Tinción Inmunohistoquímica de Neoplasias Uroteliales CK20 y CK5/6: Una perspectiva

Resumen

Las citoqueratinas pertenecen a la familia de los filamentos intermedios. Se expresan de una manera muy específica en las células epiteliales, donde desempeñan un papel crucial en la integridad y estabilidad mecánica de las células. Se han descrito varios tipos de citoqueratinas en urotelio normal y neoplásico. En el caso de las neoplasias uroteliales, en varios estudios se ha demostrado que la expresión de CK20 y CK5/6 tiene implicaciones diagnósticas y pronósticas. Por lo tanto, el carcinoma urotelial de grado bajo manifiesta una expresión de CK limitada a las células paraguas, mientras que los tumores de grado alto generalmente tienen una expresión en todo el grosor del urotelio, excepto en la capa basal. Por otro lado, la expresión de CK5/6 se expresa en las células basales de todos los carcinomas uroteliales de grado bajo y algunos de grado alto. La tinción difusa de CK20 acompañada de pérdida de la capa basal positiva a CK5/6 generalmente se asocia con un comportamiento clínico agresivo. La doble tinción de los portaobjetos para estas citoqueratinas puede facilitar una interpretación y correlación adecuadas.

1. Introducción

Las citoqueratinas pertenecen a la familia del citoesqueleto de filamentos intermedios de 10 nm presente en todas las células. Las proteínas de filamentos intermedios se expresan de una manera altamente específica para el tipo de célula, y en este caso las queratinas representan la categoría típica de filamentos intermedios presente en las células epiteliales. Estos filamentos son un grupo complejo de polipéptidos insolubles en agua, que varían en tamaño de 40,000 a 68,000 Mr. En los epitelios, los filamentos de queratina pueden agruparse como tonofilamentos, trenzar el núcleo, atravesar el citoplasma y unirse a las placas citoplasmáticas de las uniones epiteliales típicas entre células, los desmosomas. Por lo tanto, las queratinas desempeñan un papel funcional importante en la integridad y estabilidad mecánica de las células epiteliales individuales y de los tejidos epiteliales, y son una parte inherente del continuo de estabilidad desde la célula individual hasta la formación del tejido .

Las proteínas de queratina se pueden dividir en queratinas pequeñas ácidas de tipo I y queratinas grandes de tipo básico a neutro de tipo II. Una propiedad única de las queratinas es que, a diferencia de las otras proteínas de filamentos intermedios, solo pueden constituir su etapa filamentosa mediante la formación de pares de moléculas de tipo I y tipo II (1 : 1). Entre las queratinas humanas, la nomenclatura de consenso reciente comprende las queratinas de tipo I K9-K10, K12-K28 y K31-K40 y las queratinas de tipo II K1-K8 y K71-K86. En el genoma humano, los genes de queratina se agrupan en dos sitios cromosómicos diferentes: el cromosoma 17q21.2 (queratinas de tipo I, excepto K18) y el cromosoma 12q13.13 (queratinas de tipo II y K18). Se cree que las dos subfamilias de citoqueratina surgieron a través de la duplicación de genes y la subsiguiente divergencia de CK8 y CK18 .

Cada tipo de célula epitelial expresa una combinación característica de dos a diez isotipos de citoqueratina. Por lo tanto, se pueden identificar células epiteliales normales in vivo o in vitro con respecto a su perfil isotípico de citoqueratina. Los perfiles característicos de citoqueratina de los diferentes tipos de células epiteliales normales tienden a conservarse después de la transformación neoplásica y esta característica puede aprovecharse en el diagnóstico tumoral. Sin embargo, los perfiles de citoqueratina de las células epiteliales también pueden reflejar diferenciación funcional, en lugar de tejido de origen. Por lo tanto, las células metaplásicas expresan características de perfil de citoqueratina de su morfología en lugar de la de su contraparte normal .

