Las pruebas de quimerismo se utilizan para la documentación de rutina del injerto y el seguimiento posterior al trasplante de receptores de trasplante alogénico. Las células del donante y del receptor se pueden distinguir mediante pruebas de marcadores genéticos que se determinan antes del trasplante.2 En trasplantes que no coinciden con el sexo cuando el receptor y el donante son de diferente sexo, la proporción de células femeninas y masculinas generalmente se determina mediante el análisis de marcadores de cromosomas sexuales, con mayor frecuencia con PECES.8,9 La evaluación del número variable de repeticiones en tándem (VNTR) o de repeticiones cortas en tándem (STR) por PCR se ha convertido en el método más valioso para determinar el quimerismo en trasplantes emparejados por sexo.10 Se han desarrollado diversos métodos para la detección de ERM. El análisis morfológico de la médula ósea puede identificar la enfermedad residual que ocupa más del 5% del espacio medular y, por lo tanto, carece de la sensibilidad necesaria para la detección temprana. Además, a menudo es difícil diferenciar una pequeña población de blastos de leucemia de blastos hematopoyéticos normales derivados de donantes que repoblan la médula sin usar marcadores adicionales. Las pruebas específicas pueden detectar ERM cuando hay un marcador tumoral específico, como una anomalía citogenética específica, un inmunofenotipo específico que se puede identificar mediante FACS, secuencias específicas de ADN o ARN que se pueden amplificar mediante PCR o un patrón de crecimiento específico en ensayos clonogénicos. En ausencia de un marcador tumoral específico para la ERM, se puede utilizar la prueba de quimerismo para detectar células derivadas del receptor. Es posible que la detección de células derivadas del receptor no siempre se correlacione con el riesgo de recaída. Las células receptoras que contribuyen al quimerismo mixto (MC) pertenecen al clon maligno o pueden ser células hematopoyéticas normales, o incluso células estromales. Durante las primeras semanas después del trasplante alogénico estándar, las células receptoras aún se pueden detectar cuando se utilizan pruebas sensibles.9,11 En su mayoría, se trata de células T que sobreviven al régimen de acondicionamiento. Las células huésped se pueden detectar a niveles bajos (<1%) incluso más tarde en el curso post-trasplante. La MC se detecta con más frecuencia después de un acondicionamiento no mielosupresor.2 Por lo tanto, las sondas de marcadores específicos del tumor son probablemente superiores y más precisas que las sondas de desajuste de sexo para la detección de ERM.12 Sin embargo, incluso la detección de ERM con pruebas específicas del tumor no siempre se correlaciona con el riesgo de recaída. Se han notificado pruebas de PCR positivas para BCR/ABL en individuos sanos.13 La translocación t (14;18) se detectó en linajes distintos de los linfocitos B en pacientes con linfoma no Hodgkin.14 Puede haber un umbral para que la ERM sea clínicamente significativa. En varias enfermedades, como la LMA con t (8;21), 15 se observaron remisiones de larga duración en presencia de ERM detectada por PCR, mientras que en otros, como en la leucemia promielocítica aguda, la PCR positiva predice recaídas.16 De nuevo, esto puede estar relacionado con la sensibilidad de la prueba de PCR específica y el umbral de significación clínica. Las células malignas residuales pueden estar en estado latente17, sin el potencial de contribuir a la recaída, debido a la falta o ganancia de una segunda alteración genética. En algunas enfermedades puede ocurrir diferenciación parcial a células más maduras y estas células pueden carecer del potencial de proliferar. La ERM puede estar bajo vigilancia inmunitaria, o las células de la ERM pueden estar en una fase apoptótica, lo que las hace irrelevantes para la recurrencia de la enfermedad. Las pruebas de PCR sensibles no preservan la morfología celular y, por lo tanto, no está claro qué células se correlacionan con la ERM en estos entornos diferentes.
El sistema Duet™ para el análisis multiparamétrico morfológico y citogenético simultáneo combinado ofrece algunas ventajas que pueden ayudar a revelar la relevancia de la detección de ERM. Este sistema busca automáticamente un gran número de células (aproximadamente 150000 células por portaobjetos) en busca de subconjuntos celulares pequeños con fenotipo citogenético o inmune único. Aumenta la sensibilidad para la detección de poblaciones pequeñas. En una serie de experimentos de dilución hemos demostrado que la sensibilidad para la detección de una célula masculina en una población de células femeninas es superior a 1:50000, sin embargo, debido a la especificidad limitada en este título, la mejor detección ocurre entre 1:10000 y 1:50000 (véase el apéndice). Como se observó en el análisis de muestras de médula ósea del paciente 1 (último análisis) y del paciente 2, el sistema Duet™ podía detectar poblaciones muy pequeñas de células receptoras de XY no detectadas por PECES de rutina. La precisión cuantitativa de los PECES depende de la frecuencia observada y del número de células puntuadas, lo que mejora al puntuar más células.18 Anotar un número tan grande de células no es práctico con FISH manual, pero el sistema automático Duet™ es capaz de escanear 10000 células/min en microscopía de campo brillante y 2000-10000 células/h en microscopía fluorescente, lo que respalda la necesidad de un escaneo rápido y eficiente y una mayor sensibilidad.
