Hoe DNA – extractie uit gedroogde bloedvlekken uit te voeren met Chelexhars

elke biowetenschapper die DNA wil analyseren, weet dat het proces begint met de extractie van DNA uit cellen van belang. Deze cellen zouden RBCs, parasieten, of bacteriën kunnen zijn om er een paar te noemen. Voorts zijn er diverse DNA-extractiemethoden1 om van afhankelijk van steekproeftype, stroomafwaartse analyse te kiezen, enzovoort. Veel wetenschappers beginnen met gedroogde bloedvlekken (DBS) en dus hoe DNA uit dergelijke monsters te halen is van bijzonder belang. Een DBS wordt algemeen voorbereid, door bloed op een Whatman FTA card2 of Whatman chromatographic 3 mm filterpapier te verzamelen, en het te laten drogen voor een periode (~4 uur) vóór verwerking. Deze methode van biobemonstering wordt al tientallen jaren gebruikt.

een nuttige methode voor het isoleren van DNA van dergelijke monsters met behulp van BT Chelex 100 Resin3 wordt hieronder beschreven.

Stap 1: Erytrocytenlysis

• knip een droge bloedvlek uit en plaats deze in een microcentrifugebuis (1,5 ml) met behulp van een gatenpons. Vergeet niet om de tube te labelen, vooral als je aan meerdere samples werkt. Voor kwaliteitscontroledoeleinden, ook een positieve controle bloedvlek.
• voeg 1 ml 0,5% saponine toe aan de microcentrifugebuis die de bloedvlek bevat. Sluit, vortex, en incubeer bij 4 0C gedurende ten minste 4 uur, of beter nog, ‘ s nachts. In deze stap, saponine complexen met cholesterol in het erytrocyt membraan die tot de vorming van poriën in het membraan en vandaar hemolyse leiden.4 saponine is een veelgebruikt lysereagens bij het vrijmaken van parasieten (bijvoorbeeld malariaparasieten) uit rode bloedcellen.
• draai een paar seconden bij 4.000 toeren per minuut om druppels van het binnenste deksel te verwijderen en zuig het saponine uit de buis met behulp van een niet-barrière pipet tip bevestigd aan een pasteur pipet op een vacuüm assemblage machine. Een plastic pasteur pipet kan ook worden gebruikt. Laat de plek in de microcentrifugebuis.

stap twee: wassen

• voeg 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing toe aan de microcentrifuge, sluit, vortex, en incubeer bij 4 0C gedurende 20-30 minuten. Incuberen ‘ s nachts zal geen schade veroorzaken. Deze stap zorgt ervoor dat saponine uit de buis wordt verwijderd.
• draai een paar seconden bij 4.000 toeren per minuut en verwijder vervolgens de PBS, op dezelfde manier als u de saponine verwijderde. Laat de plek in de microcentrifugebuis.

Stap drie: DNA-extractie met Chelexhars

Principe: Chelexhars voorkomt de afbraak van DNA uit degradatieve enzymen (DNases) en Uit potentiële contaminanten die downstreamanalyses zouden kunnen remmen. In het algemeen zal de chelex-hars dergelijke verontreinigingen vangen, waardoor DNA in oplossing achterblijft. De chelex-hars arresteert kationen zoals Mg2+, een belangrijke co-factor voor DNase-actie, waardoor het DNA tegen degradatie wordt beschermd.5,6

• Pipetteer en voeg 150µL Chelex-harsoplossing van 6,7% toe aan de microcentrifugebuis die de vlek bevat. Sluit de buis. Een belangrijke herinnering: gebruik bij de bereiding van de 6,7% chelex-oplossing water dat vrij is van Dnasen, nucleasen (of iets dat DNA kan beschadigen en afbreken).Incubeer gedurende 10 minuten bij 95 ° C met behulp van een warmteblok/ schudapparaat. Het is belangrijk om de buis tweemaal te openen, elke 2 minuten, om de druk los te laten en daarna een paar seconden te schudden. Dit geeft DNA vrij in oplossing.

Stap vier: vermijd Chelex-harsparels in het uiteindelijke Extract

• Spin gedurende 5 minuten bij 4.000 toeren per minuut
• Pipetteer zoveel mogelijk extract in een kleinere microcentrifugebuis (0,6 ml) met behulp van een aerosolbarrièrepunt en vermijd overdracht van Chelex-parels.Centrifugeer de 0,6 ml microcentrifuge bij 4.000 toeren per minuut gedurende 10 minuten. Het idee van de tweede spin is om de resterende Chelex-parels te verwijderen die in het uiteindelijke extract kunnen worden overgedragen. Waarom is dit belangrijk? Twee belangrijke redenen: 1) Chelex bindt aan magnesiumionen (essentiële co-factor voor Taq-polymerase gebruikt in PCR) en 2) chelex fluoresceert. Als de fluorescentie uw manier is om een resultaat te visualiseren, kan dit tot vals positief leiden.Pipetteer ongeveer 100 µL en breng het uiteindelijke extract over in een nieuwe microcentrifuge. Etiket en bewaar in de koelkast.

enkele Tips tijdens het uitvoeren van DNA-extracties

• werk in een schoon milieu zonder contaminanten
• gebruik pipettips die vrij zijn van nucleasen
• behandel alle monsters met handschoenen
• vermijd Chelexparels in uw uiteindelijke extract

conclusie

Chelex-hars7, biedt een eenvoudige en snelle DNA-extractiemethode uit DBS, voor gebruik in diverse moleculaire analytische toepassingen. Deze methode vereist geen dure apparatuur en is betrouwbaar wanneer getest tegen andere methoden.

1. GE Healthcare (2010). Betrouwbare extractie van DNA uit Whatman FTA Kaarten. Toepassingsnota 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, UK: GE Healthcare.
2. Whatman (n.d.). Een FTA-schijf voorbereiden voor DNA-analyse. Whatman FTA Protocol BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) Chelex® 100 en Chelex 20 Chelaatvormende ionenuitwisselingshars handleiding. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio-Rad Laboratories.
4. Baumann, E., Stoya, G., Völkner, A., Richter, W., Lemke, C., and Linss, W. (2000). Hemolyse van menselijke erytrocyten met saponine beïnvloedt de membraanstructuur. Acta Histochemica, 102 (1), 21-35.
5. IBRC (2016). Extractieprotocol: Chelex. IBRC-website. Geraadpleegd op http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C. S., Boissaye, R., Stewart, J., and Staton, P. (n. d.). Ontwikkeling en interne validatie van een CHELEX ® DNA-Extractieprotocol voor Referentiewabs voor oraal gebruik.Walsh, P. S., Metzger, D. A., and Higuchi,R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 als een Medium voor eenvoudige extractie van DNA voor PCR-gebaseerde typering uit Forensisch materiaal. Biotechniques, 54 (3), 134-139.