripciós faktor mutálódott Waardenburg szindrómában2a típus emberben (Tassabehji et al.,1994). A pax3 mutációja a splotch (Sp2H) egérben szívhibákat eredményez, többek közötttartós truncus arteriosus, valamint a csecsemőmirigy, a pajzsmirigyés mellékpajzsmirigy (Conway et al.,1997). Megállapítottuk,hogy a pax3 expresszió megkülönböztethetetlen volt a mutáns és a vad típusú embriók között az E7.5-nél (nem látható), de az E10.5-nél jelentős különbségeket figyeltek meg. A Pax3-positiveneural crest sejtek vándorolnak keresztül garat ívek 3, 4 és 6 (ábra. 7C, nyílhegyek) voltak alig kimutatható Chrd – / – állatok (ábra. 7C’). Ezek a neuralcrest sejtek benépesítik az aortát elválasztó septumot a pulmonalis artériábóla szív kiáramlási traktusában vagy konotruncal régiójában(Li et al., 2000). A szív neurális gerincének hiánya a szív eléréséhez magyarázza a kiáramlási tracteptáció hiányát és az azt követő kardiovaszkuláris fenotípust, amelyet a CRD mutánsokban figyeltek meg. Érdekes módon a pax3 expressziója más szövetekben, mint például az első garatív mandibularis (md) komponense, a dermomyotomes(dm) és a myoblast prekurzorok a mellső végtagokban (FL) nem volt hatással(ábra. 7C’).

ezután in situ hibridizációkat hajtottunk végre Sox10-gyel, egy genemutált 4-es típusú Waardenburg-szindrómás egyéneknél (Pingault et al., 1998), amely a neurális crest és a Schwann sejtekben fejeződik ki. Az E7.5-nél az ox10 expressziója azonos volt a Chrd -/-embriókban és a vad típusú alomtársaikban (az adatok nem jelennek meg). Az E9.5-nél a törzs hátsó gyökér ganglionjainak (drg) sox10 expressziója normális volt(ábra. 7B, B’), de a sox10-et expresszáló gliasejtek eloszlása specifikus hibákat tárt fel a perifériás idegrendszer szervezésében a nyakban és a mutánsok fejrészében (ábra.7B’). Különösen a koponya szenzoros ganglionok jeleztékrendellenességek. A trigeminális (tr) és vestibulo-cochleáris (VC) ganglionok,amelyek a V és VIII agyideg megfelelői voltak, közelebb helyezkedtek el együtt a Chrd-/- embriókban, mint a vad típusú itatótársakban. Ezenkívül a kettőt összekötő rendellenes ideg-vetületeket látták (ábra. 7B’, nyílhegy). A VII, IX és X koponyaidegeknek megfelelő geniculate (g), petrosal (p) és nodose (n) ganglionok voltak a leginkább érintettek, vagy a méretük rendkívüli csökkenését, vagy teljes hiányát mutatták. Ez a három ganglia az epibranchialis placódákból származik, és ismert, hogy megfelelő fejlődésükhöz induktív jelekre van szükség az elülső endodermától(Begbie et al., 1999). Az epibranchialis placode-eredetű ganglionok hiánya azt jelzi, hogy a szekretált proteinChrd szükséges a garat endodermája által kibocsátott induktív jel aktivitásához.

A Pax9 egy transzkripciós faktor, amely a garat endodermájának és származékainak egérben történő kifejlődéséhez szükséges (Peters and Balling, 1999; Peters et al., 1998). Az E9.5, expressziója Pax9 a garat endoderma ofChrd – / – embriók gyengébb volt, mint a vad-typelittermates (pe, ábra.7D, D’). Pax9 expresszió kiderült, hogy a méret ésa garat alakja megváltozott a Chrd mutánsokban, a pharyngealpouches egyetlen duzzanatra csökkent az anterior-most régióban (ábra. 7E, E’). Aa garat hypoplasia-ját az E14.5embryos szövettani szakaszai igazolták, amelyekben az elülső endoderma vékony csőként jelent meg, amely felvázolja a lumen jelentősen csökkent (ph, ábra.5F, F’). A garat endodermájának csökkenését a Xenopus Chrd leütéseiben is megfigyelték (Oelgeschl stb.,2003). A nem garat régiók, amelyekben a Pax9 mRNS általában expresszálódik, mint például a somitic sclerotomes (sc) és az arc mesenchyme(fm), nem mutattak különbséget az átiratok eloszlásában vagy bőségében (ábra.7F, F’).

ezekből a vizsgálatokból arra következtetünk, hogy a pax3, Sox10 andPax9 expresszió változásai a széles körű expressziós domének nagyon korlátozott területére korlátozódnak, ami arra utal, hogy a szekretált fehérje hiánya kifejezetten megzavarja a Chrd-t expresszáló endodermát körülvevő perifériális gégerégióban ható helyi szabályozási utakat.