2. Expresión de citoqueratina en Urotelio durante el Desarrollo embriológico

Las citoqueratinas son el primer tipo de filamento intermedio que aparece durante la embriogénesis, y todas las células en alguna etapa del desarrollo fetal son citoqueratinas positivas. Los primeros isotipos de citoqueratina que se expresan son el par CK8 + CK18. Durante la transformación embrionaria epitelial-mesenquimal, la expresión de citoqueratina se pierde por ciertos linajes de células, que o bien permanecen como citoqueratinas negativas y se desarrollan en tejido conectivo o más tarde vuelven a expresar citoqueratinas de epitelios secundarios . El desarrollo embriológico de la vejiga urinaria proviene de la cloaca, una estructura del intestino posterior, que es una cámara común para los desechos gastrointestinales y urinarios. En las semanas 4 a 7 de desarrollo, la cloaca se divide por el tabique urorrectal en dos partes: canal anorrectal posterior y seno urogenital anterior. La parte superior del seno urogenital forma la vejiga urinaria .

Durante el desarrollo temprano de la vejiga, el epitelio del revestimiento se transforma gradualmente de epitelio endodérmico simple a revestimiento urotelial multicapa. Como patrón del revestimiento endodérmico en el tracto gastrointestinal, el revestimiento urotelial en desarrollo es inicialmente difusamente positivo para CK20 en todas las capas. Durante la maduración posterior del urotelio, se desarrolla una capa basal que puede ser demostrada por la positividad de CK5 y CK13. La maduración posterior del urotelio implica la pérdida de CK20 en prácticamente todas las capas, excepto en las células paraguas. Por lo tanto, parece haber tres fases distintas de desarrollo urotelial. La primera etapa se caracteriza por la falta de células basales y la expresión de CK20 en todas las capas. La segunda fase está determinada por la apariencia de la capa basal, pero el patrón de expresión de CK20 sigue siendo difuso. En la tercera y última etapa, hay maduración del patrón de expresión CK20 que se caracteriza por CK20 solo en la capa de paraguas. La capa basal está bien desarrollada y se puede demostrar con inmunotinción CK5/6 o CK13 .

3. Expresión de citoqueratina en Urotelio Normal

La vejiga urinaria está revestida de urotelio, que está especializado para funcionar como barrera a la orina y para adaptarse a los cambios en el volumen intraluminal. El urotelio aparece como un epitelio multicapa, con tres zonas celulares: (1) una capa de células basales compuesta de células en contacto y orientadas perpendicularmente al plano de la membrana basal; (2) la zona celular intermedia compuesta de 2-5 capas celulares; (3) una capa celular luminal o superficial compuesta de células intermedias tardías y células «paraguas» grandes, frecuentemente binucleadas, con su superficie apical orientada hacia la luz. Las células paraguas se caracterizan por un tipo de zonula ocludens de uniones celulares y por la presencia de placas especializadas de la membrana unitaria asimétrica en la membrana celular apical y dentro de las vesículas fusiformes intracelulares . Esta apariencia se debe a la presencia de abundante uroplaquina dentro de la membrana celular .

En el urotelio adulto normal, CK7, CK8, CK18 y CK19 se expresan en todas las capas de células uroteliales, CK5 se expresa basalmente y CK20 se asocia con células paraguas (Figura 1).

(un)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

(a) Normal urotelio revelando múltiples capas de células, incluyendo células basales, células intermedias, y el paraguas de las células. b) Tinción inmunohistoquímica que revela un patrón de tinción normal del urotelio. Las celdas del paraguas están decoradas con CK20 (magenta). Las células intermedias no están manchadas. Las células basales están decoradas con tinción CK5 / 6 (marrón).

También puede haber algunas células CK20 positivas en la capa celular intermedia de algunas muestras normales .

4. La expresión de citoqueratina en la Neoplasia Urotelial Papilar

La transformación neoplásica de las células uroteliales da lugar al carcinoma urotelial, la forma más común de cáncer de vejiga en la mayoría de los países. Muchos pacientes presentan tumores superficiales que son no invasivos (pTa) o invaden la lámina propia solamente (pT1). Si bien la recurrencia es común (50-70%), la enfermedad generalmente se puede controlar con tratamiento local. Sin embargo, entre el 10 y el 15% de los pacientes con enfermedad superficial evolucionan a enfermedad invasiva muscular y metastásica. Un aumento en el grado, caracterizado por una pérdida de diferenciación, y la presencia de cambios displásicos son determinantes de mal pronóstico. Además, algunos carcinomas uroteliales muestran diferenciación basal / escamosa, lo que se ha relacionado con un pronóstico más precario .

