Una visión general de la Quimogenética

Debido a los avances significativos en las técnicas de neurociencia, los investigadores ahora pueden explotar selectivamente los sistemas neuronales en animales conscientes, a través de métodos emergentes llamados quimogenética y optogenética. Estos métodos ayudan a explorar los circuitos neuronales subyacentes a los comportamientos intrincados en la enfermedad y la salud.

La quimogenética y la optogenética muestran similitudes en su enfoque de modificación de la actividad neuronal; por ejemplo, en ambas técnicas, los canales iónicos o los receptores diseñados deben introducirse en regiones cerebrales particulares, a través de sistemas de expresión de plásmidos o vectores virales. En optogenética, los canales iónicos bacterianos sensibles a la luz deben expresarse y la fibra óptica también debe utilizarse posteriormente para inhibir o activar la actividad neuronal in vivo o in vitro (Boyden et al., 2005; Zhang et al., 2007).

Aunque este método ofrece un control temporal superior de la actividad neuronal in vivo, se sabe que es inherentemente invasivo y necesita implantación cerebral de fibra óptica. La quimogenética, por otro lado, no necesita un implante crónico, pero mantiene el potencial de controlar la actividad neuronal. Esto se logra mediante la administración de ligandos, selectivos para canales iónicos o receptores diseñados, que de otro modo son inertes (Armbruster et al., 2007; Campbell & Marchant, 2018). La Tabla 1 muestra las principales características de la quimogenética y la optogenética.

Cuadro 1. Quimogenética vs optogenética

Historia y Desarrollo

RASSLs

La quimogenética se refiere al uso de canales iónicos o receptores modificados genéticamente y los ligandos selectivos que activan esos receptores para facilitar la manipulación de la actividad neuronal. En este contexto, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) han estado liderando el desarrollo de la quimogenética, y el artículo original que define GPCR que reaccionan solo a ligandos sintéticos se publicó en 1998.

Estos receptores, conocidos como Receptores Activados Únicamente por un Ligando Sintético (RASSL), se aplicaron efectivamente in vivo, por ejemplo, para controlar de forma remota la actividad cardíaca. A pesar de este hecho, la aplicación de RASSL en neurociencia se ha visto limitada por la actividad endógena de los receptores en ausencia de su ligando particular y la actividad farmacológica de los ligandos in vivo (Coward et al., 1998; Sternson & Roth, 2014).

DREADDs

Los últimos años han visto el desarrollo de Receptores de Diseño Activados Exclusivamente por Drogas de Diseño (DREADDS). Los receptores muscarínicos humanos mutados estimulados solo por ligandos inertes fueron los primeros DREADDS en desarrollarse (Armbruster et al., 2007). A través de varias rondas de mutagénesis y detección contra el ligando biológicamente inerte N-óxido de Clozapina (CNO), se identificaron receptores muscarínicos acoplados a la vía de señalización intracelular de Gaq.

Los receptores acoplados a esta vía son capaces de activar la actividad neuronal en respuesta al CNO. Las bajas concentraciones de CNO activan los tres acorazados Gaq-hM1Dq, hM3Dq y hM5Dq (Roth, 2016). Además, el mismo estudio reveló que hM4Di y hM2Di pueden inhibir la actividad neuronal a través de su acoplamiento a las vías de señalización intracelular de Gai. Estos DREADD inhibitorios también responden al CNO (Armbruster et al., 2007; gráfico 1).

Figura 1. Mecanismo de acción de los ligandos DREADD. La unión de ligandos DREADD a Gaq-DREADD provoca la activación neuronal, mientras que la unión a Gai-DREADD resulta en la inhibición de la actividad neuronal. El dihidrocloruro de N-óxido de clozapina y el agonista DREADD 21 son agonistas muscarínicos DREADD no selectivos y, por lo tanto, pueden activar o inhibir la actividad neuronal, dependiendo del receptor específico que se exprese. La salvinorina B es selectiva para el receptor de KORD, que está acoplado a la señalización de GaI, por lo tanto, la unión resulta en la inhibición de la actividad neuronal. Crédito de la imagen: Tocris Bioscience

La unión entre Gaq-DREADDs y CNO causa la estimulación de la fosfolipasa C (PLC), que cataliza la conversión de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) a 1,2-diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). Tanto el DAG como el IP3 poseen funciones de segundo mensajero: este último se une a sus receptores para desencadenar la liberación de Ca2+ de los almacenes intracelulares, mientras que el primero estimula varias formas de proteína quinasa C (PKC).

La unión entre Gai-DREADDs y CNO causa la inhibición de la adenilil ciclasa (AC), lo que resulta en una disminución de los niveles intracelulares de cAMP. Dado que tanto el EPAC como la proteína quinasa A (PKA) son activados por el cAMP, la acción del CNO en los Gai-DREADDs inhibe la señalización de EPAC y PKA aguas abajo (ver Figura 1).

