het industriële anaerobe Clostridium acetobutylicum gebruikt polyketiden om cellulaire differentiatie

bacteriestammen en media

te reguleren C. acetobutylicum ATCC 824 werd gekweekt in een anaerobe kamer (Coy-laboratoriumproducten) met een atmosfeer van 97% stikstof en 3% waterstof. 2xYTG medium 67 bevat 16 g / l trypton, 10 g / l gistextract, 5 g/l NaCl en 10 G / L glucose (tenzij anders aangegeven) met een pH van 5.2 voor vloeibare media en 5.8 voor vaste media (die ook 15 g/l agar bevatten). Clostridial growth medium (CGM)68 bevatte 30 g / L glucose (tenzij anders aangegeven), 6,25 g/l gistextract, 2,5 g/L ammoniumsulfaat, 1,25 g/l NaCl, 2,5 g/l asparagine, 0,95 g/l monobasisch kaliumfosfaat, 0,95 g/l dibasisch kaliumfosfaat, 0,5 g/l magnesiumsulfaat heptahydraat, 13 mg/l mangaansulfaat heptahydraat en 13 mg/L ijzersulfaat heptahydraat met een pH van 6,4. P2 medium 69 bevat 80 g / L glucose (tenzij anders aangegeven), 1 g/l gistextract, 2,2 g/L ammoniumacetaat, 0.5 g / l monobasisch kaliumfosfaat, 0,5 g / l dibasisch kaliumsulfaat, 0,2 g/l magnesiumsulfaat heptahydraat, 1 mg/l para-aminobenzoëzuur, 1 mg/l thiaminehydrochloride, 10 µg/l biotine, 10 mg/l mangaansulfaat heptahydraat, 10 mg/l ferrosulfaat heptahydraat en 10 mg / l NaCl met een pH van 6,4. Clostridial basaal medium (CBM)70 bevat 10 G/L glucose, 0,5 g/l monobasisch kaliumfosfaat, 0,5 g/l dibasisch kaliumfosfaat, 4 g/l trypton, 0.2 g / L magnesiumsulfaat heptahydraat, 10 mg/l mangaansulfaat heptahydraat, 10 mg / l ferrosulfaat heptahydraat, 1 mg/L para-aminobenzoëzuur, 1 mg/l thiamine hydrochloride, en 2 µg / l biotine met een pH van 6,9. Voor vaste CGM-platen werd 15 g / L agar toegevoegd. CBM-S (gebruikt voor liquid sporulation assays) was identiek aan CBM behalve 50 g/L glucose werd gebruikt, en 5 G/L CaCO3 werd toegevoegd vlak voor inoculatie van culturen. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) werd gekweekt in Luria-Bertani (LB) medium bij 37 °C. Voor de geschikte Clostridium-stammen werd de kweekmedia aangevuld met erytromycine (Ery; 40 µg/mL voor vaste media, 80 µg/mL voor vloeibare media) en/of thiamfenicol (Th; 5 µg/mL voor vaste en vloeibare media). Kanamycine (kan; 60 µg/mL) of chlooramfenicol (Cm; 25 µg/mL) werden toegevoegd aan E. coli kweekmedia zoals aangegeven. Clostridium-en E. coli-stammen werden gehandhaafd als 20% V / v glycerolvoorraden opgeslagen bij -80 °C.

