Un Panel de Citometría de Flujo de 10 Colores para el Diagnóstico y la Medición Mínima de la Enfermedad Residual en Leucemia Linfocítica Crónica

Antecedentes: La leucemia linfocítica crónica (LLC) tiene un inmunofenotipo clásico, que consiste en restricción de cadenas ligeras, CD5+, CD19+, dim CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10 – y CD79b-. Esto lo distingue de las células B normales y otros trastornos linfoproliferativos (DPL). Los anticuerpos dirigidos a estos antígenos se incluyen en dos paneles de citometría de flujo de 8 colores desarrollados por el consorcio Euroflow para el trabajo de las DPL de células B. La combinación de estos anticuerpos en un panel de 10 colores sería más rentable. Además, las nuevas terapias de LLC pueden inducir remisiones profundas, creando una demanda creciente de medir la enfermedad residual mínima (ERM), definida como tener más de 1 célula leucémica residual por cada 10.000 leucocitos (10-4). El actual enfoque normalizado internacional para medir la ERM establecido por la Iniciativa Europea de Investigación sobre LLC (ERIC) utiliza un panel de anticuerpos dirigidos a CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b y CD81. Sin embargo, estas combinaciones de anticuerpos y fluorocromos son diferentes de las utilizadas por los paneles de diagnóstico de Euroflow. Por lo tanto, los laboratorios que consideren la implementación de pruebas de ERM tendrían que comprar anticuerpos para 3 paneles diferentes (2 de diagnóstico y 1 ERM). Ampliamos el tubo de detección de linfocitos de 8 colores Euroflow para incluir CD200 y CD23, de modo que la LLC se pueda detectar en un tubo de 10 colores, a niveles tan bajos como 0,01%. El objetivo de este estudio fue determinar el ahorro potencial de costos en la implementación de este nuevo panel y determinar si es lo suficientemente sensible como para detectar la ERM.Métodos

: Calculamos el número de muestras analizadas con nuestro tubo LST modificado de 10 colores (mLST1, obtenido liofilizado) de abril de 2018 a marzo de 2019 para descartar un DPL y el número de alícuotas de anticuerpos guardadas con este enfoque en comparación con el método Euroflow estándar de 2 tubos. También creamos una versión del panel mencionado anteriormente (mLST2) utilizando anticuerpos líquidos para aumentar la generalización de nuestros resultados, sustituyendo CD38 por CD43 para ver si esto mejoraba la detección de ERM (ver paneles a continuación). Para las pruebas de ERM, utilizamos muestras de LLC de 24 pacientes diferentes para producir 60 muestras de ERM a diversas concentraciones de células leucémicas. Las muestras se prepararon mediante la adición de células de LLC en suspensiones de leucocitos normales a concentraciones aproximadas de 0,1%, 0,01% y 0,001%. Cada muestra fue alícuota y teñida con los tres paneles: ERIC, mLST1 y mLST2. Los datos se obtuvieron con un BD FACSCanto II o un BD FACSAria Fusion y se analizaron con el software BD FACSDiva. Las células de LLC se identificaron en base a la expresión diferencial de marcadores clave y la ERM se calculó como el número de células de LLC/leucocitos totales. La positividad de la ERM se definió como ≥ 0,01%. La concordancia entre los paneles se evaluó utilizando el método de parcelas Bland-Altman. También calculamos la concordancia porcentual entre los paneles para identificar la positividad de la ERM.

Resultados: En 1 año, se realizó mLST1 en 474 muestras, de las cuales 220 tenían un DLP y 123 (56%) tenían un fenotipo clásico de LLC, obviando la necesidad de pruebas adicionales. Esto resultó en el ahorro neto de 476 alícuotas de anticuerpos. Para la evaluación de la ERM, la expresión diferencial de CD5 y CD20 fueron los contribuyentes más significativos para distinguir la LLC de las células B normales utilizando el mLST1 y el mLST2. Identificamos un caso de LLC con un inmunofenotipo atípico (CD5 oscuro, CD20 brillante) que resultó difícil de eliminar utilizando un panel de mLST. Hubo acuerdo en los resultados de la ERM obtenidos con los paneles del mLST y el panel ERIC. Para los valores por encima del límite de cuantificación, el límite de concordancia del 95% fue de ±0,3369 logaritmos para la comparación ERIC vs mLST1 y de ±0,3485 logaritmos para la comparación ERIC vs mLST2. Por lo tanto, la variabilidad en los niveles de ERM entre los paneles fue inferior a 2 veces la mayoría de las veces, lo que consideramos clínicamente aceptable ya que la ERM se mide en una escala exponencial. El panel ERIC y el mLST1 coincidieron en un 88,3% en distinguir las muestras con ERM positiva frente a las muestras con ERM negativa. El acuerdo entre el panel ERIC y el mLST2 fue del 93,3%.

Conclusiones: El uso de un panel de LST modificado de 10 colores para el diagnóstico y la medición de la ERM de la LLC es factible. Las ventajas son una mayor familiaridad con los anticuerpos y un posible ahorro de costos, lo que hace que la ERM sea accesible a más laboratorios de citometría. Los casos atípicos de LLC sin la positividad habitual de CD5 y CD20 tenues son muy difíciles de eliminar utilizando un panel de LST. En estos casos, el panel ERIC es claramente superior, ya que los linfocitos CD22, CD79b, CD81 y CD43 aún pueden proporcionar separación entre los linfocitos malignos y normales.

Divulgaciones

Bazinet: BD Biosciences: Otros: Proporcionó una cantidad significativa de anticuerpos utilizados en este proyecto de forma gratuita.. Wever: Innovación de Teva Canadá: Empleo. Gimmig: BD Biosciences: Empleo. Johnson: Lundbeck: Empleo, Honorarios, Membresía en el Consejo de Administración o comités asesores de una entidad, Otros: Gastos de viaje, regalos y otros, Financiación de Investigación; Merck: Consultoría, Honorarios; Roche: Consultoría, Empleo, Honorarios, Membresía en el Consejo de Administración o comités asesores de una entidad, Otros: Gastos de viaje, regalos y otros, Financiación de Investigación; Abbvie: Consultoría, Empleo, Honorarios, Membresía en el Consejo de Administración o comités asesores de una entidad, Financiación de Investigación; BD Biosciences: Otros: Proporcionó una proporción significativa de los anticuerpos utilizados en este proyecto de forma gratuita.; BMS: Consultoría, Honorarios; Seattle Genetics: Honorarios.

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