Plantas y el patógeno
La planta de hielo común (Mesembryanthemum crystallinum L.) se cultivó invernadero descrito por Kuźniak et al. . Después de la aparición del 3er par de hojas, un conjunto de plantas se regó con NaCl de 0,4 M para inducir el Metabolismo del Ácido Crasuláceo (plantas CAM), mientras que otro se regó con agua del grifo (plantas C3). Después de 12 días, la inducción de CAM en las plantas tratadas con NaCl se confirmó midiendo el malato ural diurno en la savia de las células foliares. A partir de entonces, las hojas de los pares de hojas 2 de plantas C3 y CAM se inocularon con Botrytis cinerea de acuerdo con Kuźniak et al. .
Imágenes de fluorescencia de clorofila a
La versión Mini de un Fluorómetro de Clorofila Serie M de imágenes-PAM (Walz, Effeltrich, Alemania) equipado con un soporte de hojas se utilizó para registrar imágenes de fluorescencia (Fluorómetro de clorofila serie M de Imágenes-PAM) . El fluorómetro es un modelo de clip de hoja para aplicaciones de campo. El soporte de hojas asegura que la hoja se mantenga horizontal a la fuente de luz para evitar una iluminación heterogénea en diferentes áreas de la muestra de hojas. Las posiciones de muestreo fueron elegidas para estar igualmente espaciadas a lo largo de la nervadura media, sin embargo, diferían ligeramente para cualquier hoja debido a su tamaño y morfología, y la técnica de colocar las hojas en el soporte. Para identificar los efectos del estrés biótico solamente, y para evitar la introducción de artefactos en el procedimiento de medición de fluorescencia de clorofila, no se aplicaron marcas de referencia que permitieran la referencia de imágenes de hojas a las hojas. La fluorescencia de clorofila de hojas de plantas de hielo común se obtuvo definiendo el área de interés (herramienta AOI) utilizando el software Imaging Win 2.41 a.
Con la imagen-PAM, el rendimiento de fluorescencia actual (Ft) se monitorizó continuamente. Las plantas se adaptaron a la oscuridad durante 20 min. Al aplicar un pulso de saturación, se determinó el rendimiento de fluorescencia a nivel oscuro (Ft = F0) y el rendimiento de fluorescencia máximo (Fm). Se tomaron imágenes del rendimiento cuántico máximo de PSII, Fv/Fm, y los rendimientos cuánticos de disipación de energía regulada y no regulada en PSII, Y(NPQ) e Y(NO). Fv / Fm se calculó de acuerdo con la ecuación: Fv/Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ) se calculó de acuerdo con Kramer et al. por la fórmula: 1-Y (II) − 1/(NPQ + 1 + qL (Fm/F0-1)). Y (NO) se calculó de acuerdo con Kramer et al. por la ecuación: Y (NO) = 1/. El proceso de obtención de imágenes proporciona imágenes de pseudo-color (modo de color indexado) de material biológico con una resolución de 640 × 480 píxeles correspondiente al campo de visión de las dimensiones físicas de 32 × 24 mm.
Las hojas infectadas de las plantas C3 y CAM se tomaron para el análisis de fluorescencia chl a en el momento de la inoculación y 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 y 72 h después de la inoculación. Se midió la fluorescencia Chl a para las hojas adheridas del segundo par de hojas de tres plantas C3 y CAM procedentes de dos repeticiones independientes de cultivo de plantas. Cada hoja tomada para el análisis se seleccionó por separado en todos los momentos (Fig. 1). Se han procesado series representativas de nueve imágenes (una para cada punto de tiempo) de Y(NO), Y(NPQ) y Fv/Fm para plantas de hielo C3 y LEVAS para medir los cambios de estos parámetros en un área seleccionada de hoja de hoja tamizada a lo largo del tiempo. Para la comparación, Y(NO), Y (NPQ) y Fv/Fm promediaron datos de todas las regiones foliares representadas en la Fig. se obtuvieron 2. Los resultados de la alineación de la imagen y la medición del patrón espaciotemporal de la propagación del estrés biótico en hojas con el método propuesto se ejemplificaron en imágenes Y(NO).