Plasmideconstructie

oligonucleotiden werden geleverd door geïntegreerde DNA-technologieën (aanvullende tabel 5). Phusion polymerase (NEB) werd gebruikt voor alle PCR-reacties. Voor isolatie van genomic DNA van C. acetobutylicum ATCC 824, werd een alkalische lysis methode gebruikt71. C. acetobutylicum werd ‘ s nachts gekweekt in 2xytg medium tot stationaire fase( OD600 > 2,0), op welk punt 10 mL cultuur werd gecentrifugeerd bij 3500×g gedurende 15 min (kamertemperatuur). Het supernatant werd weggegooid en de celpellet werd geresuspendeerd in 5 mL SET buffer (75 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Lysozym werd toegevoegd aan een eindconcentratie van 2 mg/mL en de oplossing werd voorzichtig gemengd. Het mengsel werd gedurende 60 minuten bij 37 °C geïncubeerd en elke 15 minuten voorzichtig gemengd. Na de incubatieperiode werd 660 µL lysisbuffer (1 M NaOH, 10% g/v SDS) toegevoegd en werd de oplossing grondig gemengd. Proteïnase K werd toegevoegd aan een eindconcentratie van 0,5 mg/mL en de oplossing werd gedurende 1 uur bij 55 °C geïncubeerd. na deze incubatieperiode werd een gelijk volume fenol:chloroform (1:1) toegevoegd en de oplossing werd gedurende 5 minuten door inversie gemengd. De oplossing werd vervolgens gecentrifugeerd bij 3500×g gedurende 15 min (kamertemperatuur) en de bovenste waterfase werd door pipetteren weggegooid. Aan de organische fase werd 3 M natriumacetaat toegevoegd (10% v/v in de uiteindelijke oplossing). Om genomic DNA neer te slaan, werden 2 volumes ethanol toegevoegd en werd de oplossing gemengd. Precipitated genomic DNA werd verzameld gebruikend een glashaak, en gewassen met 70% ethylalcohol. Het gewassen DNA werd vervolgens gedurende 15 minuten gedroogd over stikstofgas, geresuspendeerd in een lage te-buffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) en opgelost door incubatie bij 50 °C.

voor het construeren van plasmide pKO_mazF_mod (dat later zou dienen als een sjabloon voor pKO_pks), werden primers pKON_Fo en pKON_Ro gebruikt om een 5,0 kb-regio van de pko_mazf template te versterken. Deze stap was nodig om een 677 BP regio te verwijderen uit de pko_mazf backbone, die we niet konden versterken via PCR. Het 5.0 kb PCR product werd gel gezuiverd, verteerd aan de 5′ en 3 ‘ uiteinden met behulp van PshAI, gelig gemaakt om pko_mazf_mod te vormen, en omgezet in E. coli TOP10. Transformant klonen werden gescreend door gezuiverde plasmide test spijsvertering, en sanger het rangschikken werd gebruikt om de opeenvolging van de definitieve pko_mazf_mod kloon te bevestigen. Voor de constructie van plasmide pKO_pks (voor de verwijdering van de pks-gen van C. acetobutylicum), een 3.8 mb regio met colE1, repL, bgaR, en mazF waren PCR geamplificeerd van pKO_mazF_mod het gebruik van primers pKO_F en pKO_R. Bovendien, primers UHR_Fo en UHR_Ro, en DHR_Fo en DHR_Ro werden gebruikt voor PCR versterken 1 kb regio ’s die de upstream-en downstream-homologe regio’ s (UHR en DHR) aan weerszijden van de pks-gen (CA_C3355) van een C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA template. Het chlooramfenicol / thiamfenicol resistentiegen en constitutieve promotor (P ptb van C. acetobutylicum) werden PCR versterkt uit pKO_mazF_mod met behulp van primers CMR_F en CMR_R (1,1 kb regio). Deze vier PCR-producten werden via Gibson-assemblage gelig gemaakt en omgezet in E. coli TOP10. Transformant klonen werden gescreend door gezuiverde plasmide test spijsvertering, en sanger het rangschikken werd gebruikt om de opeenvolging van de definitieve pko_pks kloon te bevestigen. Voor het construeren van plasmide pAN315 (noodzakelijk voor methylering van pKO_pks en pCKO_pks voorafgaand aan omzetting in C. acetobutylicum), werd een 6,4 kb gebied van plasmide pAN172 versterkt gebruikend primers pAN1_F en pAN1_R, en een 1.0 kb gebied met het Kanamycin resistentiegen van vector pCOLA_Duet werd versterkt gebruikend primers KAN_Fo en kan_ro. De gel geëxtraheerde PCR producten werden gelig gemaakt via Gibson assemblage en omgezet in E. coli TOP10. Transformant klonen werden gescreend door gezuiverde plasmide test spijsvertering, en sanger het rangschikken werd gebruikt om de opeenvolging van de definitieve pan3 kloon te bevestigen. Voor het construeren van plasmide pCKO_pks (voor expressie van het PKS gen onder de constitutieve crotonase promotor van C. acetobutylicum), primers CPKS_Fo en CPKS_Ro werden gebruikt om het 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 PKS gen (CA_C3355) te versterken met passende uitsteeklengtes voor Gibson assemblage. De pwis_empty vector71 backbone (die de constitutieve CRT promotor stroomopwaarts van de multiple cloning site bevat) werd PCR versterkt met behulp van primers pWIS_F en pWIS_R die een 5,0 kb product opleveren. De twee gel gezuiverde PCR producten werden gelig gemaakt via Gibson assemblage en omgezet in E. coli TOP10. Transformant klonen werden gescreend door gezuiverde plasmide test spijsvertering, en sanger het rangschikken werd gebruikt om de opeenvolging van de definitieve pcko_pks kloon te bevestigen.

