- Résumé
- 1. Introduction
- 2. Matériaux et méthodes
- 2.1. Produits chimiques
- 2.2. Préparation d’extraits à l’éthanol à 70% d’Herbes chinoises
- 2.3. Mesure de la production de nitrites
- 2.4. L’analyse de la viabilité cellulaire
- 2.5. Analyse statistique
- 3. Résultats
- 3.1. Effet des extraits d’herbes sur la Production de NO et la Croissance cellulaire
- 3.2. Corrélation entre la Puissance Anti-inflammatoire et les Caractéristiques de la MTC des herbes
- 3.3. Corrélation entre l’effet Protecteur des cellules et les caractéristiques de la MTC des herbes
- 4. Discussion
- Conflit d’intérêts
- Remerciements
Résumé
L’oxyde d’azote synthase inductible (iNOS) est le principal contributeur de la surproduction d’oxyde nitrique et ses inhibiteurs ont été activement recherchés comme agents anti-inflammatoires efficaces. Dans cette étude, nous avons préparé des extraits d’éthanol à 70% à partir de 81 herbes chinoises. Ces extraits ont ensuite été évalués pour leur effet sur la production d’oxyde d’azote (NO) et la croissance cellulaire dans des cellules de macrophage murin RAW264.7 costimulées et non stimulées par LPS/IFN par réaction de Griess et test MTT. Extraits de Daphné genkwa Sieb.et Zucc, Caesalpinia sappan L., Iles pubescens Hook.et Arn, Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl, Zingiber officinale Rosc, Inula japonica Thunb., et Ligusticum chuanxiong Hort a nettement inhibé la production de NO (inhibition > 90% à 100 g/mL). Parmi les extraits actifs (inhibition > 50% à 100 g/mL), Rubia cordifolia L., Glycyrrhiza glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (Willd.) Ohwi et Scutellaria barbata D. Don n’ont montré aucune cytotoxicité pour les cellules RAW246.7 non stimulées tout en augmentant la croissance des cellules costimulées LPS/IFN. En analysant la corrélation entre leurs activités et leurs caractéristiques de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), les herbes à la saveur piquante ont montré une puissante capacité anti-inflammatoire. Notre étude fournit une série d’herbes anti-inflammatoires potentielles et suggère que les herbes à saveur piquante sont des candidats d’agents anti-inflammatoires efficaces.
1. Introduction
L’inflammation est un mécanisme d’autoprotection visant à éliminer les stimuli nocifs, y compris les cellules endommagées, les irritants ou les agents pathogènes, et à commencer le processus de réparation de la plaie. Cependant, l’inflammation induit parfois une inflammation supplémentaire, conduisant à une inflammation chronique auto-perpétuante qui peut causer de graves lésions cellulaires et des lésions tissulaires. L’inflammation chronique a été liée à une grande variété de maladies telles que l’athérosclérose, la maladie d’Alzheimer, le diabète et la carcinogenèse.
L’oxyde nitrique (NO), qui est principalement généré par l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) dans les conditions inflammatoires, joue un rôle clé dans chaque étape des processus pathologiques au cours de l’inflammation. Il a été démontré que les inhibiteurs sélectifs des iNOS sont à la fois anti-inflammatoires et protecteurs des tissus dans divers modèles animaux inflammatoires et sont donc considérés comme des agents prometteurs pour le traitement des maladies inflammatoires. Une expression élevée des iNOS peut souvent être détectée dans les tumeurs humaines, soutenant l’idée que l’inflammation chronique est activement impliquée dans la progression tumorale. En fait, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), y compris l’aspirine et l’acide tolfénamique, sont actuellement utilisés à la fois pour la prévention et le traitement du cancer.
