Quimeras

Lo Que Proporcionará Parte I

• Un número de cuenta.
• Una línea de células ES sin micoplasma con 40 cromosomas.

Lo que Haremos

• Inyectaremos aproximadamente 50 blastocistos por línea celular ES. Esto debería dar lugar al nacimiento de 10 ratones. Se espera que tres de los ratones sean fuertes quimeras masculinas. Tenemos un historial probado de éxito.
• Alojaremos a los ratones hasta el destete (tres semanas después del nacimiento).

Lo que Proporcionará Parte II

• Alojará a los ratones destetados.

Costo

• 3.300 dólares por 129 líneas celulares y el costo de las mujeres donantes; 4.950 dólares por línea celular y el costo de las mujeres donantes para otros antecedentes genéticos.
• Los pedidos locales que no sean de CWRU se cobrarán 2 200 adicionales por empacar y transportar ratones. Los pedidos no locales se cobrarán 2 200 y los costos de transporte.

Cumplimiento normativo

• Los investigadores necesitan un protocolo IACUC de su institución para recibir ratones del núcleo. Los protocolos CWRU IACUC deben especificar el uso del Núcleo Transgénico Case. Normalmente, los investigadores no necesitan un protocolo de RIG propio: la revisión del ADN recombinante en animales se llevará a cabo sobre la información enviada a través de pedidos en línea para el núcleo transgénico, y se agregará al protocolo de RIG del núcleo como una enmienda si se aprueba. La IBC puede ponerse en contacto con usted para obtener información adicional como parte de la revisión del ADNr después de la presentación de la orden. Se requiere la aprobación de los RIG antes de iniciar las inyecciones.

Agradecimientos

• Le pedimos que reconozca el Caso Transgénico y la Instalación de Orientación en seminarios y publicaciones.

Línea de tiempo

• A partir de la fecha de inyección de las células, será un mínimo de 6 semanas antes de que podamos entregarle ratones (casi 3 semanas para la gestación y al menos 3 semanas de crecimiento postnatal antes del destete). Pasarán otras 6 semanas antes de que las quimeras masculinas tengan la edad suficiente para reproducirse, y un mínimo de otras 6 semanas antes de que haya destetado a la descendencia para genotipo para probar la transmisión de la línea germinal, un total de 4.5 meses desde la inyección hasta la prueba de transmisión por línea germinal.
• El tiempo esperado actual (3/25/21) entre la colocación del pedido y la inyección de células ES es de 8 semanas. Durante las 8 semanas previas a la inyección, la solicitud de quimera es revisada por el comité de ADNr del IBC, las células ES se descongelan y crecen, y se ordenan y reciben ratones.

Tasa de éxito en la generación de Ratones Quiméricos

El núcleo genera un promedio de aproximadamente 5 quimeras por línea celular.

Primeros pasos
La probabilidad de transmisión de la línea germinal de una mutación dirigida aumenta con el número de líneas de células ES independientes disponibles. En promedio, alrededor de dos tercios a tres cuartos de las líneas de células ES de los 129 antecedentes genéticos pasarán a la línea germinal. Para las líneas de células ES en el fondo C57, un promedio de solo la mitad a dos tercios de las líneas pasarán a la línea germinal. Por lo tanto, si está comprando líneas de celdas ES dirigidas de un repositorio público, le recomendamos que compre 3 o más líneas dirigidas correctamente en el fondo 129 y 4 o más líneas en el fondo C57. Del mismo modo, ordene 2 o más inyecciones para 129 líneas y 3 o más para líneas C57. Para la generación de knockouts específicos de tejidos con alelos condicionales en células ES de EUCOMM, consulte nuestra cartilla.

Preguntas frecuentes

¿Qué son las quimeras?
Típicamente, las quimeras se construyen para generar ratones a partir de líneas de células ES dirigidas a genes o atrapadas en genes. Las células ES inyectadas en los embriones del huésped dan lugar a ratones mosaico conocidos como quimeras.
Se inyectan células ES masculinas en blastocistos no sexuales. Si el embrión huésped es femenino y las células ES masculinas producen células germinales, la quimera a menudo será un varón fértil. Se utilizan embriones huéspedes de una cepa que no compite demasiado con las células ES, y los dos componentes (ES y embrión huésped) están marcados genéticamente con genes del color del pelaje para que se pueda determinar fácilmente la contribución de las células ES al animal. Si la proporción de descendientes de células ES en el pelaje del animal es alta, la probabilidad de que las células ES estén representadas en los gametos también es alta, ya que las células ES se mezclan completamente con las células huésped al principio de la embriogénesis. El sistema de marcado de color de pelaje también permite determinar, con cruces apropiados, si la descendencia de las quimeras proviene del componente de células ES o del componente embrionario huésped.