El patrón de tinción inmunohistoquímica para citoqueratina20 y CK5/6 varía con el tipo y la naturaleza de la neoplasia urotelial. Por ejemplo, las neoplasias uroteliales papilares de potencial maligno limitado (PUNLMP), así como los carcinomas papilares de bajo grado, revelan una tinción de CK20 limitada a las células paraguas y CK5/6 confinada a la capa basal, idéntica a la distribución de estas queratinas en el urotelio normal (Figura 2).

(un)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 2

(a) Bajo grado de carcinoma urotelial papilar. b) Tinción inmunohistoquímica que representa la expresión de CK20 (magenta) limitada a las células paraguas y una capa basal bien formada representada por la tinción de CK5/6 (marrón). c) Carcinoma urotelial de bajo grado con tinción de células basales pero sin células paraguas.

Los carcinomas uroteliales de alto grado, por otro lado, tienden a tener inmunorreactividad difusa para CK20 que involucra a las células paraguas, así como a la capa intermedia. Además, la capa basal puede ser demostrada por la positividad a CK5 / 6 (Figura 3).

(un)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 3

(a) de Alto grado carcinoma urotelial papilar. b) Carcinoma urotelial papilar de alto grado con tinción difusa de espesor completo para CK20 y presencia de capa basal, como se demostró con la tinción CK5/6. c) Carcinoma urotelial de alto grado que revela la presencia difusa de células basales y tinción de espesor completo para CK20.

El carcinoma urotelial papilar de mayor grado, por otro lado, revela la expresión de CK20 en todo el grosor del urotelio con ausencia de capa basal y tinción negativa para CK5/6 (Figura 4).

(un)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 4

(a) carcinoma urotelial de Alto grado con pérdida parcial de células basales, pero coloración difusa para CK20. b) Carcinoma urotelial de alto grado con pérdida casi completa de células basales. c) Carcinoma urotelial papilar de alto grado que revela tinción inmunohistoquímica difusa para CK20 y ausencia completa de capa basal sin tinción para CK5 / 6.

Este patrón con tinción difusa de CK20 de espesor completo en ausencia de tinción de la capa basal también es una característica que se encuentra en los carcinomas uroteliales de alto grado con lámina propia o invasión muscular (Figura 5).

(un)

(b)

(a)
(b)

Figura 5

(a) carcinoma urotelial de Alto grado con los inicios de la invasión mostrando un fuerte CK20 tinción citoplasmática y la ausencia de células basales. b) Carcinoma urotelial de alto grado con invasión extensa. Las células del carcinoma son difusamente positivas para CK20, pero la capa basal está ausente.

Se ha sugerido que el patrón de tinción de CK20 es un complemento útil de la morfología en el diagnóstico del carcinoma urotelial. También se ha sugerido que la expresión de CK20 puede predecir el potencial maligno en tumores uroteliales de grado bajo y, por lo tanto, CK20 puede ser útil para definir estrategias de tratamiento para pacientes con estos tumores. La expresión de CK20 fue retenida por la mayoría de los carcinomas uroteliales puros, conservando el patrón de localización superficial normal en algunos tumores papilares bien diferenciados o mostrando una reacción heterogénea o uniformemente positiva en todas las capas celulares. Porciones del carcinoma con diferenciación escamosa revelan una reducción de la expresión de CK20. Estas áreas, sin embargo, reaccionan positivamente para CK5/6 (Figuras 6(a) y 6(b)) en un patrón que es diferente de la distribución basal de la capa basal .

(un)

(b)

(c)

d)

(a)
(b)
(c)
d)

Figura 6

(a) carcinoma urotelial de Alto grado con focal de diferenciación escamosa. b) Tinción inmunohistoquímica que demuestre una fuerte tinción de CK5/6 en la zona de diferenciación escamosa. La parte restante del carcinoma se tiñe para CK20. c) Carcinoma urotelial de alto grado con características morfológicas basoscamosas. d) Tinción inmunohistoquímica en carcinoma basocamoso con una fuerte inmunotinción para CK5/6 y ausencia completa de positividad a CK20.

En algunos casos, todo el carcinoma puede mostrar características basoscamosas. Estos casos muestran una reactividad fuerte para CK5 / 6 con poca o ninguna positividad para CK20(Figuras 6(c) y 6 (d)).