voor het construeren van plasmide pET24b_pks werd het 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 PKS gen (CA_C3355) versterkt uit het genoom-DNA van C. acetobutylicum met behulp van primers PKS_Fo en PKS_Ro. Dubbel verteerde vector pET24b (EcoRI / xhoi verteerd) werd geligeerd met dubbel verteerde pks PCR product (EcoRI/XhoI verteerd), en het ligatie product werd omgezet in E. coli TOP10. Transformant klonen werden gescreend door gezuiverde plasmide test spijsvertering, en sanger het rangschikken werd gebruikt om de opeenvolging van de definitieve pet24b_pks kloon te bevestigen.

Elektrotransformatie van C. acetobutylicum

Vector pko_pks werd via elektroporatie samen met pAN3 omgezet in E. coli TOP10. Deze procedure maakte methylering van pKO_pks noodzakelijk voor het overwinnen van het inheemse restrictie-modificatiesysteem actief in C. acetobutylicum 72. Plasmide zuivering van E. coli pko_pks / pAN3 vloeibare cultuur werd uitgevoerd, en het resulterende plasmide mengsel werd gebruikt voor elektroporaties van C. acetobutylicum met behulp van de eerder gepubliceerde method72 die we hier in detail. Om elektrocompetente cellen te bereiden, werd een enkele kolonie van C. acetobutylicum uit een 2xytg-plaat (meer dan 1 week oud) gedurende 10 minuten door hitte geschokt bij 80 °C, en gebruikt om 10 mL CGM in te enten. Na een nacht incuberen bij 37 °C en het bereiken van de mid-exponentiële fase (OD600 0,4-0,9), werd 6 mL cultuur gebruikt om 54 mL verse 2xYTG inoculeren. Deze subcultuur werd geïncubeerd bij 37 °C tot het bereiken van OD600 1.2 (~5 uur), waarbij de subcultuur gedurende 20 min (4 °C) werd gecentrifugeerd bij 3500×g. Na verwijdering van het supernatant werd de celpellet geresuspendeerd in 20 mL ijskoude elektroporatiebuffer (EPB; 270 mM sucrose, 5 mM NaH2PO4, pH 7,4). De geresuspendeerde cellen werden gecentrifugeerd bij 3500×g gedurende 10 min (4 °C), het supernatans werd weggegooid en de celpellet werd geresuspendeerd in 20 mL ijskoude EPB. Na een laatste pelletering door centrifugering bij 3500×g gedurende 10 min (4 °C), werd het supernatant weggegooid en werd de pellet geresuspendeerd in 2,3 mL ijskoude EPB. Deze laatste resuspensie werd gebruikt als de voorraad elektrocompetente cellen. Elektro-transformaties werden uitgevoerd door eerst mengen (over ijs) 500 µL bevoegde cellen en ~20 µL plasmide DNA-oplossing (1-5 µg totaal) worden getransformeerd. Het mengsel werd overgebracht naar een 0,4 cm elektroporatie cuvette, en liet 15 minuten op ijs incuberen. Elektroporaties werden uitgevoerd met de volgende parameters: spanning, 2000 V; Capaciteit, 25 µF; weerstand, oneindige Ω. Na elektroporatie werden de monsters geresuspendeerd in 1 mL 2xYTG en overgebracht naar een buis met 9 mL 2xYTG. Na menging door inversie konden de culturen gedurende 4 uur bij 37 °C worden teruggewonnen. de terugwinningsculturen werden gedurende 15 minuten (kamertemperatuur) bij 3500×g gecentrifugeerd en het supernatans werd weggegooid. De celpellet werd geresuspendeerd in 500 µL 2xYTG en 100 µL werd geplateerd op vaste 2xytg-platen aangevuld met het juiste antibioticum. De plaat werd gedurende 2-3 dagen bij 37 °C geïncubeerd en transformantkolonies werden onderworpen aan PCR-verificatie.

