Résultats et discussion
Au cours de notre étude de la signalisation des dommages à l’ADN (32, 33), nous avons observé deux bandes proéminentes dans les immunoblots Chk1: la bande Chk1 à 56 kDa et une bande à migration plus rapide de 43 kDa. La bande à migration plus rapide a été détectée par des anticorps Chk1 réactifs au domaine kinase interne ou à la séquence C-terminale, mais pas par des anticorps Chk1 reconnaissant la terminaison N (Fig. 1 BIS). Cette bande n’a pas été reconnue par l’anticorps monoclonal G4 de la biotechnologie de Santa Cruz qui est couramment utilisé pour l’analyse immunoblot de Chk1 (24, 29). Le knockdown de Chk1 via siRNA a entraîné la disparition de Chk1 et de la bande de 43 kDa, confirmant encore leur pertinence (Fig. 1B). La protéine de 43 kDa n’a pas été affectée par les inhibiteurs du protéasome et de la protéase (annexe SI, Fig. 1), soulevant la possibilité qu’il pourrait s’agir d’une variante d’épissure alternative de Chk1. La base de données du Centre national d’information sur la biotechnologie répertorie actuellement trois ARNM humains Chk1 épissés alternativement qui ont des régions variables non traduites mais codent la même protéine Chk1 pleine longueur de 476 acides aminés (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Cependant, notre analyse utilisant une base de données prédictive d’épissage alternative basée sur l’EST (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) a suggéré la possibilité d’une variante d’épissure unique de Chk1 dans laquelle l’exon 3 est alternativement épissé ou supprimé. Pour tester directement cette possibilité, nous avons effectué une RT-PCR en utilisant des amorces dans la séquence de codage Chk1 (Fig. 1C). La RT-PCR utilisant l’ensemble d’amorces P1, dans lequel l’amorce directe a été conçue à l’intérieur de l’exon 3, a généré un seul amplicon de la taille attendue, tandis que la RT-PCR avec l’ensemble d’amorces P2 ou P3 (toutes deux basées sur des séquences flanquant l’exon 3) a généré deux amplicons, l’un ayant la taille attendue de Chk1 et l’autre ∼200 pb plus court (Fig. 1C). Le séquençage a confirmé que l’amplicon le plus long était bien Chk1 et, notamment, l’amplicon le plus court était une variante d’épissure alternative de Chk1 dépourvue d’exon 3 (Fig. Annexe 1D et SI, Fig. 2 BIS). On a prédit que cette variante d’épissure se traduirait par une forme tronquée N-terminale de Chk1 constituée de 382 acides aminés que nous avons nommés Chk1-short, ou Chk1-S (Fig. Annexe 1D et SI, Fig. 2). Lors de l’électrophorèse sur gel, les Chk1-S traduites in vitro ont migré de la même manière que la protéine de 43 kDa des cellules HEK293 (Fig. 1E). Nous avons également immunoprécipité la protéine de 43 kDa du lysat cellulaire HEK293 pour la spectrométrie de masse et confirmé son identité en tant que Chk1-S. La troncature N-terminale de Chk1-S est cohérente avec les résultats d’immunoblot montrant qu’elle n’était pas reconnue par les anticorps réactifs à la séquence N-terminale de Chk1 (Fig. 1 BIS). L’analyse RT-PCR en temps réel a détecté l’expression de l’ARNm de Chk1-S dans plusieurs tissus humains, et l’expression est généralement plus élevée dans les tissus fœtaux (annexe SI, Fig. 3 A et D). L’analyse immunoblot a en outre détecté l’expression de la protéine Chk1-S dans les lignées cellulaires humaines, de souris et de rat, ainsi que dans les tissus fœtaux humains (annexe SI, Fig. 3B) et les cellules tubulaires rénales primaires de souris (annexe SI, Fig. 3C). L’ADNc sur toute la longueur de Chk1-S a également été cloné à partir de trois tissus humains normaux (thymus, côlon, foie fœtal) et séquencé pour confirmer qu’il code pour une variante d’épissure tronquée N-terminale de Chk1. Ensemble, ces expériences ont identifié une variante d’épissure unique de Chk1 tronquée N-terminale et largement exprimée dans les cellules et les tissus de mammifères.