Dos estudios publicados recientemente han proporcionado evidencia adicional sobre la importancia clínica de varios patrones de inmunotinción para CK20 y CK5/6. En uno de estos estudios, se analizaron muestras tumorales de 222 pacientes con carcinomas uroteliales del tracto superior tratados con nefroureterectomía radical para determinar la expresión de siete marcadores inmunohistoquímicos basales/luminales (CK5, EGFR, CD44, CK20, p63, GATA3 y FOXA). Al usar CK5 y CK20, definieron cuatro subtipos de carcinomas uroteliales del tracto superior:(i)Exclusivamente CK20 positivo y CK5 negativo (CK20+/CK5−)(ii)Exclusivamente CK5 positivo y CK20 negativo (CK20−/CK5+)(iii)Ambos marcadores positivos (CK20+/CK5+)(iv)Ambos marcadores negativos (CK20−/CK5−)

En el análisis de regresión de Cox multivariable, el subtipo CK20+/CK5 fue un marcador pronóstico con un aumento de 3,83 veces el riesgo de muerte específica por cáncer en comparación con los otros tres subtipos .

En un segundo estudio, se notificó que la tinción inmunohistoquímica para CK5/6 y CK20 estaba correlacionada con el pronóstico del carcinoma urotelial precoz. Además, se estudiaron los perfiles de expresión génica de subgrupos de carcinoma urotelial del tracto superior superior papilar no invasivo muscular de alto grado (UTUC) clasificados según los niveles de expresión de CK5/6 y CK20 y se correlacionaron con los resultados clínicos. Estos subgrupos incluían CK5 / 6-alto / CK20-bajo, CK5/6-alto/CK20-alto y CK5/6-bajo / CK20-alto. Este último grupo, caracterizado por una expresión baja de CK5 / 6 y una expresión alta de CK20, fue predictivo de peor pronóstico de carcinomas uroteliales papilares de alto grado no invasivos musculares. El análisis transcripcional reveló 308 genes expresados diferencialmente entre los subgrupos. Los análisis funcionales de los genes identificaron la adhesión celular como un proceso común enriquecido diferencialmente en este subgrupo en comparación con los demás, lo que podría explicar su fenotipo de alto riesgo. Las firmas de ciclo celular tardío/proliferación también se enriquecieron en este subgrupo . Por lo tanto, parece que los tumores uroteliales caracterizados por tinción difusa para CK20 en ausencia de capa basal demostrable representan el subtipo más agresivo de carcinoma urotelial papilar.

La citoqueratina 5/6 está presente en la epidermis queratinizante normal y en el epitelio de la mucosa escamosa, así como en las células basales o células mioepiteliales de la mama, las glándulas salivales y la próstata . En biopsias de próstata y mama, CK5/6 decora la capa de células basales y, por lo tanto, es útil en el diagnóstico de carcinoma invasivo, este último carente de células basales. La arquitectura del urotelio es diferente de la del epitelio ductal prostático o mamario, con el resultado de que la presencia o ausencia de células basales no se puede usar para estratificar neoplasias uroteliales en tipos benignos o malignos. Sin embargo, la ausencia de células basales en las neoplasias uroteliales puede indicar un pronóstico precario. Por lo tanto, un carcinoma urotelial de grado alto con una capa basal preservada puede comportarse de manera menos agresiva en comparación con otro tumor de grado alto en el que se perdió la capa basal. En nuestro laboratorio, utilizamos tinción doble para estas citoqueratinas, lo que es extremadamente útil para la interpretación adecuada de estas manchas.

También se puede observar un patrón de tinción similar en el carcinoma urotelial in situ . Estas lesiones suelen ser muy reactivas para CK20 y pueden o no retener la capa de células basales CK5 / 6 positiva. El tipo de carcinoma urotelial adherente in situ y la extensión pagetoide de las células del carcinoma también se pueden reconocer mediante tinción positiva de CK20 (Figura 7).

(un)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 7

(a) carcinoma Urotelial in situ con fuerte espesor total de la inmunotinción para CK20 con una clara capa de células basales positivo para CK5/6. b) Otro carcinoma urotelial in situ con tinción fuerte para CK20 y ausencia de capa basal. c) Extensión pagetoide del carcinoma urotelial demostrada por una fuerte tinción citoplasmática para CK20 en un fondo de múltiples capas de células basales reactivas para CK5/6.