deletie van PKS-gen en genetische complementatie

gerichte KO van het PKS-gen (ca_c3355) in C. acetobutylicum ATCC 824 werd bereikt met behulp van de eerder gepubliceerde methode15. In detail werd 5 µg geméthyleerd pko_pks / pAN3 plasmidemengsel omgezet in C. acetobutylicum volgens de hierboven beschreven methode. Na terugwinning in vloeibaar 2xytgmedium gedurende 4 uur werden de celkorrels verzameld door centrifugeren (3500×g, 15 min, kamertemperatuur), resuspendeerd in 0,5 mL verse vloeistof 2xYTG, en 100 µL van de geresuspendeerde celcultuur werd geplateerd op vaste 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 mM β-lactoseplaten. Onder deze plating voorwaarden, worden slechts cellen die de gewenste dubbele crossover homologe nieuwe combinatiegebeurtenis hebben ondergaan verwacht om te overleven. De tegenselectie van de vector backbone wordt verzorgd door de lactose-induceerbare promotor (P bgaL ), die het toxinegen mazF op de pko_pks Vector backbone aandrijft. Na deze plating procedure werden ongeveer 10 kolonies waargenomen op de 2xytg + 5 µg/mL Th + 40 mM β-lactose platen. Van deze 10 kolonies, vier werden tweemaal opnieuw getrokken en onderworpen aan kolonie PCR verificatie. Vier sets primers werden gebruikt als basis van kolonie PCR verificatie, zoals gedetailleerd in aanvullende Fig. 2.

voor het genereren van de PKS genetische complementatie stam werd elektroporatie van ∆PKS C. acetobutylicum met een pcko_pks/pAN3 plasmidemengsel uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Na elektroporatie en terugwinning werden de culturen op vaste media 2xytg + 5 µg/mL Th + 40 µg/mL ery geplateerd. Na tweemaal herrezen op vaste 2xytg + 5 µg/mL Th + 40 µg/mL Ery media, werden potentiële kolonies met pcko_pks gescreend via kolonie PCR met behulp van primers pCKO_F en pCKO_R.

LC-HRMS metabolomic analysis

voor niet-gerichte metabolomic vergelijkingen van wild-type en ∆PKS C. acetobutylicum, werden afzonderlijke kolonies van elke stam gedurende 10 minuten hitteschok gegeven bij 80 °C en gebruikt om 10 mL vloeibaar CGM (30 g/L glucose) in te enten. Na een nachtelijke incubatie (stagnerend) tot het bereiken van OD600 ~1,0, werden deze culturen gebruikt om 10 mL vloeibaar CGM (80 g/L glucose) met een 10% entmateriaal voor subculturing in te enten. Na ~5 uur (OD600 ~ 1.0) van stagnerende groei, werden de subculturen gebruikt om Viervoudige kolffermentaties (70 mL CGM, 80 g/L glucose + 5 µL Antifoam 204, 3% entmateriaal) te enteren die via magnetische roerstaven worden bewogen. Calciumcarbonaat (6 g/L) werd toegevoegd aan het fermentatiemedium voor pH-buffering. Al het kweken werd uitgevoerd bij 37 °C. Ongeveer 5 µg / mL Th werd opgenomen in alle culturen van ∆pks met uitzondering van de definitieve gistingscultuur, aangezien bepaalde antibiotica gekend zijn om de ABE gistingsfasen te verstoren. Monsters van gistingsbouillon (1 mL) van elk duplo werden genomen tijdens de vroege stationaire fase en geëxtraheerd met 3 mL 2:1 chloroform methanol. De mengsels werden vortexed, gescheiden door centrifugatie (2700×g, 10 min), en de bodem chloroform-rijke laag werd overgebracht naar een glazen flacon. Deze organische extracten werden gedroogd met stikstofgas, geresuspendeerd in 100 µL methanol, en 10 µL werd geïnjecteerd op een Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass QTOF LC-MS instrument uitgerust met een Agilent Eclipse Plus C18 kolom (4,6 × 100 mm). Er werd gebruik gemaakt van een lineaire gradiënt van 2-98% CH3CN (vol/vol) over 40 min in H2O met 0,1% mierenzuur (vol/vol) bij een debiet van 0,5 mL/min. Het metabolomic analyseplatform XCMS16 (het onderzoeksinstituut Scripps) werd gebruikt om metabolomes van wild-type en ∆PKS spanningen te vergelijken die op de quadruplicate LC-HRMS gegevens worden gebaseerd. Ms pieken uniek aan ∆pks (Fig. 1a) werden geïdentificeerd aan de hand van de volgende parameters: p-waarde < 0,01, vouwverandering > 10,0, piekintensiteit > 5000.

