MICROBIOLOGIE VÉTÉRINAIRE
Identification de Clostridium chauvoei dans des échantillons cliniques de cultures à partir de cas à jambe noire, au moyen de la PCR –
Identification de Clostridium chauvoei dans les domaines des matériaux et des cas cliniques à la turquoise, il est symptomatique de l’utilisation de la PCR
St MiyashiroI, * A. F. C. NassarI; M. C. A., M. SouzaI, J. B. CarvalhoI; J. E. B. AdegasII
IInstituto Biológico, São Paulo, SP, Brésil
IIMato Grosso do Sul, Brésil
RÉSUMÉ
La présence de C. chauvoei a été détectée au moyen d’une réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir d’un surnageant de culture dans un milieu de viande cuite d’échantillons de foie, de muscles et de moelle osseuse métatarsienne de sept veaux présentant des symptômes de jambe noire. L’isolement dans des conditions anaérobies d’un échantillon de muscle a révélé Clostridium perfringens en culture pure.
Mots clés: Clostridium chauvoei; jambe noire; bovin; PCR.
résumé
la présence de Clostridium chauvoei a été détectée par réaction PCR à partir d’échantillons de foie, de muscles et de moelle osseuse métatarsienne de viande cuite en milieu de culture provenant de sept veaux atteints d’anthrax symptomatique. L’isolement d’un échantillon musculaire dans des conditions anaérobies a révélé Clostridium perfringens en culture pure.
mots clés: Clostridium chauvoei, anthrax symptomatique, bovin, PCR.
Clostridium spp est l’un des genres qui composent le groupe des bactéries anaérobies d’une importance médicale et économique considérable. La clostridiose est le nom général donné à une variété de maladies causées par les bactéries de ce genre, qui peuvent survenir dans n’importe quelle partie du corps qui offre la condition de leur développement avec la production de toxines conséquente lors de la multiplication (1).
Clostridium chauvoei est l’agent responsable de la jambe noire et de l’œdème malin chez les bovins, les ovins et les autres ruminants (4). La jambe noire chez les bovins est une infection endogène non traumatique, et une proportion considérable de bovins peut héberger C. chauvoei dans leur foie. Les animaux atteints sont anorexiques, déprimés, fébriles et boiteux (un membre latéral), présentant un gonflement chaud et douloureux qui devient froid, œdémateux avec crépitation. La mort est constatée dans les 12 à 48 heures. Cet agent semble avoir une préférence pour les gros muscles (cuisse, diaphragme et cœur), qui à la nécropsie sont foncés, rouges, secs et spongieux (11). Des symptômes ressemblant à la jambe noire peuvent également être causés par Clostridium septicum, C. novyi, C. perfringens ou C. sordellii. Dans une étude récente sur la position phylogénétique de C. chauvoei et C. septicum sur leurs séquences du gène de l’ARNr 16S (rrs), une similitude de 99,3% entre les gènes rrs de C. chauvoei et C. septicum qui se reflète également au niveau phénotypique, a été déterminée (7,8).
Alors que le diagnostic présuntif de la jambe noire et de l’œdème malin dépend des résultats cliniques et pathologiques, la confirmation de la maladie se trouve généralement en isolant et en identifiant l’organisme, comme la production de toxines et les méthodes immunologiques (9,13). Cependant, ces méthodes de diagnostic prennent du temps et sont laborieuses. De plus, les méthodes immunologiques peuvent donner des résultats équivoques car C. chauvoei et C. septicum ont divers antigènes en commun (4).
L’amplification par acide nucléique d’une région cible spécifique du génome bactérien par la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été largement utilisée à des fins de détection et de diagnostic (15). La capacité de la PCR à amplifier l’ADN spécifiquement à partir d’un faible nombre de bactéries, ainsi que sa simplicité, sa rapidité et sa reproductibilité, offrent des avantages par rapport aux méthodes conventionnelles d’identification, et ont été effectivement utilisées pour identifier de nombreuses espèces de Clostridium, y compris C. chauvoei dans des cultures pures et dans des échantillons cliniques (5,7,12,14). Un diagnostic précis de la jambe noire est donc souvent difficile. Le diagnostic standard repose sur un dosage immunofluorescent et sur des critères morphologiques.