Imágenes de ejemplo de rendimiento cuántico de disipación de energía no regulada en hojas de plantas de hielo comunes. Se aplica a los parámetros de fluorescencia PSII Y(NO) de C3 (a–d) y CAM (e–h). El fragmento de hoja contiene el sitio de inoculación de patógenos y los síntomas de propagación del estrés
Imagen de ejemplo de hoja de planta de hielo común C3 con regiones seleccionadas de interés. Las selecciones hechas manualmente en el editor de firmware cubren las áreas infectadas (1), asintomáticas (2), así como las áreas del nervio medio (3)
Alineación de la imagen
El mecanismo de recolección de datos de imágenes PAM en secuencia de tiempo resulta en el movimiento del fragmento de hoja en el campo de visión entre puntos de tiempo individuales (Fig. 1). Debido al cambio de posición de la hoja, características como la nervadura media y los sitios de inoculación tienen una ubicación y orientación diferentes. Además, se puede observar el efecto del reajuste. Para evaluar adecuadamente la propagación del estrés, los campos de vista deben sincronizarse mutuamente asumiendo que uno de ellos es una imagen de referencia (fija) y el resto de imágenes deben alinearse con la fija. Este enfoque se conoce en imágenes médicas como registro de imágenes . La tarea básica de registro para las imágenes de fluorescencia es encontrar la transformación de «similitud» que consiste en la rotación, la traducción y el escalado adecuados. La flexión y plegado de la superficie de las hojas por estrés ocurre solo en regiones locales de imágenes individuales y son de menor importancia para la alineación global de imágenes. Pueden compensarse en la etapa de postprocesamiento de registro mediante transformaciones no lineales como, por ejemplo, placas delgadas, estrías de superficie y mapeos demoníacos .
Las imágenes de fluorescencia se toman como una serie de tomas en intervalos de tiempo predefinidos de aproximadamente la misma región foliar. Los elementos característicos de la pila de imágenes consideradas representan principalmente venas de hojas. Sin embargo, son poco distinguibles del contenido de la imagen debido al contraste limitado, así como a la moda de color de la imagen PAM. Las áreas de síntomas de estrés que dominan visualmente el contenido pueden cambiar entre imágenes en una sola serie. En tal situación, el registro automático fallaría.
Los métodos de vanguardia automáticos más populares se basan en la comparación de la intensidad de la imagen con algunas métricas de correlación (métodos basados en la intensidad) o se basan en buscar en las imágenes fijas y en movimiento la correspondencia entre las características de la imagen seleccionadas, como puntos, líneas y contornos (métodos basados en características) . Ninguno de estos enfoques permite el registro adecuado de imágenes de fluorescencia PAM de plantas de hielo comunes, lo que se ha verificado y mostrado en los ejemplos incluidos en materiales complementarios (archivo adicional 1). Los resultados presentados allí confirman que la razón de los registros automáticos fallidos es el fuerte oscurecimiento de las regiones de imagen con características conservadas por cambios dinámicos en el contenido de la imagen causados por la infección del tejido foliar. Las pruebas de los métodos populares se llevaron a cabo tanto por el Estimador de Registro en Matlab como en el entorno de Fiji .
El algoritmo de registro de imágenes PAM se diseñó en el entorno Matlab basado en el conjunto de puntos de control seleccionados manualmente por un experto. Para establecer los puntos de control correspondientes en cada imagen, se aplicó la función cpselect de la Herramienta de Selección de Puntos de control de la Caja de herramientas de Procesamiento de imágenes. Las imágenes se editaron en pares, incluyendo una imagen fija y una imagen en movimiento. La primera imagen adquirida justo después de la inoculación de patógenos se asumió como una imagen fija (de referencia). A través del mapeo interactivo de puntos, el usuario puede señalar no solo los contornos visibles de los nervios, sino también otros elementos característicos, como el punto de inyección, los sitios a lo largo de la propagación del patógeno, así como las células de la vejiga epidérmica más aparentes (Fig. 3).