Identification de Chk1-S comme une variante d’épissure tronquée à N extrémités unique de Chk1. (A) Le lysat cellulaire HEK293 a été analysé par immunoblot à l’aide d’anticorps reconnaissant spécifiquement la terminaison N (α-Chk1-NT), le domaine kinase (α-Chk1-KD) ou la terminaison C de Chk1 (α-Chk1-CT). En plus de Chk1, une protéine de 43 kDa a été révélée par α-Chk1-KD et α-Chk1-CT, mais pas α-Chk1-NT. (B) Les cellules HEK293 ont été transfectées avec l’ARNsi Chk1 (siChk1) ou une séquence brouillée (siCon) pendant 48 h pour recueillir du lysat de cellules entières pour une analyse immunoblot en utilisant α-Chk1-KD. siChk1 a diminué l’expression de Chk1 et de la protéine de 43 kDa. (C) L’ARN a été isolé à partir de cellules HEK293 pour la RT-PCR en utilisant trois ensembles différents d’amorces pour Chk1: P1, P2 et P3 (les emplacements des séquences relatives sont indiqués dans le diagramme). Deux amplicons ont été détectés par RT-PCR en utilisant les ensembles d’amorces flanquant l’exon 3 (P2 et P3), alors qu’un seul amplicon a été amplifié en utilisant l’ensemble d’amorces P1, dont l’amorce avant se trouvait à l’intérieur de l’exon 3 de Chk1. (D) Représentation schématique d’un épissage alternatif de Chk1 résultant en une protéine tronquée N-terminale, Chk1-S. (E) Chk1-S a été cloné pour une traduction in vitro, et la protéine traduite ainsi que le lysat cellulaire HEK293 ont été analysés par analyse immunoblot. La Chk1 traduite in vitro a migré de manière similaire à la bande de 43 kDa dans les cellules HEK293.
Quelle est la fonction de Chk1-S? Régule-t-il les points de contrôle du cycle cellulaire comme Chk1? Avec ces questions, nous avons d’abord déterminé les modèles d’expression temporelle et spatiale de Chk1-S dans le cycle cellulaire. Les cellules HEK293 ont été synchronisées aux phases G1, G1/S ou G2/M par famine sérique, double bloc de thymidine ou nocodazole, respectivement. Chk1-S était faible dans les cellules en phase G1 et plus élevé dans les cellules G1/S et G2/M (Annexe SI, Fig. 4 A et B). De plus, lorsque les cellules étaient synchronisées à la phase G1/S par un double bloc de thymidine puis libérées, l’expression de Chk1 et de Chk1-S augmentait après l’entrée en phase S (Fig. 2 BIS). Une différence nette entre l’expression de Chk1 et de Chk1-S était que, alors que l’expression de Chk1 culminait à mi-phase S, l’expression de Chk1-S continuait d’augmenter de la phase S à la phase M (Fig. 2 BIS). Fait intéressant, des niveaux élevés d’expression de Chk1-S ont été observés 7 h après la libération du cycle cellulaire par le double bloc de thymidine, un moment où les cellules n’étaient pas encore mitotiques (annexe SI, Fig. 4C). Nous avons également quantifié le rapport Chk1-S:Chk1 dans les cellules asynchrones et synchronisées S ou G2/M. Malgré les variations de l’expression de Chk1-S dans les cellules HEK293, U2OS et tubulaires rénales primaires, le rapport Chk1-S:Chk1 était supérieur à 1 dans toutes les cellules à la phase G2/M (annexe SI, Fig. 5). Dans les cellules asynchrones, Chk1-S et Chk1 étaient principalement localisées dans le noyau (annexe SI, Fig. 6 BIS). Cependant, dans les cellules de phase G2/M, certains Chk1-S et Chk1 se sont accumulés dans les centrosomes (Annexe SI, Fig. 6 B et C). La localisation de Chk1 dans les centrosomes est critique pour sa fonction de point de contrôle G2/M, où elle empêche l’activation prématurée de Cdk1 et l’entrée mitotique (34, 35). Nos résultats indiquent que Chk1-S peut également se localiser aux centrosomes, fournissant une régulation spatiale et temporelle de Chk1 pour initier l’entrée mitotique. Ensuite, nous avons déterminé les effets de la surexpression Chk1 ou Chk1-S dans les cellules HEK293 et U2OS. Par rapport à la