Divers produits naturels ont des effets anti-inflammatoires et anticancéreux dans des modèles animaux expérimentaux. Par exemple, il a été démontré que la curcumine inhibe l’expression de la cyclooxygénase 2 (COX2) et est en fait utilisée en clinique comme agent de chimioprévention. En raison des promesses de la curcumine, des efforts importants ont également été déployés pour identifier des composés capables de cibler les médiateurs inflammatoires. Une étude récente de Liao et al. a étudié l’association potentielle entre la capacité d’antioxydation et les caractéristiques de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dans 45 herbes chinoises couramment utilisées, dans lesquelles la capacité d’antioxydation des herbes chinoises s’est avérée corrélée à leurs caractéristiques gustatives. Leurs résultats sont très encourageants car ils indiquent que des agents anti-inflammatoires efficaces peuvent potentiellement être identifiés à partir d’herbes chinoises en fonction de leurs caractéristiques de MTC.
Dans nos efforts pour identifier des agents anti-inflammatoires efficaces, nous avons préparé des extraits à 70% d’éthanol à partir de 81 herbes chinoises et avons ensuite testé leurs capacités à supprimer la production de NO dans des cellules de macrophages murins RAW264.7 costimulées avec du LPS et de l’IFNy. De plus, nous avons également analysé la corrélation entre la capacité anti-inflammatoire et les caractéristiques de la MTC parmi ces herbes. Nous concluons que les herbes à saveur piquante sont les plus fortes dans leur capacité anti-inflammatoire.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Produits chimiques
IFNy a été acheté à EMD Millpore Chemicals (Billerica, MA, USA). L’albumine sérique bovine (BSA), le lipopolysaccharide (LPS, E. coli 0111: B4), le dichlorhydrate de N-(1-naphtyl)-éthylènediamine (L-NIL), le 3-(4, 5-diméthylthiazol-2-yl)-2, le 5-diphényltétrazolium (MTT), la naphtyléthylènediamine, le sulfanilamide et le bicarbonate de sodium ont tous été obtenus à partir de Sigma-Aldrich Co ( Saint-Louis, MO, États-Unis). Le RPMI 1640 et la trypsine-EDTA ont été achetés auprès de Life Technologies (Grand Island, NY, États-Unis). Le sérum fœtal bovin (FBS) a été acheté auprès de Hyclone Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).
2.2. Préparation d’extraits à l’éthanol à 70% d’Herbes chinoises
Toutes les herbes ont été obtenues auprès de YANG He Tang et Kangqiao Co (Shanghai, Chine). Les 81 herbes choisies pour notre étude ont été rapportées ou suggérées pour avoir des activités anti-inflammatoires potentielles par les littératures de la MTC ou les rapports pharmacologiques actuels. L’identification botanique de ces herbes a été réalisée par l’Institut de contrôle des aliments et des drogues de Shanghai (SIFDC). Pour préparer des extraits d’éthanol, 100 g de chaque herbe séchée ont été tranchés et extraits avec 1 L d’éthanol à 70% en C pendant trois fois. Les extraits d’éthanol obtenus ont été évaporés sous pression réduite à la température C et stockés à C. Les extraits ont été dissous avec du DMSO avant utilisation.
2.3. Mesure de la production de nitrites
RAW264,7 cellules ont été plaquées dans des plaques à 96 puits (5 × 103 cellules par puits) pendant une nuit, puis reconstituées avec du milieu sans FBS pendant 10 h, suivi de l’ajout de 100 µg / mL d’extraits d’herbes dans chaque puits. Les cellules ont été costimulées avec 100 ng / mL de LPS et 10 U / mL d’IFNy pendant 24 h, et les milieux ont ensuite été collectés et analysés pour la quantité de nitrite, un métabolite oxydant stable et un indicateur de NO fidèle, par la réaction de Griess comme décrit précédemment. Pour ce faire, 100 µL de réactif Griess (0,1% de naphtyl-éthylènediamine et 1% de sulfanilamide dans 5% d’acide phosphorique) ont été mélangés à 100 µL de milieu collecté dans une plaque à 96 puits. Le mélange a été incubé pendant 10 min à température ambiante puis lu à 540 nm. La quantité de nitrite a été calculée sur la base d’une courbe standard générée avec du nitrite de sodium. Le pourcentage d’inhibition dans la production de NO a été calculé avec la formule {/ (nitrite sans extrait d’herbe)} × 100.