Puntos de control seleccionados por el experto. Ejemplo de imágenes Y(NO) de un fragmento de hoja de una planta de hielo común de levas: una imagen fija (de referencia), una imagen b en movimiento para alinearse con la fija
Varios pares de puntos de control, distribuidos lo más ampliamente posible sobre la superficie de la imagen de la hoja, son suficientes para alinear correctamente las imágenes de la misma hoja consideradas aproximadamente como un cuerpo rígido. Una distribución más amplia de los puntos de control mejora la sensibilidad de la coincidencia de imágenes, pero está limitada por el campo de visualización de imágenes recortado después de la transformación de alineación y por la posibilidad de una ubicación precisa del punto seleccionado en la hoja de la hoja. Con tal alineación de imagen, la transformación afín se realizó utilizando la función fitgeotrans incluida en Image Processing Toolbox. Esta transformación se ha limitado a la versión de «similitud» (que consiste solo en traducción, rotación y similitud) porque la escena en el fluorómetro PAM parecía no inclinada. Las imágenes en movimiento se compararon con la imagen fija utilizando la función imwarp. La ilustración gráfica del algoritmo de registro se incluye en la Fig. 4.
El diagrama de bloques de registro afín y de spline B opcional aplicado a las imágenes PAM de fluorescencia. \(\left\) – el vector de puntos de control en la imagen fija, \(\left^{\left (k \ right)}\) – el vector de puntos de control en la k-ésima imagen en movimiento, \(\left^{{\left( {k^{\prime}} \ right)}}\) – el vector de puntos de control en la k-ésima imagen en movimiento después del registro de la spline B
Las hojas en varias etapas de infección pueden tener una superficie localmente ondulada o arrugada como en la región marcada en las imágenes de fluorómetro PAM analizadas (Fig. 5a, b), cuya forma puede influir potencialmente en el análisis adecuado del fenómeno de propagación de patógenos. Esto significa que el método de registro afín basado en la transformación geométrica puede no ser suficiente para igualar las imágenes PAM de fluorescencia en algunos casos de hojas con deformación no lineal aparentemente visible. Por lo tanto, los autores proponen un método de registro en dos etapas donde el registro rígido afín es seguido por el registro de splines B que reduce las deformaciones no lineales.
Ejemplo de registros afín y B-spline para imagen de hoja de planta de hielo común C3. a La imagen Y (NO) después de la adquisición de PAM, b la imagen después de la transformación afín rígida con las flechas que representan vectores de desplazamiento establecidos interactivamente utilizados en la segunda etapa del registro y c forma final después del registro de spline B basado en puntos de control
La selección del tipo de registro no rígido aprovecha el hecho de que las hojas de las plantas de hielo comunes representan un material un poco flexible y las pequeñas fuerzas de flexión mantienen los cambios suaves en el perfil de la superficie de la hoja. La especificidad de esta modificación de registro es que los vectores del campo de deformación de la imagen deben imponerse interactivamente. Para este propósito, se adjuntó un editor de campos vectoriales dedicado al algoritmo. Solo se deben especificar unos pocos vectores de desplazamiento en la imagen en movimiento para registrar deformaciones locales y lisas de la superficie de una hoja, como en la Fig. 5b.
Para la segunda etapa del registro se seleccionó el algoritmo B-spline Rueckert. Su implementación está disponible en Matlab Central File Exchange como Dirk-Jan Kroon Spline Registration Toolbox .