129 células ES dan lugar al color de pelaje marrón porque son A/A (agutí de tipo salvaje), y los embriones huéspedes C57BL/6J dan lugar al color de pelaje negro porque son a/a (nonagutí recesivo). Las células ES son de la cepa 129 de ratones; los embriones huéspedes son de la cepa C57BL / 6J de ratones. Si estas quimeras se crían en ratones a / a no agutíes (por ejemplo C57BL/6J, entonces cualquier descendencia marrón (A/a) debe haber surgido de gametos derivados de células ES, y se espera que el 50% de la descendencia marrón lleve el alelo knockout. Alternativamente, la transmisión de la mutación puede analizarse directamente mediante PCR o ensayos de frotis sureño de tejidos de la descendencia.
Si las células ES son de la cepa C57BL / 6J (a/a, Tyr/Tyr y negro), el embrión huésped será albino C57BL/6J (a/a, Tyrc-2J / Tyrc2-J y blanco). La cría de estas quimeras a C57BL / 6J albino puede generar descendencia negra (a/a, Tyr/Tyrc-2J) del componente de células ES, el 50% de las cuales debe llevar la mutación, y descendencia blanca (a/a, Tyrc-2J / Tyrc-2J) del componente embrionario huésped.
Las quimeras masculinas que es probable que transmitan la mutación objetivo se pueden identificar mediante genotipado de tapón copulatorio.

Quimeras para otros usos
También fabricamos quimeras de agregación y quimeras diploidtetraploides. Dos embriones de preimplantación de dos cepas diferentes de ratones se combinan para formar una quimera de agregación. Esta tecnología se puede utilizar para generar embriones de mosaico genético para el análisis de la autonomía y la no autonomía de la acción génica y otros objetivos experimentales. En las quimeras diploidtetraploides, el componente tetraploide da lugar en gran medida a gran parte de la placenta derivada del embrión y el componente diploide al embrión. Este tipo de quimera se puede usar para determinar si se requiere un gen en la placenta o el embrión.

¿Por qué mis ratones son colores divertidos?
Algunas líneas celulares de ES son heterocigotas para alelos de color de pelaje que solo se revelan en generaciones posteriores. Las células ES R1 129 que utilizamos son heterocigotas en el locus albino, portando una copia del alelo de chinchilla de albino (cch, también designado Tyrc-ch) y son heterocigotas en el locus de dilución de ojos rosados (p). La descendencia reproductora descendiente de células ES R1 entre sí puede dar lugar a ratones que son negros, diferentes tonos de gris, diferentes tonos de marrón o amarillo, dependiendo de la variedad de alelos de color de pelaje.

¿Qué se puede hacer para garantizar la transmisión por línea germinal?
La transmisión de la línea germinal se maximiza con células ES que han pasado un mínimo de tiempo en cultivo, que tienen un complemento normal de cromosomas y que están libres de levadura, bacterias y micoplasma. Apunte a una línea celular que sepa que se transmite bajo sus condiciones en su institución. Use una línea celular parental que esté en el número de paso más bajo disponible (preferiblemente menor que el número de paso 16). Minimice el tiempo de cultivo de la línea objetivo. Verifique que las líneas celulares objetivo tengan el número normal de cromosomas. Prueba de su línea celular para mycoplasma. Algunas líneas celulares no transmitirán incluso cuando todos estos parámetros estén a su favor. Incluso en condiciones óptimas, solo dos tercios de las líneas de células ES objetivo se transmitirán a través de la línea germinal. Por lo tanto, comience con al menos tres líneas celulares específicas independientes para garantizar la transmisión.

Tengo quimeras débiles / quimeras femeninas. ¿Transmitirán el golpe de gracia?
Tanto las quimeras débiles como las quimeras femeninas pueden transmitir alelos mutantes, aunque con poca frecuencia. Las quimeras masculinas que es probable que transmitan la mutación objetivo se pueden identificar mediante genotipado de tapón copulatorio. Solo alrededor del 10% de las quimeras femeninas transmiten el genoma de las células ES, cuando lo hacen es solo en las primeras camadas, y muchas de sus crías masculinas tienen aneuploidías de cromosomas sexuales que las hacen infértiles (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

¿Por qué murieron mis quimeras más fuertes?
La mortalidad puede aumentar con la proporción de animales que provienen de células ES, incluso para las mejores líneas celulares. Esta mortalidad se debe en gran medida a las aberraciones epigenéticas que surgieron en la cultura. Se cree que las aberraciones epigenéticas se corrigen mediante la cría posterior de ratones sobrevivientes, y se segregarían aleatoriamente del lugar objetivo, incluso si no lo fueran.