a Tbx1 és az Fgf8 expresszióhoz chordin

szükséges a Chrd kölcsönhatásának vizsgálata az egerekben ismert DiGeorge vagy DiGeorge-szerű fenotípusokat okozó génekkel, elemeztük az ofTbx1 és az Fgf8 expresszióját Chrd mutáns embriókban. A tbx1 a T-box transzkripciós faktorok családjának tagja (Papaioannou and Silver, 1998). Feltérképezi a DGS/VCFS 22q11 mikrodeléciót az emberekbenés nemrégiben kimutatták, hogy DiGeorge-szerű fenotípust okoz az egerek inaktiválásakor (Jerome and Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Merscher et al., 2001; Vitelli et al.,2002a). A Tbx1 expressziója megváltozott inChrd – / – embriók. A vad típusú E7. 5 állatok, Tbx1is kifejezve a foregut (jövő garat endoderma)és a fej Mezoderma (ábra. 8A). Ebben a szakaszban a mutáns alomtársak egyértelműen csökkentették a Tbx1 expresszió szintjét ugyanazon a területen (ábra.8A’). A Tbx1 mRNS csökkenése ugyanolyan egyértelmű Volta Chrd homozigóta embriók garat régiójában E8.0, E8.5 ése9.0 (ábra.8B’, C’, D’). Keresztirányú szövettani szakaszokmegmutatta, hogy a sejtek szintjén a tbx1 transzkripciók bőségesdrasztikusan csökkent az endodermában, mind a garatban, mind az előbélben a máj divertikulum szintjéig (ábra.8F-H’) A tbx1 mRNS koncentrációjának csökkenésea mezodermában is nyilvánvaló volt, beleértve a fejet, a splanchnikus (nyílhegyek) ésszomatikus Mezoderma (nyilak) a peripharyngealis régióban(ábra.8F’, G’, H’). Ezenkívül a tbx1 expresszió az E9-nél az első garatív mezodermális magjában voltdiffúzus, amely az ív nagy részéig terjedt, a tbx1 átiratok pedig hiányoztak az oticus vezikulumból (ábra.8D-D’).

az Fgf8 egy szekretált növekedési faktor, amely különféle szövetekben fejeződik ki, beleértve a garat endodermáját és a szomszédos mezodermát(Crossley and Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).A korai fejlesztés során az fgf8 szükséges a gasztrulációhoz (Sun et al., 1999) és a bal/jobb szimmetriatengely felállítása(Meyers and Martin, 1999). Atlater szakaszában fgf8 szükséges végtag(Lewandoski et al., 2000; Moon and Capecchi, 2000) andcraniofacial (Trumpp et al., 1999) fejlesztés. A legújabb kísérletek azt mutatták, hogy az egerekcsökkent Fgf8 aktivitás a cardiovascularis ésfaryngealis hibák spektrumát mutatja be, amelyek szorosan utánozzák a DiGeorge-szindrómát (Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002). Ezenkívül az Fgf8 expresszió megszűnik a garat endodermájában ofTbx1 – / – mutánsok, és mindkét gén genetikailag kölcsönhatásba lép a garatív artériák differenciálódása során (Vitelli et al., 2002b). Az AtE9, Fgf8 expresszió a Chrd mutánsokban normális a közép-hátsó agy isthmusban, a frontonasalis kiemelkedésben és a farokban. A pharyngealendodermben azonban az Fgf8 átirat szintje drasztikusan csökken (ábra. 8E’). A Tbx1 és az Fgf8 expresszió redukciója a Chrd – / – embriókban azt sugallta, hogy mindkét gén a Chrd után ugyanazon szabályozási útvonalon hat. Ezek a kísérletek nem határozzák meg, hogy a garatban és a szomszédos szövetekben a tbx1 és fgf8 fenntartásához vagy indukciójához szükséges-e a Crdis.

annak tesztelésére, hogy a Chrd képes-e indukálni a Tbx1-et és az Fgf8-at,Chrd mRNS-t (50 pg) injektáltunk a Xenopus embriók ventrális régiójába a négysejtes szakaszban. A ventrális marginális zóna (VMZ)explantjait a korai gasztrulában boncoltuk, addig tenyésztettük, amíg a testvér embriók el nem érték a korai neurula stádiumot, és az RTPCR elemezte. A Tbx1 és az fgf8 mRNS-ek ebben a szakaszban nagy mennyiségben expresszálódtak a teljes embriókban és a dorsalmarginalis zóna (DMZ) explantokban, és alacsony szinten a VMZ explantokban(ábra. 8I, sávok 1-3). Uponmicroinjekcióval a Chrd mRNS növelte a TBX1 ésfgf8 szintjét VMZ-ben (ábra. 8I, 4. sáv). A mikroinjektált Xenopus embriók in situ hibridizációjamegerősítette, hogy a Chrd mrnaw által indukált Tbx1 transzkriptumok a garat endodermájában találhatók (az adatok nem jelennek meg). Arra a következtetésre jutottunk, hogy a Bmp antagonista, a chrd Tbx1 és Fgf8 expressziót indukálhat Xenopus embriókban, és szükséges ezen gének teljes expressziójához az egér embrió garat régiójában.