2.4. L’analyse de la viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire a été déterminée par le test MTT tel que décrit précédemment. Brièvement, des cellules RAW264.7 ont été incubées avec du MTT (5 mg / mL dans une solution saline tamponnée au phosphate, pH = 7,4) pendant 4 h. Le formazan formé de MTT a été solubilisé avec 50 µL de tampon HCl 0,01 M contenant 10% de SDS et 5% d’isobutanol. La croissance cellulaire a été déterminée par lecture de plaques à 570 nm dans un lecteur de microplaques. La viabilité cellulaire du groupe témoin est considérée comme 100%.
2.5. Analyse statistique
La direction et l’ampleur de la corrélation entre les variables ont été effectuées à l’aide de l’analyse du test t. les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives ().
3. Résultats
3.1. Effet des extraits d’herbes sur la Production de NO et la Croissance cellulaire
À l’aide du test Griess, nous avons analysé des extraits d’éthanol de 81 herbes pour leur activité anti-inflammatoire. Une large gamme d’inhibition de la production de NO a été observée avec ces extraits (tableau 1). Des extraits de 7 herbes bloquaient plus de 90% d’absence de production dans le RAW264 stimulé par le LPS/IFNy.7 cellules (tableau 1). Parmi les extraits qui ont suscité plus de 50% d’inhibition dans la production de NO, Rubia cordifolia L., Glycyrrhiza glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (Willd.) Ohwi et Scutellaria barbata D. Don n’ont montré aucune cytotoxicité pour les cellules RAW264.7 non stimulées, tout en augmentant significativement la viabilité des cellules stimulées par le LPS/IFNy (tableau 1). Cependant, Daphné genkwa Sieb.et Le Zucc, qui a l’effet inhibiteur le plus fort sur la production de NO, était modérément toxique pour les cellules RAW264.7 (tableau 1).
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| HR: herb; RT: racine; ST: tige; LF: feuille; TW: brindille; FL: fleur; FR: fruit; SD: graine; SC: sclérote; HW: bois de cœur; SR: tige et racine; PE: péricarpe. Bp Inhibition de la production de NO: La réaction de Griess a été réalisée pour mesurer la production de nitrite dans des cellules RAW264.7 stimulées par le LPS/IFNy en l’absence ou en présence de 100 g/mL d’extraits d’herbes. Croissance cCell : Le MTT a été réalisé pour mesurer la croissance cellulaire. Le taux de croissance du contrôle (aucun traitement à l’extrait d’herbe) a été considéré comme étant de 100%. Production de dNO : La réaction de Griess a été utilisée pour mesurer la quantité de nitrite dans le RAW264 non stimulé.7 cellules en l’absence et en présence de 100 g / mL d’extraits d’herbes. cytotoxicité eCell: Un test MTT a été effectué pour déterminer la cytotoxicité cellulaire de cellules RAW264.7 non stimulées traitées avec des extraits d’herbes. Le groupe non traité a été considéré comme 100%. Rendement en pourcentage de l’extrait obtenu à partir de l’extraction à l’éthanol à 70% de chaque herbe sèche de 100 g. Inhibition en gPercent de l’activité iNOS à la concentration d’essai de 50 M. |
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3.2. Corrélation entre la Puissance Anti-inflammatoire et les Caractéristiques de la MTC des herbes
En analysant les caractéristiques de la MTC de 10 herbes qui présentent l’effet inhibiteur le plus fort sur la production de NO dans les cellules BRUTES stimulées par le LPS / IFNy 264,7, nous avons constaté que la plupart d’entre elles appartiennent aux catégories saveur amère ou piquante, nature chaude et distributions méridiennes du poumon ou du foie (tableau 2). Pour corréler les caractéristiques de la MTC à l’effet anti-inflammatoire de ces herbes, nous avons classé les caractéristiques de la MTC de ces herbes capables d’abolir 50% de la production de NO dans les cellules RAW264.7 stimulées par le LPS / IFNy. Le tableau 3 a montré que les herbes ayant un effet anti-inflammatoire plus important étaient distribuées dans un pourcentage significativement plus élevé chez celles caractérisées par des saveurs amères / piquantes, une nature chaude et des distributions méridiennes foie / poumon. Ces résultats suggèrent que les herbes anti-inflammatoires peuvent posséder des caractéristiques communes de saveur piquante / amère, de nature chaude et de méridien pulmonaire / hépatique.