¿A qué cepa de ratones crío a mis mutantes?
Para minimizar la variabilidad genética lo más rápido posible, procrear las quimeras con el mismo fondo que las células ES. Si las células ES eran 129, cría las quimeras a 129 ratones y tu mutación estará completamente en el fondo endogámico de 129 en un solo paso. El origen endogámico más común para los estudios genéticos es la cepa C57BL / 6. Si sus células ES son C57BL/6, cruce sus quimeras con ratones C57BL/6J. Si desea cambiar el fondo, el estándar es hacer 9 cruces en serie a la cepa endogámica de su elección (aproximadamente 2,5 años). La razón de ser de las 9 generaciones es explicada aquí por Lee Silver. Alternativamente, alrededor de la mitad del número de generaciones es requerido por el backcross asistido por marcadores, o congéneres de velocidad.Para una reproducción máxima, cruce sus ratones con una cepa hereditaria como CD1. Los ratones CD1 se derivaron de ratones suizos, tienen un alto grado de variación genética y se seleccionaron para una reproducción robusta.

Células ES con Alelos Condicionales de EUCOMM
Cada línea celular de EUCOMM requerirá que complete un Acuerdo de Transferencia de Materiales. Comience este proceso lo antes posible.
El tiempo de generación de ratones y el número de cruces necesarios para generar ratones experimentales se combinan con un período de tiempo que sorprende a aquellos que no están acostumbrados a la genética de ratones, así que planifique con anticipación. El tiempo de generación de ratones (el tiempo desde el adulto sexualmente maduro hasta la descendencia sexualmente madura) es de aproximadamente 3 meses.
Los alelos condicionales EUCOMM suelen tener un casete flanqueado por Frt (un casete» Frt-ed»). El casete tiene un aceptador de empalmes que desvía prácticamente todo el empalme al casete, haciendo que el alelo sea una mutación de pérdida de función en esta configuración. Para generar el alelo condicional, el casete flanqueado por Frt debe eliminarse cruzando a ratones que expresan Flpe. El sistema Flpe / Frt es comparable pero distinto del sistema Cre / loxP.
Inyectaremos las células ES en los embriones del huésped para hacer ratones quiméricos. A partir de ahí, criará a los ratones para generar ratones portadores de la mutación (transmisión de la línea germinal). Esta generación fundadora de ratones se puede cruzar a ratones que expresan Flpe para eliminar el casete Frt-ed, generando el alelo condicional. Luego, necesitas hacer varios cruces más para generar los ratones experimentales.

1. De la inyección de células ES a las quimeras adultas sexualmente maduras es el tiempo de generación de ratones (3 meses).
2. Las quimeras se crían en ratones de tipo salvaje para establecer el mutante en la línea germinal (3 meses).
3. Los ratones condicionales frtd heterocigotos se cruzan para expresar homocigotos de Flpe. Esto genera Flpe/ o, frtd condicional / + descendencia. (3 meses)
4. Los ratones Flpe/o, frtd condicionales/+ se cruzan a tipo salvaje para establecer el alelo extirpado en la línea germinal y criar Flpe, y la escisión se verifica molecularmente en estos ratones condicionales/+ (3 meses).
5. Los ratones condicionales/+ se criaron entre sí para hacer ratones alelos condicionales homocigotos (3 meses).
6. Los ratones condicionales / condicionales se crían a ratones Cre/Cre específicos de tejidos, nulos/+ para hacer los ratones Cre/o específicos de tejidos experimentales, ratones condicionales/nulos, y ratones Cre/o específicos de tejidos de control, ratones condicionales/+.

Además, los ratones Fple, nulos, Cre necesitan ser obtenidos, los ratones específicos de tejido-Cre / específicos de tejido-Cre, nulos / + necesitan ser criados.
Además, el alelo condicional debe analizarse para determinar si es de tipo salvaje en función antes de la escisión con Cre, y nulo después de la escisión con Cre. Para determinar si el alelo condicional es de tipo salvaje en función antes de la escisión, se deben examinar mutantes condicionales/condicionales y condicionales/nulos para determinar si su fenotipo es el mismo que el de los ratones +/+ y null/+ respectivamente. Para determinar si el condicional extirpado es un alelo nulo, el condicional se cruza a un ratón Cre de línea germinal y los condicionales extirpados se cruzan para probar si el fenotipo del condicional extirpado/condicional extirpado es el mismo que null/null y/o que no se fabrica ninguna proteína a partir del alelo condicional extirpado.
Un reportero de la actividad de Cre como RosaReporter, o más idealmente, mostrando directamente que la proteína de interés está ausente de las células diana por inmunofluorescencia es un control importante. RosaReporter genera una expresión permanente de beta-galactosidasa en todas las células expuestas a Cre.
La expresión excesiva de Cre puede conducir a la rotura de cromosomas, lo que puede causar fenotipos no relacionados con la función del alelo condicional. Por lo tanto, los ratones hermanos que expresan Cre pero conservan alguna función génica (por ejemplo, condicional/+) son un control importante.