En una minoría de casos, el carcinoma in situ puede ser reactivo para CK5 / 6, lo que indica una diferenciación basaloide .

5. Diferenciación Urotelial embrionaria versus Desdiferenciación en Neoplasia Urotelial

La estrecha correlación entre los patrones de expresión del isotipo de citoqueratina y la diferenciación epitelial sugiere que las citoqueratinas son cruciales para la estructura o función del tejido epitelial. Sin embargo, ha sido difícil establecer cuáles son las contribuciones precisas de individuos o combinaciones de isotipos de citoqueratina al fenotipo y comportamiento de las células epiteliales normales y neoplásicas. Por lo tanto, los cambios en la inmunolocalización de la CK20 que indican un mayor riesgo de recidiva del carcinoma urotelial probablemente reflejen un cambio secundario relacionado con la desregulación del programa de diferenciación urotelial durante la carcinogénesis, en lugar de indicar que la CK20 está directamente involucrada. Se puede especular que los patrones de expresión de CK20 y CK5/6 en varios carcinomas uroteliales tienden a imitar los estadios del desarrollo embriológico y la diferenciación del urotelio. Por lo tanto, los carcinomas uroteliales de alto grado (con o sin invasión) que se caracterizan por la expresión difusa de CK20 sin ninguna capa basal pueden representar el estadio temprano de la diferenciación urotelial después de que el seno urogenital se separa de la cloaca . Durante esta etapa de desarrollo, el urotelio manifiesta tinción difusa de CK20, pero carece de una capa basal. En algunos de los carcinomas uroteliales de alto grado, hay tinción uniforme de todas las capas por CK20, pero también hay una capa basal bien formada demostrable por la expresión de CK5 / 6. Esto puede ser equivalente a la etapa intermedia de la diferenciación urotelial embrionaria. Los carcinomas uroteliales bien diferenciados se caracterizan por la presencia de un patrón maduro de expresión de CK20 donde su expresión se limita principalmente a las células paraguas, mientras que la capa de células basales bien definida inmunorreactiva para CK5/6 también está presente (Figuras 8 y 9).

Figura 8

(a) Caricatura que representa las etapas de diferenciación durante el desarrollo embriológico del urotelio. Durante las primeras etapas, el urotelio en desarrollo conserva la expresión de CK20 que normalmente se ve en la cloaca. Durante esta etapa, no hay capa basal presente. b) Durante el desarrollo del urotelio, la capa basal no puede demostrarse mediante tinción para CK5/6. c) Etapa final de diferenciación urotelial con expresión normal de CK20 limitada a las células paraguas y presencia de expresión de CK5/6 en la capa basal normal.

Figura 9

(a) Caricatura que representa un patrón de tinción inmunohistoquímica en un carcinoma urotelial papilar de bajo grado con expresión de CK20 limitada a las células paraguas y presencia de una capa basal bien definida que expresa CK5/6. b) El carcinoma urotelial de alto grado revela la expresión de CK20 en todas las capas de urotelio, excepto en la capa basal que contiene CK5 / 6. Esto puede representar un estadio intermedio de desdiferenciación del tumor. c) En el carcinoma urotelial de grado alto, la capa basal puede estar ausente, pero se mantiene el patrón difuso de tinción CK20. Estas características pueden indicar una mayor desdiferenciación del carcinoma.

Este patrón puede ser equivalente a la etapa final de desarrollo y maduración urotelial durante el período intrauterino.

En resumen, la tinción inmunohistoquímica del carcinoma urotelial para CK20 y CK5/6 puede proporcionar información útil sobre la naturaleza del carcinoma urotelial y su comportamiento clínico.

Disponibilidad de datos

No se utilizaron datos para apoyar este estudio.

Conflictos de intereses

Los autores declaran que no tienen financiación ni conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer la valiosa asistencia y experiencia técnica del siguiente personal técnico y de supervisión de nuestro laboratorio de inmunohistoquímica en la realización de la tinción inmunohistoquímica de dos colores: la SRA. Rajaa Al Abdulla, supervisora; la SRA. Huda Ahmed Al Hijji, supervisora; y la Sra. Zuhoor Ali, tecnóloga sénior.