GFP-Chk1, la GFP-Chk1-S induit un phénotype nucléaire distingué caractérisé par la condensation nucléaire et la formation de micronoyaux et de noyaux multiples ou multilobés (Fig. 2B). À des moments antérieurs, les cellules transfectées ont montré une condensation nucléaire / chromatine marquée par une phosphorylation faible et ponctuelle de l’histone-H3 (Fig. 2B), indiquant une entrée mitotique prématurée. Plus tard, ces cellules ont développé des micronoyaux ou des noyaux multilobés, caractéristiques de la catastrophe mitotique (Fig. 2B). Le comptage cellulaire a montré que la GFP-Chk1-S induisait le phénotype nucléaire dans ∼20% des cellules U2OS (Fig. 2C). Des effets similaires ont été montrés par YFP-Chk1-S et Chk1-S-Myc (Fig. 2C), indiquant que le phénotype nucléaire observé a été induit par Chk1-S et non par les balises protéiques de fusion. En revanche, l’entrée mitotique prématurée n’a pas été induite par Chk1 ou son mutant mort à la kinase Chk1-KD (Fig. 2C). Chk1-S a également induit le phénotype nucléaire frappant dans d’autres types de cellules (annexe SI, Fig. 7). Notamment, un phénotype nucléaire similaire a été rapporté dans des cellules et des modèles murins dépourvus d’un ou des deux allèles Chk1 (7, 36, 37), suggérant que Chk1-S peut agir comme un inhibiteur endogène de Chk1. Pour tester davantage cette possibilité, nous avons généré des lignées cellulaires Tet-on U2OS qui peuvent être induites pour exprimer Chk1, Chk1-KD ou Chk1-S. Les cellules ont été synchronisées à la phase G1 / S par un double bloc de thymidine, induit par la doxycycline, puis libérées dans un milieu contenant du nocodazole. Environ 80% des cellules exprimant Chk1-S sont entrées en mitose, tandis que 60% des cellules exprimant Chk1- ou Chk1-KD l’ont fait (Fig. 2D). Fait important, alors que la plupart des cellules mitotiques des groupes exprimant Chk1- et Chk1-KD avaient de l’ADN 4n, ∼25% des cellules mitotiques du groupe exprimant Chk1-S avaient une teneur en ADN inférieure à 4n (Fig. 2D), indiquant une entrée mitotique aberrante dans ces cellules sans achèvement de la réplication de l’ADN. De plus, la surexpression de Chk1-S a entraîné une entrée plus précoce dans la mitose, comme l’indique l’apparition de cellules pH3 positives (annexe SI, Fig. 8). Chk1 est un régulateur clé de l’entrée mitotique ou de la transition S-à-G2/ M dans le cycle cellulaire. En phosphorylant CDC25A (induisant sa dégradation) et Wee1, Chk1 empêche l’activation de CDK1 et l’entrée mitotique (5, 15-20). Nous avons montré que l’induction de Chk1-S par la doxycycline dans les cellules Tet-on U2OS entraînait des niveaux plus élevés de CDC25A et des niveaux plus faibles de phospho-CDK1, suggérant que la Chk1-S antagonisait la Chk1 pour induire une entrée mitotique (Fig. 2E). Le knockdown spécifique de Chk1-S via l’ARNi n’a pas réussi car la séquence Chk1-S est contenue dans l’ARNm Chk1. Cependant, un oligonucléotide antisens complémentaire de la jonction unique exon2-exon4 dans Chk1-S pourrait réduire spécifiquement l’expression de Chk1-S (annexe SI, Fig. 9 BIS). La régulation à la baisse de Chk1-S a nettement réduit la prolifération cellulaire (annexe SI, Fig. 9B). Fait intéressant, la régulation descendante de Chk1-S n’a pas modifié de manière significative le profil du cycle cellulaire (annexe SI, Fig. 9C). Étant donné que Chk1 fonctionne à plusieurs points de contrôle du cycle cellulaire (par exemple, G2 / M, fuseau, intra-S), Chk1-S peut antagoniser Chk1 pour faciliter la progression du cycle cellulaire à plusieurs sites. En conséquence, l’inhibition de Chk1-S peut ralentir le cycle cellulaire à différentes phases et entraîner la suppression de la prolifération sans changements majeurs de la distribution du cycle cellulaire.