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| Basé sur la Pharmacopée chinoise (2010). Basé sur la matière médicale chinoise (1998). |
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3.3. Corrélation entre l’effet Protecteur des cellules et les caractéristiques de la MTC des herbes
L’inflammation chronique conduit souvent à des dommages cellulaires et, par conséquent, des agents capables de dissuader ce processus sont activement recherchés. En examinant 21 herbes avec la MTC caractéristique de saveur piquante, nous avons observé que, sous la costimulation du LPS et de l’IFNy, RAW264.7 cellules traitées avec ces extraits d’herbes ont montré une augmentation de 90% de la viabilité cellulaire (tableau 4). De plus, les herbes à saveur piquante ont également conféré le plus haut degré de protection cellulaire dans les cellules stimulées par le LPS / IFNy par rapport aux herbes avec d’autres saveurs (Figure 1).
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| Herbes avec plus de 90% de capacité de protection cellulaire dans les cellules RAW264.7 stimulées. Bherbes ayant la capacité d’augmenter la prolifération cellulaire de plus de 90% dans les cellules RAW264.7 au repos. |
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Comparaison des herbes avec la viabilité cellulaire dans différentes saveurs. Moyenne de viabilité cellulaire des cellules RAW264.7 stimulées par LPS / IFNy traitées avec des herbes appartenant à des saveurs différentes. .
4. Discussion
La surproduction de NO due à l’expression élevée d’iNOS a été liée de manière convaincante à la pathogenèse de l’inflammation chronique et du cancer. Par conséquent, les agents capables de supprimer sélectivement la production de NO générée par l’iNOS devraient être efficaces pour traiter l’inflammation chronique et prévenir le cancer. En fait, des études récentes démontrent que les inhibiteurs sélectifs de l’iNOS L-NIL et 1400 W sont thérapeutiquement efficaces en tant que médicaments anti-inflammatoires et anticancéreux.
Les macrophages jouent un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation. Les macrophages sont activés par des stimuli externes et les macrophages activés produisent divers médiateurs inflammatoires tels que les espèces d’oxygène NON réactives et réactives. Les herbes chinoises sont les riches sources d’agents anti-inflammatoires et des efforts ont été déployés pour identifier des composants efficaces dans ces herbes. Tirant parti du modèle cellulaire RAW264.7 bien établi, nous avons évalué 81 extraits d’herbes pour leur effet inhibiteur sur la production de NO induite par le LPS / IFNy. Parmi eux, l’extrait de Daphné genkwa Sieb.et Zucc a montré l’effet inhibiteur le plus fort sur la production de NO. Les constituants isolés de Daphné genkwa Sieb.et Il a été précédemment rapporté que Zucc provoquait un effet cytotoxique sur diverses lignées cellulaires tumorales et supprimait l’excroissance du sarcome de souris transplanté S180 chez les souris. Nous spéculons que l’effet anticancéreux de Daphné genkwa Sieb.et Zucc peut être fonctionnellement associé à sa capacité anti-inflammatoire. Dans notre étude, nous avons constaté que Rubia cordifolia L. et plusieurs autres diminuent la production de NO induite par le LPS / IFNy sans provoquer de cytotoxicité significative pour les cellules RAW264.7. Ces herbes peuvent donc être des candidats prometteurs comme médicaments efficaces pour contrôler l’inflammation et le cancer. Bien qu’il ne soit pas clair actuellement comment ces extraits bloquent la production de NO induite par le LPS / IFN dans les cellules RAW264.7, la découverte que la Mollugin supprime la réponse inflammatoire en bloquant les transducteurs de signal de Janus kinase et les activateurs de la voie de signalisation de transcription implique que les herbes peuvent cibler les différentes étapes de la cascade de signalisation médiant la production de NO induite par le LPS / IFN pour exercer leurs rôles anti-inflammatoires.