bioreactor fermentaties

om ABE fermentatieprofielen van wild-type en ∆PKS C te vergelijken. acetobutylicum, bioreactor fermentaties werden uitgevoerd in DASGIP bioreactoren (4 × GPI 100 Schepen, DASGIP Bioblock systeem) met 500 mL werkvolumes. Overnight culturen (10 mL CGM, 30 g/L glucose, stagnerend, 34 °C) geïnoculeerd met warmte geschokt individuele kolonies van C. acetobutylicum werden gekweekt tot het bereiken van OD600 ~1. Een 10% entmateriaal werd vervolgens gebruikt om een subcultuur te starten (30 mL P2 media, 80 g/L glucose, stagnerend, 34 °C), en de subcultuur werd geïncubeerd tot het bereiken van OD600 ~1. De subculturen van 30 mL werden vervolgens aseptisch overgebracht naar individuele Dasgip bioreactoren, vooraf geladen met 500 mL P2 medium (80 g/L glucose, 100 µL antischuim 204, 34 °C). De fermentatie werd gedurende 54 uur toegestaan met periodieke bemonstering voor optische dichtheidsmetingen, fermentatieproductanalyse en kwantificering van de verbindingen 1, 2 en 3. De temperatuur werd gehandhaafd op 34 °C gedurende de gisting, roeren werd verzorgd door roeren bij 200 rpm, en de pH werd gehouden boven 5,0 via automatische toevoeging van 3 M NH4OH. Om anaërobe omstandigheden te handhaven, werd zuurstofvrij stikstofgas gedurende de fermentatie met een snelheid van 2 sL/uur afgevoerd. Voor de kwantificering van de verbindingen 1, 2 en 3 werd 1 mL gistingsbouillon gemengd met 3 mL ethylacetaat, vortexed, gescheiden via centrifugering (2700×g, 10 min, kamertemperatuur), en de bovenste organische laag geïsoleerd. De organische laag werd gedroogd door rotatieverdamping, geresuspendeerd in 200 µL methanol, en 20 µL werd geïnjecteerd op een Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (met DAD) instrument uitgerust met een Agilent Eclipse Plus C18 kolom (4,6 × 100 mm). Er werd gebruik gemaakt van een lineaire gradiënt van 2-98% CH3CN (vol/vol) over 40 min in H2O met 0,1% mierenzuur (vol/vol) bij een debiet van 0,5 mL/min. De verbindingen 1, 2 en 3 werden geïdentificeerd door UV-absorptie (240 nm), zoals aangetoond in Fig. 1b, en werden gekwantificeerd door het geïntegreerde piekoppervlak (absorptie bij 240 nm).

analytische Fermentatieprocedures

een spectrofotometer werd gebruikt om de celdichtheid te bepalen door de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) te meten. Een Shimadzu Prominence uflc systeem uitgerust met een biorad Aminex HPX-87H kolom (300 mm × 7,8 mm) werd gebruikt om C. te analyseren. acetobutylicum fermentatiebouillon voor de concentratie van glucose en fermentatieproducten (acetaat, butyraat, lactaat, aceton, butanol en ethanol). Monsters van gistingsbouillon (1 mL) werden eerst gepelleteerd door centrifugeren bij 10.000×g gedurende 3 minuten, gevolgd door filtratie van het supernatans met behulp van een 0,22 micron PVDF spuitfilter. Monsters van gefilterd supernatant (20 µL) werden geïnjecteerd op het UFLC-systeem met 0,01 n zwavelzuur mobiele fase stromend bij 0,7 mL/min, kolomtemperatuur van 35 °C, en werden gedurende 35 minuten chromatografeerd. Analyten werden ontdekt door gebruik van een brekingsindexdetector (gebruikt om concentraties van glucose, acetaat, lactaat, butanol, en ethanol te kwantificeren) en een diode array detector (gebruikt om concentraties van butyraat (208 nm) en aceton (265 nm) te kwantificeren).