Régulation du cycle cellulaire par Chk1-S. (A) Les cellules HEK293 ont été synchronisées par double bloc de thymidine puis libérées dans un milieu contenant du nocodazole. (à gauche) Profil du cycle cellulaire analysé par coloration à l’iodure de propidium (PI) et analyse FACS. (à droite) Analyse immunoblot de Chk1 et de Chk1-S dans le lysat cellulaire recueilli à des moments indiqués après la libération du bloc de thymidine. EN tant que cellules asynchrones (B) les cellules U2OS ont été transfectées avec GFP-Chk1 ou GFP-Chk1-S (vert), puis fixées pour l’immunofluorescence de la phospho-histone H3 (rouge) et la coloration nucléaire avec Hoechst33342 (bleu). (Supérieur) Chk1-S, mais pas Chk1, a induit une condensation prématurée de la chromatine et une faible coloration de pH3 (flèches). (Inférieur) À un stade avancé, les cellules transfectées par Chk1-S ont montré les caractéristiques de la catastrophe mitotique, y compris les micronoyaux et les noyaux multilobés (flèches). (C) Les cellules U2OS ont été transfectées avec les gènes indiqués, et les cellules avec le phénotype nucléaire de condensation prématurée de la chromatine et de catastrophe mitotique ont été comptées. Les données indiquent une moyenne ± écart-type; * P < 0,05 par rapport au groupe de vecteurs. Les résultats montrent que la surexpression de Chk1-S a conduit spécifiquement au phénotype nucléaire. (D) Les cellules U2OS ont été transfectées avec les gènes indiqués, synchronisées par double bloc de thymidine, et libérées pendant 7 h. Les cellules ont ensuite été fixées pour l’immunofluorescence pH3 et la coloration PI et analysées par FACS. Les données indiquent une moyenne ± écart-type; * P < 0,05 par rapport au groupe de vecteurs. Les résultats montrent que Chk1-S induit spécifiquement une entrée mitotique prématurée sans achèvement de la réplication de l’ADN (cellules avec < ADN 4n). (E) Des cellules Tet-on U2OS ont été induites avec ou sans doxycycline. Les cellules ont ensuite été synchronisées en phase S par double bloc de thymidine et libérées pendant 7 h. Le lysat de cellules entières a été recueilli pour l’analyse immunoblot des protéines indiquées. Les résultats montrent que l’expression induite de Chk1-S a entraîné une augmentation du CDC25A et une diminution du phospho-CDK1, contribuant à une entrée mitotique prématurée.