Dans cet article, nous décrivons une méthode basée sur la PCR à partir d’un enrichissement préalable en milieu de viande cuite d’échantillons de veaux à jambe noire pour identifier C. chauvoei. Des échantillons de foie, de muscles et de moelle osseuse métatarsienne provenant de veaux présentant des symptômes de jambe noire au cours de l’automne brésilien ont été analysés. Les échantillons prélevés provenaient de six veaux d’un troupeau de l’État de São Paulo et d’un veau de l’État du Mato Grosso do Sul (tableau 1). Tous ces bovins sont morts subitement et ont présenté une crépitation musculaire dans le membre postérieur.
Macérés d’échantillons de foie et de muscles et d’écouvillons de moelle osseuse ont été inoculés dans des tubes avec du milieu de viande cuit (Difco ®) qui juste avant a été soumis à un choc thermique (100ºC pendant 10 minutes immédiatement refroidi dans de l’eau courante), puis ont été incubés à 37ºC pendant 48 heures. Dix microlitres de milieu de viande cuite ont été cultivés dans une gélose de sang de mouton à 5% et incubés à 37ºC pendant 48 heures en conditions anaérobies. Les colonies de forme, d’aspect, de couleur et d’hémolyse caractéristiques ont été soumises à une coloration à Gram pour la détermination morphologique et de la paroi cellulaire. Les isolats suspects ont été soumis à des tests de coagulation de la catalase, de la lécitinase, de la gélatinase, du glucose, du lactose et du lait tumultueux pour identifier le sexe et l’espèce bactérienne.
La technique à base de thyocianate de guanidine (2) a été réalisée pour l’extraction d’ADN à partir de surnageant de tubes avec un milieu de viande cuite. Un mL de chaque tube a été centrifugé à 13000 x g pendant 20 minutes, et le culot a été remis en suspension dans 200 µL de tampon Tris-EDTA avant le protocole d’extraction. La PCR multiplex a été réalisée avec des amorces conçues pour le gène flagelin (fliC), décrites par SASAKI et al. (10), spécifique de Clostridium chauvoei et de Clostridium septicum, qui amplifient respectivement 535 paires de bases (pb) et 294 pb. L’amorce avant FlaF est commune pour les deux espèces et FlachR et FlaseR sont les amorces inverses pour C.chauvoei et C. septicum, respectivement. L’amplification de l’ADN a été réalisée dans un volume total de 50 µL, avec 200 µM de chaque dNTP, 5 µL de tampon réactionnel 10X, 2,5 mm MgCl2, 30 pmoles de chaque amorce (FlaF-5’AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′, FlachR-5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′, et Flase R-5’TTTATTGAATTGTGTTGAAG 3′), 1,25 U Taq polymérase et 10 µL d’ADN. Pour l’amplification, nous avons utilisé trente cycles répartis en trois phases comme suit: dénaturation à 94ºC pendant 60 secondes, hybridation à 56ºC pendant 60 secondes et extension à 72ºC pendant 60 secondes. C. chauvoei IB 1559 et C. septicum 10518 (souches Instituto Biológico) ont été utilisés comme témoins positifs par PCR, et un échantillon musculaire d’une vache normale a été utilisé comme témoin négatif par PCR.
La PCR a également été appliquée directement à partir d’échantillons cliniques (foie, muscle et moelle osseuse) en utilisant les mêmes protocoles d’extraction et d’amplification de l’ADN cités ci-dessus. Des amplifications ont été réalisées dans un Thermocycleur Peltier-100 (MJ Research) et l’analyse des produits amplifiés a été réalisée par électrophorèse dans un gel d’agarose 1,3% coloré au bromure d’éthidium.