RNA-isolatie en RNA-Seq-analyse

monsters (10 mL) van fermentatiebouillon werden genomen in biologisch triplicaat van bioreactor fermentaties van het wild-type en ∆PKS C. acetobutylicum 26 uur na inoculatie. De monsters werden gecentrifugeerd (4000×g, 10 min, 4 °C) en de pellets werden geresuspendeerd en opgeslagen in RNAprotect-Celreagens (Qiagen). Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van een RNeasy Mini Kit (Qiagen) volgens de instructies van de fabrikant. Een on-column DNase behandeling werd uitgevoerd met behulp van DNase I (RNase-vrij) (NEB). De kwaliteitscontrole van RNA, bibliotheekbouw, en het rangschikken van de bibliotheek werden uitgevoerd door het functionele Genomicslaboratorium van de Universiteit van Californië-Berkeley QB3 en Vincent J. Coates Genomic rangschikkend laboratorium. De kwaliteit en de concentratie van RNA werden beoordeeld gebruikend een nanochip op een Agilent 2100 Bioanalyzer. Bacteriële 16S en 23S rRNA werd verwijderd met behulp van een Ribozero Kit (Illumina). Het resulterende boodschappersRNA (mRNA) werd omgezet in een RNA-Seq bibliotheek gebruikend een mRNA-Seq uitrusting van de bibliotheekbouw (Illumina). De bibliotheek van RNA het rangschikken werd uitgevoerd op Illumina HiSeq4000 met 50 BP enige eindlezen. Het rangschikken leest (50 bp ) werden verwerkt en in kaart gebracht aan het genoom van C. acetobutylicum ATCC 824 (NCBI toetreding NC_003030.1 en NC_001988.2) gebruikend CLC Genomics Workbench 9.0 met standaardparameters. Leest die niet uniek uitgelijnd aan het genoom werden verworpen. De verschillen in genuitdrukking tussen wild-type en ∆PKS C. acetobutylicum werden berekend gebruikend de zelfde software. Genen werden geacht differentieel tot expressie te komen met p-waarde < 0,003 (gebaseerd op een ongepaarde t-test, n = 3) en |genormaliseerde fold change |> 2,0. Foutieve correcties van de discovery rate op p-waarden werden berekend in CLC Genomics Workbench 9.0 met behulp van een gepubliceerde methode73. De resultaten van de RNA-Seq analyse worden gepresenteerd in aanvullende gegevens 1. STRING analysis30 werd uitgevoerd om veronderstelde eiwit–eiwitinteractie tussen de differentieel tot expressie gebrachte genen te bepalen die door RNA-Seq analyse worden geopenbaard.

fenotype vergelijkingstests

Vloeistofsporulatietesten werden uitgevoerd met kleine wijzigingen74. Monsters werden genomen uit biologische vloeibare culturen in drievoud na 5 dagen incubatie (30 mL CBM-S, 37 °C). De 20 µL monsters waren hitteschok (80 °C, 10 min), verdunningen (101-106) werden gespot op 2xYTG platen, en kolonies werden geteld na 30 uur incubatie (37 °C) om het aantal hittebestendige kolonievormende eenheden (cfu/mL) te berekenen. Voor chemische aanvulling van ∆pks in de liquid sporulation assay, werd gezuiverd clostrienose (uiteindelijke concentratie 3,5 µM) aangevuld in cbm-S culturen van ∆PKS C. acetobutylicum op het moment van inoculatie. Aangezien verbinding 3 als geconcentreerde oplossing in methanol werd toegevoegd, werd het equivalente volume methanol (60 µL) toegevoegd aan alle andere vloeistofsporulatietestculturen (wild-type en niet-aangevuld ∆pks) om dit effect te controleren.