Comment Chk1-S antagonise-t-il Chk1? Nous avons émis l’hypothèse que Chk1-S pourrait interagir avec Chk1 pour bloquer son activité kinase. De manière cohérente, le FLAG-Chk1-S exprimé dans les cellules HEK293 est coimmunoprécipité avec le Chk1 endogène (Fig. 3 BIS). De plus, Myc-Chk1 et Chk1-S coimmunoprécipitées traduites in vitro (Fig. 3B), suggérant une interaction directe Chk1-Chk1-S. Nous avons également démontré la coimmunoprécipitation de Chk1 avec le domaine N-terminal, mais pas le domaine C-terminal, de Chk1-S (Fig. 3C), suggérant l’exigence de la séquence N-terminale dans Chk1-S pour son interaction avec Chk1. Fonctionnellement, nous avons déterminé les effets de Chk1-S sur l’activité de la kinase Chk1. Le Chk1-Myc a été exprimé et immunoprécipité pour le dosage in vitro de la kinase en l’absence ou en présence de Chk1-S purifié. Comme le montre la Fig. 3D, l’activité de la kinase Chk1 a été partiellement encore significativement supprimée par Chk1-S, mais pas par Chk1-S dénaturé à la chaleur. En revanche, Chk1-S n’a pas diminué l’activité de Chk2, qui a des préférences de substrat similaires à celles de Chk1. Par rapport à Chk1, Chk1-S manque d’une partie du domaine kinase, y compris le site de liaison à l’ATP (Fig. 1D) et, comme prévu, n’a pas montré d’activité significative de la protéine kinase (Fig. 3D). Chk1-S peut également supprimer l’activité kinase de Chk1 marqué N-terminale (FLAG-Chk1) dans un test de kinase in vitro (annexe SI, Fig. 10). Ces résultats suggèrent que Chk1-S peut inhiber Chk1 par interaction moléculaire. Une étude récente a montré que le lavage des immunoprécipités de Chk1 avec un tampon de dosage Radio-Immuno-précipitation (RIPA) plus rigoureux peut augmenter considérablement l’activité de la kinase de Chk1, suggérant que Chk1 est normalement inhibé par des facteurs de répression (29); cependant, l’identité des facteurs de répression est inconnue. Nous avons confirmé l’effet du lavage du tampon RIPA et, notamment, nous avons également montré que l’ajout de Chk1-S exogène pouvait inverser l’effet du lavage du tampon RIPA sur l’activité de la kinase Chk1 (annexe SI, Fig. 11), suggérant que Chk1-S pourrait être l’un des principaux facteurs de répression endogène de Chk1.
Chk1-S interagit avec Chk1 pour supprimer son activité kinase. (A) Les cellules HEK293 ont été transfectées avec FLAG-Chk1-S ou un vecteur vide pour recueillir du lysat en vue de l’immunoprécipitation (IP) à l’aide d’anticorps anti-FLAG. Les immunoprécipités ont été analysés pour Chk1 et FLAG-Chk1-S par immunoblot à l’aide d’anticorps anti-FLAG et anti-N terminus Chk1, respectivement. Les résultats montrent la co-IP de FLAG-Chk1-S avec Chk1 endogène. B) Le Chk1-Myc et le Chk1-S ont été produits à l’aide du kit de transcription/traduction in vitro TnT (Promega). (à gauche) Production in vitro de Chk1-Myc et de Chk1-S par immunoblot. (à droite) Le Chk1-Myc a été immunoprécipité à l’aide d’anticorps anti-Myc après incubation avec ou sans Chk1-S. Les immunoprécipités ont été analysés pour le Chk1-S et le Chk1-Myc par immunoblot. Les résultats indiquent une interaction directe entre Chk1 et Chk1-S. (C) Des cellules HEK293 ont été transfectées avec du Chk1-S marqué par Myc ou ses mutants à délétion C ou N-terminale pour recueillir du lysat pour immunoprécipitation à l’aide d’anticorps anti-Myc. Les immunoprécipités ont été examinés pour la présence de Chk1. Les résultats démontrent la coimmunoprécipitation de Chk1 avec Chk1-S et son mutant de délétion C-terminal, mais pas avec son mutant de délétion N-terminal. (D) Les cellules HEK293 ont été transfectées avec des Chk1-S, Chk1 ou Chk2 marqués par Myc pour recueillir du lysat en vue de l’immunoprécipitation à l’aide d’anticorps anti-Myc. Les immunoprécipités, contenant Chk1-S-Myc, Chk1-Myc ou Chk2-Myc, ont été incubés avec ou sans Chk1-S pendant 1 h puis ajoutés au test d’activité kinase en utilisant le Chktide comme substrat. Le Chk1-S dénaturé a été préparé par ébullition. Les données indiquent une moyenne ± écart-type; * P < 0,05 par rapport au groupe Chk1-Myc. Les résultats montrent