La coloration de gramme du milieu de viande cuite inoculée avec les échantillons suspects a montré de petits bâtonnets gram positifs avec des spores subterminales dans la plupart des échantillons (foie 1, muscles 1,2 et 7 et moelle osseuse 3,4 et 5), au-delà des autres. Cependant, seul l’échantillon de muscle 7 a été isolé Clostridium perfringens en culture pure, et aucune croissance n’a été observée dans les autres plaques d’échantillons incubées en conditions anaérobies. La PCR multiplex des échantillons cliniques n’a montré aucun résultat positif ni pour C. chauvoei ni pour C. septicum. Cependant, dans la réaction du surnageant de milieu de viande cuite inoculé avec les mêmes échantillons, sept d’entre eux étaient positifs pour C. chauvoei et négatifs pour C. septicum (foie 1, muscles 1,2 et 7, moelle osseuse 3,4 et 5), comme on le voit dans le tableau 1.
La relation phylogénétique étroite entre C. chauvoei et C. septicum est un reflet moléculaire de la similitude phénotypique de ces organismes. C. chauvoei est relativement difficile à distinguer de C. septicum et, de plus, C. septicum peut provoquer des symptômes très similaires aux symptômes de la jambe noire (6,9).
GREGORY et coll. (3) a signalé l’apparition et le traitement d’un bovin à la jambe noire avec des doses élevées de péniciline. Le diagnostic a été réalisé en isolant C. chauvoei d’un écouvillon de la région de la myonécrose et en inoculant des cobayes pour son identification.
KUHNERT et al. (7) ont signalé un système permettant de distinguer C. chauvoei et C. septicum, cependant, il nécessite une restriction de la digestion enzymatique des produits de PCR pour l’identification définitive de l’organisme en raison de la faible différence dans le gène de l’ARNr 16S des deux bactéries.
Nos résultats montrent que la réaction de PCR multiplex basée sur le gène fliC (10) a été efficace pour identifier C. chauvoei à partir d’échantillons naturellement infectés cultivés dans un milieu de viande cuite produisant du thiocyanate de guanidine pour l’extraction de l’ADN, et différencier cette espèce de C. septicum. Cependant, les résultats de PCR directement à partir d’échantillons de tissus étaient négatifs, probablement en raison du faible nombre de microorganismes clostridiaux ou d’un protocole d’extraction d’ADN inefficace.
L’isolement de C. chauvoei est très difficile, car il nécessite des conditions anaérobies dures, et les échantillons cliniques sont souvent contaminés par d’autres bactéries anaérobies dont les clostridies dans le sol, qui poussent plus vite que C. chauvoei dans un milieu de culture (9). La culture microbiologique du muscle 7 a révélé que Clostridium perfringens était isolé en culture pure dans des conditions anaérobies. Cette espèce peut également être impliquée dans les cas de pattes noires et, dans la présente étude, elle pourrait être associée à C. chauvoei. Quoi qu’il en soit, si seules des méthodes microbiologiques avaient été appliquées dans ce cas, le diagnostic des pattes noires serait erroné ou incomplet. Les vaccins clostridiaux offrent un haut degré d’immunité contre les maladies clostridiales, et lorsque le diagnostic est correct, la maladie peut être facilement contrôlée. Pour cela, les échantillons cliniques doivent être correctement collectés et soumis à un examen de laboratoire. Une fois que toutes les maladies dues aux clostridies peuvent être prévenues par la vaccination, si le problème persiste malgré la vaccination, le diagnostic doit être erroné. De plus, une description de cas est d’une importance fondamentale pour mener une analyse laboratoriale (1).
Les infections dues aux microorganismes de clostridia entraînent des pertes considérables dans la production, une fois que le traitement est généralement impraticable. Le contrôle et la prévention doivent comprendre des mesures adéquates de manipulation et de vaccination systématique du troupeau, car les animaux sont en contact permanent avec les agents et les facteurs qui pourront vaincre les maladies.
La détection d’acide nucléique de C. chauvoei à partir d’un enrichissement préalable d’échantillons naturellement infectés dans un milieu de viande cuite a permis d’élucider le diagnostic dans ces deux foyers brésiliens de jambe noire, qui reste généralement peu concluant en raison de la limitation de la culture microbiologique. En outre, en raison de la spécificité élevée de la technique de PCR, l’emploi de cobayes pour l’identification de l’agent a été évité.
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