El CNO es un metabolito de la clozapina, los estudios indican que se trata de una conversión bidireccional y que el CNO puede experimentar un metabolismo inverso a la clozapina. Cuando se administra CNO a las concentraciones necesarias para activar DREADDs, la clozapina es posteriormente capaz de activar receptores endógenos (Gomez et al., 2017). La clozapina, un antipsicótico atípico, actúa en una variedad de objetivos y produce muchos efectos conductuales diferentes.

Ratas, ratones, humanos, primates no humanos y cobayas muestran el metabolismo reversible de CNO a clozapina (Gómez et al., 2017; Manvich et al., 2018). Como resultado del potencial metabolismo inverso del CNO, los estudios de relación estructura-actividad han evolucionado para desarrollar ligandos estables y alternativos.

El potente ligando DREADD — agonista DREADD 21 — se analizó inicialmente para detectar actividad frente a hM3Dq. El fármaco aprobado perlapina fue identificado como un potente agonista hM3Dq en la misma investigación. En Japón, este medicamento ha sido aprobado como sedante e hipnótico (Chen et al., 2015). Tanto la perlapina como el agonista DREADD 21 han demostrado ser agonistas potentes de hM4Di, hM3Dq y hM1Dq con poca o ninguna actividad fuera del objetivo. Además, se ha probado in vivo el agonista DREADD 21, en el que se ha demostrado que activa las neuronas que expresan hM3Dq e inhibe la actividad de las neuronas que expresan hM4Di (Thompson et al., 2018).

Tras el desarrollo de DREADD muscarínicos, se ha creado un DREADD inhibitorio a partir del receptor de opioides κ (KORD). La activación de este DREADD inhibitorio se logra a través de la unión del ligando Salvinorina B, lo que resulta en la inhibición de la actividad neuronal a través de la señalización de Gai. Para permitir el control bidireccional de la actividad neuronal, KORD se puede utilizar junto, activando DREADDs como hM3Dq(Vardy et al., 2015).

Algunas características comunes en todos los DREADD los hacen adecuados para su aplicación en experimentos de neurociencia. En primer lugar, los DREADD no muestran ninguna respuesta a los ligandos endógenos debido a mutaciones genéticas dentro de sus sitios de unión de ligandos que eliminan la unión, lo que implica que cualquier actividad del DREADD será solo debido a las aplicaciones del ligando DREADD específico. En segundo lugar, la expresión in vitro o in vivo de DREADDs no tiene ningún impacto en los comportamientos de referencia, la función neuronal o la actividad celular, antes de la adición del ligando DREADD (Sternson & Roth, 2014).

PSAMs / PSEMs

Mientras que los DREADD y los RASSL se basan en GPCR, los canales iónicos modificados llamados Módulos Actuadores Farmacológicamente Selectivos (PSAMs) también se han utilizado para modular la actividad de las neuronas. Los PSAM se basan en estudios que indican que es posible trasplantar el dominio extracelular de unión a ligandos del receptor ACH nicotínico α7 (nAChR) al dominio de poros iónicos de otros canales iónicos dependientes de ligandos. Cuando el dominio de unión al ligando α7 nAChR se empalma con el dominio de poros iónicos del receptor 5-HT3, se produce un canal iónico con farmacología α7 nAChR, pero con propiedades de conducción catiónica de 5-HT3 (Eiselé et al., 1993).

Asimismo, el empalme del dominio de unión al ligando α7 nAChR con el dominio de poros iónicos del receptor de glicina selectiva de cloruro (GlyR) produce un canal de cloruro que responde a ACh (Grutter et al., 2005). La mutación selectiva del dominio de unión al ligando α7 nAChR genera, en consecuencia, canales iónicos PSAM, que no muestran ninguna unión ACh, pero que aún están unidos selectivamente por compuestos llamados Moléculas Efectoras Farmacológicamente Selectivas (PSEM).

PSAMs o canales iónicos quiméricos que permiten la regulación de la conductancia de aniones o cationes se han producido a través de la combinación del dominio de unión de ligandos α7 nAChR mutado (albergando dos o una mutaciones) con el dominio de poros iónicos de varios canales iónicos dependientes de ligandos variados. Estas quimeras PSAM se nombran en función de sus mutaciones,así como del dominio de poros de iones enlazados: PSAML141F, Y115F — GlyR, PSAML141F-GlyR,PSAML141F, Y115F-GABAC,y PSAML141F, Y115F-5-HT3. La activación de la actividad neuronal está habilitada por quimeras que contienen 5-HT3, mientras que las quimeras que contienen GABAC y GlyR son inhibitorias (ver Figura 2) (Magnus et al., 2011; Sternson & Roth, 2014).