que les Chk1-S natifs peuvent inhiber spécifiquement Chk1. (E) Les cellules HEK293 ont été transfectées avec un mutant Chk1-Myc ou Chk1-Myc (S317A/S345A). Les cellules ont ensuite été non traitées ou traitées avec de la camptothécine à 100 nM pendant 2 h pour recueillir du lysat pour immunoprécipitation avec des anticorps anti-Myc. Les immunoprécipités ont été analysés pour le Myc-Chk1, le Chk1 phosphorylé (sérine 345) et le Chk1-S par immunoblot. L’entrée Chk1 a également été vérifiée dans les échantillons. Les résultats montrent que la Chk1-S est coimmunoprécipitée ou associée à la Chk1 dans les cellules normales et que l’association a été diminuée lors des lésions de l’ADN induites par la camptothécine. Cependant, l’association entre Chk1-S et le mutant Chk1 (S345A/ S317A) n’a pas été perturbée lors de dommages à l’ADN, ce qui suggère que la phosphorylation de Chk1 à S345 et S317 peut être nécessaire pour la dissociation de Chk1-S de Chk1. (F) Les cellules HEK293 ont été cotransfectées avec un vecteur vide Chk1-Myc+ ou Chk1-Myc + dn-ATR, suivi d’un traitement avec de la camptothécine à 100 nM pendant 2 h. Le lysat cellulaire a été collecté pour une immunoprécipitation avec des anticorps anti-Myc, suivie d’une analyse immunoblot des protéines indiquées. Les résultats montrent que la perturbation de la dissociation de Chk1-Chk1–S induite par la camptothécine dépend de l’ATR et de la phosphorylation de Chk1.
Dans la réponse aux dommages à l’ADN (DDR), Chk1 est nettement activé par phosphorylation au niveau des résidus S345 et S317 (7, 13, 38, 39). Malgré la reconnaissance de l’importance de la phosphorylation S345/S317, on ne sait toujours pas comment cette phosphorylation active Chk1 (28-30). Nous avons montré que l’expression de Chk1-S ne changeait pas sensiblement en DDR (Annexe SI, Fig. 12). Cependant, l’interaction Chk1–Chk1-S a été atténuée dans le DDR induit par la camptothécine, un inhibiteur de l’ADN topoisomérase I et un agent dommageable pour l’ADN (Fig. 3E). Notamment, la dissociation de Chk1 de Chk1-S en DDR est apparue dépendante de la phosphorylation de Chk1 à S345/S317, car le mutant Chk1 (S345A/S317A) ne s’est pas dissocié de Chk1-S pendant le traitement à la camptothécine (Fig. 3E). En DDR, l’activation de Chk1 dépend de la phosphorylation médiée par l’ATR (7, 13, 14). Nous avons montré que l’inhibition de l’ATR via un mutant dominant négatif (dn-ATR) supprimait non seulement la phosphorylation de la Chk1-S induite par la camptothécine, mais empêchait également la dissociation de la Chk1–Chk1-S (Fig. 3F). De même, Chk1 s’est dissocié de Chk1-S pendant la DDR induite par le cisplatine, et la dissociation a été empêchée par le dn-ATR (annexe SI, Fig. 13). Ensemble, les résultats suggèrent que la phosphorylation de Chk1 peut perturber son interaction avec l’inhibiteur endogène Chk1-S, conduisant à l’activation de Chk1 en DDR.
L’identification du Chk1-S comme régulateur unique de la progression du cycle cellulaire et de la prolifération cellulaire nous a incités à examiner son expression dans les tissus cancéreux. Au niveau de l’ARNm, la plupart des tissus cancéreux ont exprimé des niveaux plus élevés de Chk1 et de Chk1-S que les tissus normaux (annexe SI, Fig. 14). Fait intéressant, les carcinomes testiculaires ont montré une régulation ascendante marquée de Chk1-S mais pas de Chk1 (Fig. 4 BIS). Une régulation ascendante spécifique de la Chk1-S a été confirmée par une analyse immunoblot dans les tissus du carcinome testiculaire, en particulier dans les échantillons de cancer à un stade avancé (Fig. 4B). Comme indiqué précédemment (5), les tissus testiculaires normaux et malins présentaient des niveaux élevés d’expression de Chk1. Une expression accrue de Chk1-S a également été détectée au cours de la progression du cancer de l’ovaire (Fig. 4B). Le niveau relativement élevé d’expression de Chk1 et de Chk1-S chez les deux fœtus (annexe SI, Fig. 3) et le cancer (Fig. 4) les tissus suggèrent que Chk1-S peut accélérer la progression du cycle cellulaire, favorisant la prolifération cellulaire dans ces conditions.