El procedimiento de registro B-spline consta de dos pasos básicos:
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Inicialización de una cuadrícula G de puntos de imagen distribuidos uniformemente a través de la superficie de la imagen con todos los vectores de campo de deformación establecidos a cero, y luego cálculo de un campo vectorial denso T de deformaciones en la cuadrícula G por interpolación cúbica de B-spline de vectores de desplazamiento de punto de control establecidos manualmente \(\left^{\left( k \right)}\). Tanto la cuadrícula como el campo de transformación asociado T se refinan iterativamente en 4 pasos para reducir el espaciado de los nodos de la cuadrícula. La transformación T es preparada por la función point_registration de Spline Registration Toolbox.
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Transformación de estrías B de todas las posiciones de píxeles e interpolaciones bi-cúbicas de componentes de color en la imagen en movimiento (registrada como afín) \(I_{M}\) de acuerdo con el campo de deformación suavizado de estrías.
Precisión de registro de imagen
La precisión de la alineación de imagen propuesta se realizó mediante el cuadrado medio de la raíz (RMS) en desviaciones de N = 15 puntos de control mostrados en la Fig. 3. El desplazamiento de cada punto de control de imagen fijo \(P_{i}\) evaluado en una imagen en movimiento para el caso con y sin la alineación se ilustró en la Fig. 6 como los vectores \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\) y \(Q_{i} P_{i} =\Delta q_{i}\), respectivamente. Los errores de desplazamiento RMS de todos los puntos de control en una sola imagen para los dos casos se expresan en Ec. (1) como \(\Delta r_{\text{rms}}\) y \(\Delta q_{\text{rms}}\).
Ilustración de la evaluación de errores en el registro afín de imágenes PAM. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—punto de control en la imagen fija \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—mapeo del punto de control \(P_{i}\) en la imagen en movimiento \(I_{M}\), \(R_{i}\)—mapeo del punto de control \(P_{\text{i}}\) después del registro, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—error de desplazamiento del punto de control \(P_{\text{i}}\) después del registro
El porcentaje de desplazamiento residual \(\delta_{rms}\) después del registro de tipo afín, se puede evaluar por una imagen de acuerdo con la Ec. (2).
Los errores de registro afín evaluados se enumeran en la Tabla 1. Los desplazamientos originales \(\Delta q_{\text{rms}}\) que varían de 3,01 a 7,09 mm se reducen después del registro de ‘similitud’ al rango de 0,45 a 1,71 mm de \(\Delta r_{\text{rms}}\) para la planta C3 probada. Los mismos parámetros de la LEVA de la planta son \(1.90 \div 5.69\;{\text{mm}}\) de \(\Delta q_{\text{rms}}\) y \(0.41 \div 1.53\;{\text{mm}}\) de \(\Delta r_{\text{rms}}\). Cuando \(\delta_ {rms}\) se promedia para las series de imágenes C3 y CAM, equivale aproximadamente al 21% y al 23%, respectivamente. Los valores de los parámetros de fluorescencia Y(NO), Fv/Fm y NPQ obtenidos de imágenes de hojas de plantas de hielo sin registro se recuperan de partes incompatibles de la hoja y no se pueden tener en cuenta (ver archivo adicional 2).
Para la asignación de registro de splines B adicionales, el error de transformación se define por dos componentes. El primero de ellos es el desplazamiento posterior al registro \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\) que se muestra en la Fig. 7a, con \(R_{i}\) evaluado en la Ec. (3) como el centroide \(\bar{p}\) de la región \(A_{i}\).
donde \(I_{R} \left (p \ right) \in\ left\) denota la intensidad de la imagen del punto de control registrado en el píxel p, \(\left| {A_{i}}\right|\)—el área de la región de desenfoque. El segundo componente de error se define por el radio de desviación estándar \(\rho_{i}\) de la extensión de intensidad alrededor de cada punto de control \(R_{i}\) como se describe en la Ec. (4).
