El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método importante para el monitoreo de la regulación transcripcional con conocimiento descubierto de las interacciones entre proteínas específicas y una región genómica del ADN. Dado el hecho de que las proteínas de unión al ADN (incluidos los factores de transcripción y las histonas) en las células vivas pueden estar reticuladas al ADN al que se unen, el ChIP se utiliza para inmunoprecipitar el complejo proteína-ADN a partir de lisados celulares mediante un anticuerpo apropiado. Los complejos inmunoprecipitados se recogen por centrifugación, y las proteínas se elutan para análisis posteriores, como western blot y LC / MS. El análisis de ácido nucleico se logra a través de PCR, RT-PCR, secuenciación de ADNc y microarray. Este protocolo proporciona un procedimiento detallado para lograr un ensayo de chips exitoso de una manera rápida y eficiente.Reactivos
:
- 37% formaldehído
- 1 M glicina
- Tampón de lisis celular: NaCl de 150 mM, Tris-HCl de 50 mM (pH 7,5), EDTA de 5 mM, NP-40 de 0,5%, Tritón X-100 de 1%, con cóctel de inhibidor de proteasa de 1×.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Añadir 27 µL de formaldehído al 37% por medio de cultivo de 1 mL para obtener una concentración final al 1%, incubar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se agita lentamente con un dispositivo de balanceo o agitación.
2. Apagar el enlace cruzado añadiendo 141 µL de 1 m de glicina por medio de cultivo de 1 mL para obtener una concentración final a 125 mm, incubar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Para celdas flotantes: colocar las celdas en un tubo cónico de 15 mL, centrifugar a 2.000 × g a 4°C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave las células dos veces con PBS frío.
Vaya al paso 5.
4. Para las células adhesivas: retire el medio, lave las células dos veces con PBS frío. Raspar las células en PBS en un tubo cónico de 15 mL, centrifugar a 2.000 × g a 4°C durante 5 min.
Lisis y sonicación
5. Desechar el sobrenadante, añadir 1 ml de tampón de lisis de células frías por 1 × 107 células. Resuspender el gránulo pipeteando varias veces hacia arriba y hacia abajo, e incubar en hielo durante 10 minutos.
6. Sonicar a cortante de la cromatina en 0,5~1 kb fragmento. Evite la espuma y mantenga la muestra en hielo.
Notas:
- Las condiciones de sonicación deben optimizarse dependiendo de la muestra y el modelo de sonicador. Por lo general, se ha encontrado que funcionan seis pulsos de 15 segundos seguidos de períodos de descanso de 45 segundos en la salida 6.0. Para analizar el tamaño del fragmento, extraiga un pequeño volumen de ADN total de una alícuota de cromatina esquilada y luego analícelo en un gel de agarosa (1~2%).
- Se sugiere que los volúmenes sean ≤ 1 mL para mantener la eficiencia de sonicación.
7. Centrifugar a 12.000 × g a 4°C durante 10 minutos y conservar el sobrenadante.
8. Transfiera 0,5 ml de sobrenadante a un nuevo 1.Tubo de 5 mL para análisis de fragmentos de ADN.
Inmunoprecipitación
9. Añadir anticuerpos relevantes o IgG normal a la muestra e incubar durante 15 minutos en un baño de agua ultrasónico a temperatura ambiente.
Notas:
- Elija IgG de la misma especie donde se produjeron los anticuerpos.
- El tiempo de incubación debe optimizarse en función del anticuerpo y el antígeno. Para antígenos con un bajo nivel de expresión, la incubación podría realizarse a 4°C durante la noche en una plataforma giratoria .
10. Preparar perlas de proteína A-agarosa: lavar las perlas tres veces con 1 ml de tampón de lisis (sin inhibidor de proteasa), centrifugar a 2000 × g durante unos segundos a 4°C y desechar el sobrenadante.
11. Diluir perlas 1:1 con tampón de lisis y añadir 50 µL a la muestra.
12. Incubar a 4°C durante 30~45 min en una plataforma giratoria.
13. Centrifugar a 2000 × g durante 1 minuto a 4 ° C y, a continuación, desechar el sobrenadante.
14. Lavar las perlas cuatro veces con 1 ml de tampón de lisis (sin inhibidor de proteasa), desechar el sobrenadante.
Purificación y análisis de ADN
15. Resuspender las cuentas lavadas con 100 µL 10% Chelex 100.
16. Pipetee hacia arriba y hacia abajo durante varios segundos y, a continuación, hierva la muestra durante 10 minutos.
17. Centrifugar a 12.000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente y transferir el sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 ml.
18. Purificar el ADN utilizando un kit de purificación de ADN o mediante un protocolo estándar de extracción de fenol: cloroformo.
19. Disuelva el ADN con 50 µL ddH2O y use 2~10 µL de la muestra de ADN (25% del volumen de reacción) en las reacciones de PCR
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