Régulation Chk1-S dans le cancer. (A) Analyse par PCR en temps réel de l’expression de l’ARNm de Chk1 et de Chk1-S dans les tissus testiculaires normaux et les échantillons de carcinome testiculaire, montrant une régulation ascendante de Chk1-S dans les carcinomes testiculaires. (B) Analyse immunoblot de Chk1 et de Chk1-S dans les tissus cancéreux testiculaires et testiculaires normaux humains, montrant une expression accrue de Chk1-S dans les tissus cancéreux à un stade avancé. (C) Des souris nues ont été injectées avec 10 × 106 Tet-sur des cellules MDA-MB-231 inductibles par la doxycycline pour exprimer respectivement Chk1, Chk1-KD ou Chk1-S. Après établissement de la tumeur à ∼100 mm3, les souris ont été maintenues sur de l’eau potable avec ou sans doxycycline. Le volume tumoral a été mesuré chaque semaine (indiqué pour les valeurs de la quatrième semaine, n = 8). Les données indiquent une moyenne ± SD. Les résultats montrent que l’expression induite de Chk1-S, mais pas de Chk1 ou de Chk-KD, inhibait la croissance tumorale. (D) Densitométrie des résultats d’immunoblot de l’expression de Chk1-Myc induite par la doxycycline, de Chk1-KD-Myc et de Chk1-S-Myc dans les tumeurs excisées (n = 3 pour chaque groupe). Les signaux ont été normalisés avec Chk1-Myc (fixé arbitrairement à 100). Les données indiquent une moyenne ± SD. Les résultats montrent que la doxycycline a induit des niveaux d’expression similaires de Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc et Chk1-S-Myc dans les tumeurs. (E) Des souris nues ont été injectées avec des cellules inductibles Chk1-S pour établir des tumeurs, puis maintenues sur de l’eau potable avec ou sans doxycycline pendant 4 semaines. Des tissus tumoraux ont été collectés pour une analyse immunoblot. Les résultats montrent une expression plus élevée de CDC25A dans les xénogreffes tumorales avec une expression de Chk1-S induite par la doxycycline.
Nous avons également examiné l’effet de l’expression ectopique de Chk1-S sur la croissance tumorale par xénogreffe chez la souris. Des xénogreffes tumorales ont été établies chez des souris nues en utilisant des lignées cellulaires de cancer du sein Tet-on MDA-MB-231 qui peuvent être induites par la doxycycline pour exprimer Chk1, Chk1-S ou Chk1-KD. L’induction de Chk1 ou de Chk1-KD par la doxycycline n’a pas affecté la croissance tumorale; cependant, l’induction de Chk1-S a entraîné une réduction de 40% du volume tumoral (Fig. 4C). Les tissus tumoraux induits par Chk1-S ont également montré une accumulation de cdc25A, indiquant l’inhibition de Chk1 (Fig. 4E). Bien que les résultats puissent impliquer une stratégie anticancéreuse unique, la pertinence physiologique de la surexpression forcée de Chk1-S ectopique reste incertaine. Ces résultats, cependant, fournissent une preuve de principe que l’inclinaison de l’équilibre Chk1–Chk1-S peut conduire à une catastrophe mitotique et à une réduction de la prolifération cellulaire.