Las pruebas sensibles a menudo se asocian con una especificidad reducida y una tasa de falsos positivos relativamente alta. En el caso de los PECES estándar, puede producirse un falso positivo debido a la hibridación inespecífica de la sonda. La puntuación de falsos positivos para translocaciones cromosómicas puede ocurrir debido a la asociación espacial aleatoria y la fusión óptica.18 El sistema Duet™ puede mejorar potencialmente la especificidad al identificar la morfología de las células en la población buscada. La detección de la positividad de los PECES, en una población pequeña pero con una apariencia morfológica uniforme de Duet™, hace que sea más probable que sea un verdadero positivo que cuando las células positivas se dispersan dentro de linajes diferentes y no relacionados. También se puede mejorar la especificidad de la detección de ERM con pruebas de quimerismo inespecíficas. Como se mencionó anteriormente, las células receptoras pueden pertenecer al clon maligno (como en el paciente 1), pueden ser células hematopoyéticas normales (paciente 3, paciente 1 después del tratamiento con STI571) o células no hematopoyéticas/estromales (como osteoblastos, paciente 2). El sistema Duet™ permite diferenciar entre estas opciones por la apariencia morfológica. En el análisis del paciente 1 y de dos pacientes adicionales (datos no mostrados), hemos demostrado que la identificación de las características del receptor (como la citogenética de género opuesto) dentro de los blastos o las células inmaduras predice la recaída manifiesta y la precede de unas pocas semanas a unos pocos meses. En el paciente 1, los análisis de FISH por separado revelaron una pequeña población receptora de XY (0,6%) y una pequeña población BCR/ABL positiva (0,8%) que podrían considerarse dentro de la tasa de falsos positivos del análisis de FISH. Sin embargo, el sistema Duet™ ha demostrado que una gran proporción de las células receptoras de XY eran blastocitos (y también BCR/ABL positivos por una segunda prueba FISH en las mismas células) y, por lo tanto, podría predecir que el paciente está destinado a recaer. La identificación de una población receptora pequeña dentro de células hematopoyéticas maduras puede no predecir la recaída. En tres pacientes adicionales (datos no mostrados) hemos documentado remisión continua en presencia de una población receptora pequeña con morfología madura. Se necesitan estudios a mayor escala con un seguimiento más prolongado para confirmar la relación entre la morfología de las células huésped residuales y el riesgo de recaída en pacientes sin otros marcadores únicos del clon maligno.
El sistema es relativamente simple de operar, es en su mayoría automático, su tiempo y costos de salida son comparables a otros sistemas para quimerismo y detección de MRD, como PECES estándar y PCR, y puede ser adecuado para pruebas a gran escala. Aparte del hardware y los kits del sistema, solo se necesita equipo estándar fácilmente disponible en laboratorios grandes (véase el apéndice).
En los últimos años, el estudio del quimerismo dentro de diferentes subconjuntos celulares ha ganado en interés y popularidad.19,20 Esto es de suma importancia después de trasplantes no mielosupresores.2 Algunos grupos han demostrado que se requiere quimerismo completo dentro de los linfocitos T para la inducción de la LVG y, por lo tanto, la MC en este subconjunto celular puede estar relacionada con un mayor riesgo de recaída, especialmente de neoplasias malignas de crecimiento rápido y agresivo.2,19 Las pruebas de quimerismo de subconjuntos celulares requieren una clasificación engorrosa y lenta de células con el potencial teórico de perder algunas células durante ese proceso. Como se explica en el apéndice, la preparación de diapositivas para el análisis Duet™ no causa pérdida ni reducción de ninguna población celular. El sistema Duet™ utiliza el portaobjetos teñido con MGG para localizar linfocitos y otros subconjuntos celulares y también puede utilizar tinciones inmunocitoquímicas (como anticuerpos monoclonales anti-CD3) para localizar estas células. En una segunda fase, se pueden aplicar PECES para pruebas de quimerismo en trasplantes que no coinciden con el sexo. La presentación del caso del paciente 3 muestra cómo se utilizó el sistema para seguir el quimerismo en un paciente después de un trasplante no mieloablativo y cómo la conversión a quimerismo completo después de la retirada de la ciclosporina predijo la aparición de respuestas de EICH y TVG.
Este informe se centra en el uso de Duet™ después de un trasplante de médula ósea, sin embargo, puede haber muchas otras implicaciones. El sistema también puede ayudar a estudiar las células y los linajes que albergan un marcador citogenético o inmunofenotípico único, como la fusión BCR / ABL (como se observa en el paciente 1) y correlacionar su morfología con el riesgo de recaída después de la quimioterapia estándar. Puede ayudar a revelar la naturaleza de la ERM en diferentes neoplasias malignas y por qué la detección de ERM no siempre es predictiva de recaída. En ciertos entornos, se pueden buscar poblaciones de células de donantes pequeños o microquimerismo. Por ejemplo, el microquimerismo linfohematopoyético sistémico detectado después de un trasplante de órganos sólidos puede predecir la tolerancia al órgano trasplantado y dirigir la terapia inmunosupresora.21 Los aloinjertos de sangre de cordón umbilical que contaminan a una población materna pequeña también se pueden detectar de manera similar y pueden tener implicaciones en el riesgo de EICH después del trasplante.
En conclusión, al agregar análisis morfológicos de pequeñas poblaciones de células con marcadores malignos o asociados al receptor, el sistema Duet™ puede mejorar la precisión del quimerismo y las pruebas de ERM, y delinear su importancia clínica. Este sistema merece ser estudiado más a fondo en ensayos a gran escala.