voor vaste sporulatiebepalingen werd een eerder beschreven methode75 toegepast, met enkele wijzigingen. In detail werden de individuele kolonies met een hitteschok (80 °C, 10 min) gedurende 24 uur in vloeibare media (10 mL CGM, 37 °C) gekweekt. culturen werden met een factor 106 verdund en op vaste CBM geplateerd. De bemonstering werd 1, 2, 3, 4 en 6 dagen na de eerste plating uitgevoerd. Voor de bemonstering werden drie afzonderlijke kolonies gecombineerd en grondig geresuspendeerd in 60 µL vloeibaar CGM. 20 µL van het geresuspendeerde koloniemengsel werd vervolgens door hitte geschokt (80 °C, 10 min), verdunningen (101-106) werden gespot op 2xYTG-platen en kolonies werden geteld na 30 uur incubatie (37 °C) om het aantal hittebestendige kolonievormende eenheden (cfu/kolonie) te berekenen. Alle monsters werden uitgevoerd als biologische triplicaten.

granuloseaccumulatiebepalingen werden uitgevoerd via jodiumkleuring53. Mid-log fase (OD600 ~0,6) vloeibare culturen (P2, 37 °C) werden geplateerd op vaste 2xYTG medium met verhoogde glucose niveaus (50 g/L) om granulose productie mogelijk te maken. De platen werden gedurende 4 dagen bij 30 °C geïncubeerd, waarna ze gedurende 10 minuten werden blootgesteld aan een bed van jodiumkristallen. De platen werden vervolgens toegestaan om 10 minuten voor beeldvorming. Voor chemische aanvulling van ∆pks in de granuloseaccumulatietest werd gezuiverd clostrienose (uiteindelijke plaatconcentratie 4,0 µM) ingebed in vaste 2xytgplaten voorafgaand aan het Plateren van ∆pks-cultuur. Aangezien clostrienose werd toegevoegd aan 2xYTG-platen als geconcentreerde oplossing in methanol (gemengd in de gesmolten media vóór stolling), werd het equivalente volume methanol (6 µL) toegevoegd aan alle andere 2xytg-platen die worden gebruikt in de granuloseaccumulatietests om dit effect te controleren.

individuele kolonies van C. acetobutylicum, gekweekt op CBM-platen gedurende 48 uur (37 °C), werden bekeken en afgebeeld met behulp van een Leica MZ16 F-dissectingmicroscoop uitgerust met een Leica DFC300 fx-camera.

Olieverspreidingstests werden uitgevoerd zoals eerder beschreven 76, 77, 78. In detail werd een glazen bekerglas van 400 mL (binnendiameter 7,5 cm) gevuld met 300 mL water en werd een druppeltje paraffine lampolie van 10 µL toegevoegd en over een periode van 5 minuten (diameter~25 mm) verspreid in een dunne film op het wateroppervlak. Oplossingen van surfactine, gezuiverd clostrienose en een kaliumfosfaatbuffercontrole werden bereid bij de aangegeven pH en concentratie (bereid in 10 mM kaliumfosfaatbuffer). Ongeveer 10 µL monster werd zorgvuldig toegevoegd aan het midden van de oliefilm, en het effect op de oliefilm werd waargenomen. Monsters met oppervlakteactieve activiteit zullen naar verwachting stabiele circulaire openings zones in de oliefilm vormen, met een sterkere oppervlakteactieve activiteit die overeenkomt met grotere openings zones (of volledige dispersie van de oliefilm voor zeer hoge oppervlakteactieve activiteit). Drop collapse assays werden uitgevoerd77, 79, 80. Ronde microwells (8 mm binnendiameter) in het polystyreen deksel van een 96-microwell plaat (12,7 × 8,5 cm) werden bekleed met een dunne laag paraffine lampolie door 2,0 µL paraffine lampolie toe te voegen aan elk putje, en waardoor de druppel gelijkmatig over de microwell verspreid over een periode van 1 uur. Monsters van surfactine, gezuiverd clostrienose en kaliumfosfaat controle werden bereid zoals voor de olie verspreiding assays. Ongeveer 5 µL monster werd zorgvuldig toegevoegd aan het centrum van de microwell. Na 5 minuten werd de vorm en de mate van verspreiding van de druppel waargenomen. Terwijl buffercontroles naar verwachting stabiele parels op het microwelloppervlak vormen, wordt verwacht dat monsters die oppervlakteactieve stoffen bevatten, samenvouwen en zich over het microwelloppervlak verspreiden, waarbij een sterkere oppervlakteactieve activiteit overeenkomt met een hogere mate van druppelverspreiding.