Figura 2. Mecanismo de acción de los PSEM. Los PSAM activadores se componen de un dominio de unión de ligandos α7 nAChR mutado empalmado con el dominio de poros iónicos de un canal selectivo de cationes, como el 5-HT3. La unión de PSEM a PSAM activadores da como resultado una afluencia de cationes y la activación de la actividad neuronal. Los PSAM inhibitorios están compuestos de un dominio de unión de ligandos α7 nAChR mutado empalmado con el dominio poroso iónico de un canal selectivo de aniones, como el GlyR. La unión de PSEM a PSAMs inhibitorios resulta en una afluencia de aniones e inhibición de la actividad neuronal. Crédito de la imagen: Tocris Bioscience

Revisiones científicas para lectura adicional

• Campbell & Marchant (2018) El uso de la quimogenética en neurociencia conductual: variantes de receptores, enfoques de orientación y advertencias. Br J Pharmacol. 175, 994.
• Roth (2016) DREADDs para neurocientíficos. Neurona. 89, 683.
• Magnus et al. (2011) Chemical and genetic engineering of selective ligand-ion channel interactions. Ciencia. 333, 1292.
• Sternson & Roth (2014) Herramientas quimiogenéticas para interrogar las funciones cerebrales. Annu Rev Neurol. 37, 387.

1. Armbruster et al. (2007) La evolución de la cerradura para que se ajuste a la llave para crear una familia de receptores acoplados a la proteína G activados potentemente por un ligando inerte. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5163.
2. Atasoy et al. (2012) Deconstrucción de un circuito neural para el hambre. Naturaleza. 488, 172.
3. Boyden et al. (2005) Milisegundos-escala de tiempo, control óptico genéticamente dirigido de la actividad neuronal. Neurociencia Nat. 8, 1263.
4. Bradley & Tobin (2016) Design of next-generation G protein-coupled receptor drugs: linking novel pharmacology and in vivo animal models. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 56, 535.
5. Bradley et al. (2018) El uso de enfoques quimogenéticos para estudiar las funciones fisiológicas de los receptores de acetilcolina muscarínicos en el sistema nervioso central. Neurofarmacología. 136, 421.
6. Chen et al. (2015) Los primeros estudios de relación estructura-actividad para receptores de diseño activados exclusivamente por drogas de diseño. Neurociencia Química ACS. 6, 476.
7. Coward et al. (1998) Control de la señalización con un receptor Gi acoplado específicamente diseñado. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 352.
8. Eiselé et al. (1993) El receptor quimérico nicotínico-serotoninérgico combina la unión de ligandos y las especificidades de los canales. Naturaleza. 366, 479.
9. Ge et al. (2017) Proyecciones glutamatérgicas de la corteza entorrinal al giro dentado dorsal restablecimiento inducido por el contexto de la búsqueda de heroína. Neuropsicofarmacología. 42, 1860.
10. Gomez et al. (2017) Chemogenetics revealed: Ocupación y activación de DREADD a través de clozapina convertida. Ciencia. 357, 503.
11. Grutter et al. (2005) Molecular tuning of fast gating in pentameric ligand-gated ion channels. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 18207.
12. Jiang et al. (2018) Las neuronas colinérgicas en el tabique medial mantienen comportamientos similares a la ansiedad inducidos por el dolor inflamatorio crónico. Neurosci Lett. 671, 7.
13. Manvich et al. (2018) El agonista DREADD N-óxido de clozapina (CNO) se metaboliza de forma inversa a clozapina y produce efectos de estímulo interoceptivo similares a la clozapina en ratas y ratones. Sci Rep. 8, 3840.
14. Rapanelli et al. (2017) Modulación de histamina de los circuitos de los ganglios basales en el desarrollo de la preparación patológica. Proc Natl Acad Sci USA. 114, 6599.
15. Sasaki et al. (2011) La modulación farmacogenética de las neuronas de orexina altera los estados de sueño/vigilia en ratones. PLoS Uno. 6, e20360.
16. Schwartz et al. (2017) La regulación Cortico-accumbens del comportamiento de evitación del enfoque se modifica por la experiencia y el dolor crónico. Celular República 19 De 1522.
17. Thompson et al. (2018) El agonista DREADD 21 (C21) es un agonista eficaz para los DREADD con base muscarínica in vitro e in vivo. ACS Pharmacol Transl Sci. Epub antes de imprimir.
18. Vardy et al. (2016) Un nuevo DREADD facilita la interrogación quimiogenética multiplex del comportamiento. Neurona. 86, 936.
19. Varela et al. (2016) Tracking the time-dependent role of the hippocampus in memory recall using DREADDs. PLoS Uno. 11, e0154374.
20. Zhang et al. (2007) Interrogación óptica rápida multimodal de circuitos neuronales. Naturaleza. 446, 633.

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