háttér: a krónikus limfocita leukémia (CLL) klasszikus immunfenotípussal rendelkezik, amely könnyű lánc korlátozásból áll, CD5+, CD19+, dim CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10 – és CD79b-. Ez megkülönbözteti a normál B-sejtektől és más limfoproliferatív rendellenességektől (LPD). Az ezeket az antigéneket célzó antitesteket két 8 színű áramlási citometriai panel tartalmazza, amelyeket az Euroflow konzorcium fejlesztett ki a B-sejtes LPD-k felépítésére. Ezeknek az antitesteknek egy 10 színű panelbe történő kombinálása költséghatékonyabb lenne. Ezenkívül az új CLL terápiák mély remissziókat indukálhatnak, növekvő igényt teremtve a minimális reziduális betegség (MRD) mérésére, amelynek meghatározása szerint több mint 1 reziduális leukémiás sejt van 10 000 leukocitára (10-4). A CLL-re vonatkozó európai kutatási kezdeményezés (ERIC) által az MRD mérésére létrehozott jelenlegi nemzetközi szabványosított megközelítés a CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b és CD81 ellenanyagok paneljét használja. Ezek az antitest-fluorokróm kombinációk azonban különböznek az Euroflow diagnosztikai panelek által használtaktól. Így az MRD-vizsgálat végrehajtását fontolgató laboratóriumoknak 3 különböző panelhez (2 diagnosztikai és 1 MRD) kell antitesteket vásárolniuk. Az Euroflow 8 színű lymphocyta szűrőcsövet (LST) CD200-ra és CD23-ra is kiterjesztettük, így a CLL egy 10 színű csőben kimutatható, akár 0,01% – os szinten is. A tanulmány célja az volt, hogy meghatározza az új panel megvalósításának lehetséges költségmegtakarításait, és meghatározza, hogy elég érzékeny-e az MRD kimutatására.
módszerek: kiszámítottuk a módosított 10 színű LST csővel (mLST1, liofilizált) elemzett minták számát 2018 áprilisától 2019 márciusáig, hogy kizárjuk az LPD-t, valamint az ezzel a megközelítéssel mentett antitest alikvotok számát A standard 2 csöves Euroflow módszerhez képest. Létrehoztuk a fent említett panel (mLST2) változatát is folyékony antitestek felhasználásával, hogy növeljük eredményeink általánosíthatóságát, CD38-at CD43-mal helyettesítve, hogy lássuk, javult-e ez az MRD kimutatás (lásd az alábbi paneleket). Az MRD vizsgálathoz 24 különböző beteg CLL mintáit használtuk 60 MRD minta előállításához a leukémiás sejtek különböző koncentrációiban. A mintákat úgy állítottuk elő, hogy a CLL-sejteket normál leukocyták szuszpenzióiba tettük, megközelítőleg 0,1%, 0,01% és 0,001% koncentrációban. Minden mintát aliquotáltak és megfestettek a három panellel: ERIC, mLST1 és mLST2. Az adatokat BD FACSCanto II vagy BD FACSAria Fusion segítségével gyűjtöttük össze,majd BD FACSDiva szoftver segítségével elemeztük. A CLL-sejteket a kulcsfontosságú markerek differenciális expressziója alapján azonosítottuk, az MRD-t pedig a CLL-sejtek/az összes leukocita számaként számítottuk ki. Az MRD pozitivitást 0,01% – ban határoztuk meg. A testületek közötti megállapodást a Bland-Altman telek módszerével értékelték. Kiszámítottuk a panelek közötti százalékos megállapodást az MRD pozitivitás azonosításában is.
eredmények: 1 év alatt az mLST1-et 474 mintán végezték, ezek közül 220-nak volt LPD-je, 123-nak (56%) pedig klasszikus CLL-fenotípusa volt, így nincs szükség további vizsgálatokra. Ez 476 antitest alikvot nettó megtakarítását eredményezte. Az MRD értékeléséhez a CD5 és CD20 differenciális expressziója volt a legjelentősebb közreműködő a CLL megkülönböztetésében a normál B-sejtektől az mLST1 és mLST2 alkalmazásával. Egy CLL-esetet azonosítottunk atipikus immunfenotípussal (dim CD5, bright CD20), amely mLST panel segítségével nehéznek bizonyult. Az MRD eredményeit illetően egyetértés volt az mLST-panelekkel és az ERIC-panelekkel. A mennyiségi meghatározás határát meghaladó értékek esetében a megegyezés 95% – os határa 0,3369 log volt az ERIC vs mLST1 összehasonlítás esetén, és 0,3485 log az ERIC vs mLST2 összehasonlítás esetén. Így a panelek közötti MRD-szintek változékonysága az idő nagy részében kevesebb, mint 2-szeres volt, amit klinikailag elfogadhatónak tartottunk, mivel az MRD-t exponenciális skálán mérjük. Az ERIC panel és az mLST1 88,3% – os egyetértésben különböztette meg az MRD-pozitív és az MRD-negatív mintákat. Az ERIC testülete és az mLST2 között 93,3% – os megállapodás született.
következtetések: módosított 10 színű LST panel használata mind a CLL diagnosztizálásához, mind az MRD méréséhez megvalósítható. Az előnyök az antitestek fokozott ismerete és a potenciális költségmegtakarítás, ami az MRD-t több citometriai laboratórium számára elérhetővé teszi. Az atipikus CLL esetek a szokásos CD5 pozitivitás és a dim CD20 nélkül nagyon nehéz LST panel használatával. Ezekben az esetekben az ERIC panel egyértelműen jobb, mivel a CD22, CD79b, CD81 és CD43 még mindig képes elválasztani a rosszindulatú és a normál limfocitákat.
Bazinet:BD Biosciences: egyéb: az ebben a projektben felhasznált antitestek jelentős mennyiségét díjmentesen biztosította.. Wever: Teva Canada Innovation: Foglalkoztatás. Gimmig: BD Biosciences: foglalkoztatás. Johnson: Lundbeck: foglalkoztatás, Honoraria, tagság a gazdálkodó egység igazgatótanácsában vagy tanácsadó bizottságaiban, egyéb: utazási díjak, ajándékok és mások, kutatásfinanszírozás; Merck: tanácsadás, Honoraria; Roche: tanácsadás, foglalkoztatás, Honoraria, tagság a gazdálkodó egység igazgatótanácsában vagy tanácsadó bizottságaiban, egyéb: utazási díjak, ajándékok és mások, kutatásfinanszírozás; Abbvie: tanácsadás, foglalkoztatás, Honoraria, tagság a gazdálkodó egység igazgatótanácsában vagy tanácsadó bizottságaiban, kutatásfinanszírozás; BD Biosciences: Egyéb: Feltéve, hogy a projektben felhasznált antitestek jelentős része ingyenes.; BMS: tanácsadás, Honoraria; Seattle genetika: Honoraria.