zuivering en in vitro analyse van PKS-eiwit

om het his6-gelabelde PKS-eiwit te zuiveren voor in vitro analyse, werd pET24b_pks omgezet in E. coli BAP1. Een enkele kolonie werd ingeënt in 10 mL LB + 50 µg / mL kanamycin (Kan) voor overnight groei bij 37 °C. Ongeveer 7 mL van overnight cultuur werd gebruikt om 700 mL LB + 50 µg/mL Kan inoculeren, en de cultuur werd geschud bij 240 rpm en 37 °C tot het bereiken van OD600 van 0,5. Na 10 minuten ijsvorming werd isopropylthio-β-d-galactoside (IPTG) toegevoegd aan een eindconcentratie van 0.1 mM om eiwitexpressie te induceren, en de cultuur werd geïncubeerd bij 16 °C gedurende 16 uur. de cellen werden geoogst door centrifugeren (5500×g, 4 °C, 20 min), resuspendeerd in 25 mL lysis buffer (25 mM HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazol), en gelyseerd door homogenisatie over ijs. Celresten werden verwijderd door middel van centrifugering (17.700×g, 4 °c, 60 min) en Ni-NTA-agarosehars werd toegevoegd aan het supernatant (2 mL/l-cultuur). Het mengsel werd gedurende 1 uur bij 4 °C bewerkt, in een kolom van de zwaartekrachtstroom geladen en het PKS-eiwit werd geëlueerd met toenemende concentraties imidazol in Buffer a (20 mM HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). Het gezuiverde PKS-eiwit werd geconcentreerd en buffer uitgewisseld in buffer a + 10% glycerol gebruikend een centrifugale Concentrator van Vivaspin. Aliquots van gezuiverd PKS-eiwit werden aliquoted en flash bevroren in vloeibare stikstof. De geschatte eiwitopbrengst was 5 mg / L (203 kDa).

een PKS-belastingtest met 14C-gelabeld substraat bevat, in een totaal volume van 15 µL, 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.5 mM CoA, 2-14C-malonzuur (0,1 µCi), 10 µM MatB, 17 µM PKS, en 50 mM HEPES, pH 8,0. Na 2 uur incubatie bij 25 °C werden de monsters geblust door een gelijk volume van 1× SDS-monsterbuffer toe te voegen. Na analyse van de SDS–pagina met een 4-15% TGX-gel (criterium) werd de gel gedurende 2 uur bij 50 °C gedroogd en gedurende 5 dagen op een opslagfosforscherm (20 × 25 cm; moleculaire dynamica) blootgesteld. Radioactief gelabeld eiwit werd afgebeeld op een Typhoon 9400 phosphorimager (opslag Phosphor mode, 50 µm resolutie; Amersham Biosciences).

voor in vitro producttests (50 µL) van het PKS-eiwit werd 8 µM PKS geïncubeerd met malonyl-CoA (2 mM) in fosfaatbuffer (100 mM, pH 7,0) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om verbinding 4 te genereren, geïdentificeerd in vergelijking met een chemische standaard. NADPH (2 mM) werd aan de analyse toegevoegd om samenstellingen 5 en 6 te produceren, die beide door vergelijking met chemische normen werden geà dentificeerd. Na incubatie werden de assaymengsels tweemaal geëxtraheerd met 100 µL 99% ethylacetaat/1% azijnzuur (v/v). De organische extracten werden gedroogd en geresuspendeerd in 100 µL methanol, en 10 µL werd geïnjecteerd op een Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (met DAD) instrument uitgerust met een Agilent Eclipse Plus C18 kolom (4,6 × 100 mm). Er werd gebruik gemaakt van een lineaire gradiënt van 2-98% CH3CN (vol/vol) over 40 min in H2O met 0,1% mierenzuur (vol/vol) bij een debiet van 0,5 mL/min. LC-HRMS analyse van de assay extracten werd uitgevoerd op een Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass QTOF LC-MS instrument uitgerust met een Agilent Eclipse Plus C18 kolom (4.6 × 100 mm) met dezelfde oplosmiddelgradiënt en debiet als hierboven beschreven.

beschikbaarheid van gegevens

RNA-seq gegevens gegenereerd in deze studie zijn gedeponeerd in ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) onder toelatingsnummer E-MTAB-6019. Alle andere relevante gegevens zijn op verzoek verkrijgbaar bij de auteurs.