donde \(\left\| \cdot \derecho\|\) indica la norma Euclídea del vector entre los puntos p y \(\bar{p}\) en el plano de la imagen. El desenfoque del punto de control alineado \(R_{i}\) aparece debido al hecho de que el registro no lineal utiliza interpolación bicúbica en la cuadrícula de resolución finita G. Este efecto se midió experimentalmente realizando una transformación de ranura B dada en la imagen construida a partir de puntos de control blancos sobre un fondo negro. La tabla 2 incluye las magnitudes \(\Delta q_{i}\) de N = 9 ejemplos de vectores de campo de desplazamiento que se muestran en la Fig. 5b. Las magnitudes \(\Delta r_{i}\) de los errores de mapeo vectorial después del registro de splines se miden entre los puntos de control fijos deseados \(P_{i}\) y los centros de los puntos registrados \(R_{i}\) evaluados en la región \(A_{i}\). Todos los valores \(\Delta r_{i}\) probados están por debajo de la resolución de píxel igual a \(50\;\upmu{\text{m}}\) y se pueden omitir: redondeados a 0. Esto significa un posicionamiento preciso de los puntos de control mediante la transformación estriada. La desviación estándar \(\rho_{i}\) de la región de desenfoque mostrada en la Tabla 2 después de doblar puede ser una medida de desenfoque de punto de control. Entonces varía aproximadamente de \(24\; {\text {a}}\; 63\; \ upmu {\text{m}}\) lo que es el equivalente de desenfoque de un píxel. Por lo tanto, esta transformación permite restaurar localmente la forma adecuada de los cambios de Y(NO) en una imagen de fluorescencia.
Explicación del error en el registro de imágenes de spline B de imágenes PAM. a El desajuste de la asignación de la ubicación del punto de control durante el registro, b distribución de la intensidad de la imagen del punto de control registrado por estrías, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—punto de control en la imagen fija \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—el equivalente del punto de control \(P_{i}\) en la imagen en movimiento \(I_{M}\), \(R_{i}\)—mapeo del punto de control \(P_{i}\) después del registro, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—medida de error de desplazamiento de mapeo del punto de control \(P_{i}\), \(A_{i}\)—región borrosa alrededor de \(R_{i}\) correspondiente al punto de control \(P_{i}\), \(\rho_{i}\)—el radio de desviación estándar de \(R_{i}\) desenfoque
La medición de la propagación de tensiones
El análisis de datos aplica una herramienta de edición especial para manipular una pila de imágenes PAM después de su registro. La función de editor principal permite dibujar dos secciones de línea de adquisición de datos \(L_{1}\; {\text{y}}\; L_{2}\) de igual longitud (Fig. 8), que se puede observar y está disponible en cualquier imagen de la pila. En el experimento considerado, la primera línea \(L_{1}\) comienza en el sitio de inoculación \(s_{1}\), donde el factor de estrés se aplica al tejido foliar en el momento t, y debe establecerse aproximadamente en la dirección de expansión de estrés. La segunda línea \(L_{2}\) se coloca a lo largo de la nervadura media donde la influencia del esfuerzo observado en el tiempo siempre fue limitada y los parámetros de fluorescencia exhiben cambios mínimos. Las líneas deben encajar completamente en el contexto de la imagen.
Regiones de medición en imágenes Y (NO) de hojas de plantas de hielo comunes después de la alineación de la computadora. Los puntos de medición indican: (1) mesófilo en el lugar de inoculación, (2) mesófilo sin lesión, (3) nervio medio cerca del lugar de inoculación. La línea de medición (L1) está orientada en la dirección de propagación del estrés dentro del mesófilo y la línea (L2) se encuentra a lo largo de la nervadura media. Líneas iniciadas en los puntos (S1) y (S2), respectivamente
Es posible una opción adicional de medición puntual cuando tres pequeñas regiones circulares diferentes del radio de 10 píxeles se colocan interactivamente en el campo de visión (Fig. 8). Deben pertenecer a las regiones foliares con diferentes parámetros de fluorescencia a lo largo del tiempo. Todos los valores de píxeles registrados se promedian dentro de estas regiones.