L’observation que la surexpression de Chk1-S réduisait la croissance tumorale par xénogreffe (Fig. 4 C-E) semblait contradictoire avec l’observation selon laquelle les échantillons tumoraux de patients humains exprimaient des niveaux relativement élevés de Chk1-S pour la prolifération cellulaire (Fig. 4 A et B et SI Appendice, Fig. 14). Pour rapprocher ces données, il est important de reconnaître les différences entre les conditions expérimentales. L’expression relativement élevée de Chk1-S dans les tumeurs humaines peut être attribuée à la présence de cellules prolifératives dans ces tissus. De manière constante, la Chk1-S est également élevée dans les tissus fœtaux très prolifératifs (annexe SI, Fig. 3 BIS). Il est important de noter que l’expression de Chk1-S dans ces tissus prolifératifs est limitée temporellement à la phase tardive de S à M (Fig. 2 et Appendice SI, Fig. 4). Cette régulation temporelle peut assurer que l’activité Chk1 est inhibée après (et seulement après) l’achèvement de la réplication de l’ADN en phase S pour la progression du cycle cellulaire en phase G2/M. Cependant, lorsque la Chk1-S ectopique est forcée de surexprimer dans des cellules en culture ou des tumeurs xénogreffées, la restriction temporelle de l’expression de la Chk1-S est perturbée; en d’autres termes, la Chk1-S est élevée tout au long du cycle cellulaire, y compris la phase S, entraînant un blocage constant de la Chk-1 et une entrée mitotique prématurée, conduisant à une catastrophe mitotique et à une prolifération cellulaire réduite.
En conclusion, cette étude a identifié une variante d’épissure de Chk1, Chk1-S, qui est un régulateur clé de Chk1 dans le cycle cellulaire normal et pendant la DDR (annexe SI, Fig. 15). Dans le cycle cellulaire non perturbé, l’expression de Chk1 augmente à la phase S et certaines molécules de Chk1 peuvent être phosphorylées par ATR empêchant la liaison de Chk1-S, ce qui entraîne une activité élevée de Chk1 et un maintien en phase S jusqu’à l’achèvement de la réplication de l’ADN. Dans la phase G2, l’expression de Chk1-S augmente et, comme indiqué (29), la phosphorylation de Chk1 diminue, favorisant une interaction Chk1–Chk1-S pour supprimer l’activité de Chk1. La diminution de l’activité Chk1 à la phase G2/M est critique à l’entrée mitotique. Dans des conditions d’induction ou de surexpression de Chk1-S, des quantités excessives de Chk1-S séquestrent Chk1 et diminuent son activité kinase pendant la phase S, entraînant une entrée mitotique prématurée sans achèvement de la réplication de l’ADN, conduisant à une catastrophe mitotique. Pendant les dommages à l’ADN, Chk1 est phosphorylé, ce qui entraîne une diminution de la liaison Chk1-S, une augmentation de l’activité Chk1 et une arrestation G2/M (annexe SI, Fig. 11). Nos résultats soutiennent le mécanisme de « dé-répression » de l’activation de Chk1 (29). Fait important, Chk1-S semble être l’un des principaux facteurs de répression de l’activité de Chk1. En antagonisant Chk1, Chk1-S peut accélérer le cycle cellulaire, entraînant une prolifération accrue dans les tissus fœtaux et cancéreux. Des niveaux élevés de Chk1 dans les cellules en prolifération coordonnent la phase S et la mitose, tandis que des niveaux élevés de Chk1-S peuvent fournir un puissant commutateur pour la transition de phase S vers G2 / M. En revanche, la surexpression forcée de Chk1-S à des niveaux excessifs, déséquilibrée par Chk1, induit une entrée mitotique prématurée et la mort cellulaire (Fig. 2) et supprime la croissance tumorale dans les modèles de xénogreffe tumorale (Fig. 4). Chk1 a été suggéré comme une cible thérapeutique efficace dans le traitement du cancer, et les inhibiteurs de Chk1 sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques (40-43). L’identification de Chk1-S comme inhibiteur endogène de Chk1 pourrait ouvrir de nouveaux domaines de recherche dans la régulation du cycle cellulaire, la réponse aux dommages à l’ADN et la thérapie contre le cancer.