Sur la base de la théorie de la MTC, nous avons classé ces 81 herbes selon des saveurs distinctes (piquantes, douces, acides, amères, astringentes, salées ou douces), des natures (froides, fraîches, modérées, chaudes ou chaudes) et des distributions méridiennes (foie, rein, cœur, rate, etc.). Notre étude a montré que la caractéristique TCM de la saveur était très bien corrélée avec la puissance d’inhiber l’ABSENCE de production — la saveur piquante est la plus forte, l’amertume est légèrement plus faible que la saveur piquante, les saveurs sucrées sont intermédiaires et la saveur astringente, salée, douce ou aigre est faible ou pas efficace. Les caractéristiques de la MTC de la nature et de la distribution méridienne sont également associées à la puissance d’inhiber la production de NO. Par exemple, un pourcentage plus élevé d’herbes capables de bloquer AUCUNE production a les caractéristiques de la nature chaude. Les caractéristiques des méridiens du foie et des poumons sont les principales distributions méridiennes trouvées dans les herbes dont les extraits peuvent bloquer 50% de la production de NO. Ensemble, nous pensons que les caractéristiques de la MTC peuvent potentiellement être très utiles pour guider la recherche d’agents anti-inflammatoires efficaces dans les herbes chinoises.
La caractéristique de la MTC est une expression systématique de la propriété distincte provoquée par Materia Medica chez l’homme. La théorie des arômes dans la MTC constitue le contexte central des conseils d’utilisation des herbes chinoises. Dans la MTC, la caractéristique de la saveur est la combinaison du goût réel et de l’effet curatif. Selon Shen Nong Ben Cao Jing (Classique de la médecine matérielle de Shennong), un important livre de MTC d’abord écrit sur la théorie des propriétés et des arômes à base de plantes chinoises, la saveur piquante, qui est liée au méridien pulmonaire, peut disperser la chaleur interne avec des sudorifiques qui favorisent à leur tour la circulation du Qi et du sang. Les herbes à la saveur piquante sont en fait utilisées depuis des milliers d’années en Chine pour revigorer la circulation du sang et briser le bloc de Qi. Le fait que les maladies liées à l’inflammation soient associées au symptôme de Qi et au blocage du sang peut expliquer l’efficacité des herbes à saveur piquante pour supprimer l’inflammation.
Notre étude s’est limitée à l’étude de 81 extraits d’herbes sur leur effet sur la production de NO induite par le LPS / IFNy et la croissance cellulaire dans les cellules RAW264.7 des macrophages. Les résultats de cette étude soutiennent néanmoins une association étroite entre la pharmacologie / science biomédicale moderne et la théorie de la MTC. La théorie de la MTC a été développée sur la base de milliers d’années d’expérience clinique, et la base matérielle et pharmacologique de la MTC reste à expliquer par la science biomédicale moderne. Nous pensons que cette étude a contribué à cet objectif.
Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Grand Projet National de Science et de Technologie du Ministère des Sciences et de la Technologie de Chine (2009ZX09311-003), le Fonds pour les Jeunes Scientifiques de la Fondation Nationale des Sciences Naturelles de Chine (81001666), Le Programme d’Innovation de la Commission Municipale de l’Éducation de Shanghai (13YZ048) et la Commission de l’Éducation de la Fondation de Shanghai pour les Jeunes Enseignants exceptionnels à l’Université ( SZY07029).