Materiales y métodos
Después de recibir el consentimiento informado por escrito de las pacientes, se examinó la farmacocinética en estado estacionario de la clonidina administrada por vía oral en el plasma de 17 mujeres embarazadas que recibieron clonidina durante la mitad del embarazo (22-26 semanas de gestación) o al final del embarazo (34-38 semanas de gestación). Seis de estas mujeres participaron en la recolección de muestras de plasma materno y de cordón umbilical (arterial y venoso) en el momento del parto para medir las concentraciones de clonidina. La edad gestacional se basó en el último período menstrual o en la datación temprana por ultrasonido.
Selección de asignaturas. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión de Investigaciones de la Universidad de Washington. Los sujetos fueron elegibles para participar si estaban embarazadas, 18 años de edad, tenían un hematocrito ≥28% y estaban recibiendo clonidina oral para la hipertensión materna.
Pauta posológica. El tratamiento con clonidina oral no se alteró para los fines del estudio. Las dosis oscilaron entre 0,15 y 0,30 mg al día, administrados en dosis divididas. La duración del estudio farmacocinético fue dependiente del intervalo de dosis del sujeto, que varió de 6 a 12 h. Durante 3 días antes del estudio, se proporcionaron comprimidos orales de clonidina, del mismo lote de fabricación. Los sujetos registraron la hora de cada dosis en un calendario de estudio. Los sujetos tomaron su dosis de clonidina por la mañana dentro de los 30 minutos de las 8: 00 AM. Las dosis posteriores se tomaron dentro de los 30 minutos de los tiempos de administración programados. En la mañana del estudio farmacocinético, se pidió a los sujetos que ayunaran, a excepción de los líquidos transparentes, durante 5 horas antes de la administración de clonidina hasta 1 hora después de la administración.
Colección de muestras. Las muestras de plasma en serie se recogieron en los siguientes momentos: 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, y 12 h postdosificación, o truncado para corresponder al intervalo de dosificación del sujeto. Se recogió orina durante un intervalo de dosificación para determinar el aclaramiento renal de clonidina y el aclaramiento de creatinina. Se recogieron muestras de plasma, de cordón materno y umbilical (arterial y venoso), en el momento del parto para cuantificar las concentraciones de clonidina. Todas las muestras se almacenaron a -80°C hasta el análisis de la muestra.
Concentraciones de clonidina. Las concentraciones plasmáticas de clonidina se cuantificaron mediante un ensayo validado de cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS). En resumen, se mezclaron 250 µl de muestras de plasma con 500 pg de patrón interno (clonidina-d4) en 500 µl de carbonato de sodio (0,1 M) (pH = 9,3) y 3 ml de heptano/alcohol isoamílico (98,5:1,5). Los estándares se prepararon mediante la adición de plasma en blanco con 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 250, 375, 500, y 750 pg de clonidina. Las muestras se agitaron en un agitador horizontal durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación (1500g durante 10 min), las muestras se congelaron en hielo seco y la capa orgánica se decantó a un tubo de cultivo limpio. Se añadieron dos mililitros de alícuotas de ácido sulfúrico (0,05 M) a la capa orgánica y se agitaron nuevamente durante 15 minutos. Después de la centrifugación (1500g durante 10 min), las muestras se congelaron en hielo seco y la capa orgánica se desechó. Una alícuota de 200 µl de 29.se añadió hidróxido de amonio acuoso al 29% a la capa acuosa junto con 3 ml de heptano/alcohol isoamílico (98.5: 1.5) y se agitó durante 15 min. Después de la centrifugación (1500g durante 10 min), las muestras se congelaron en hielo seco y la capa orgánica se decantó a un tubo de cultivo limpio. La capa orgánica se evaporó bajo una corriente de nitrógeno a 40°C. El residuo se reconstituyó con 75 µl de ácido fórmico (12 mm)/metanol (60:40), de los cuales 10 µl se inyectaron en el sistema LC/MS.
Se mezclaron muestras de orina de 250 µl con 250 µl de ácido fórmico (12 mm) y 50 ng de patrón interno (clonidina-d4). Los estándares se prepararon mediante la adición de orina en blanco con 0, 1.25, 2.5, 6.25, 12.5, 18.75, y 25 ng de clonidina, respectivamente. Las muestras se vorticaron y se inyectó 1 µl en el LC/MS.
El sistema LC/MS era un Agilent 1100 MSD (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) que consistía en bomba binaria, muestreador automático, compartimiento de columna y espectrómetro de masas. La columna de cromatografía líquida de alto rendimiento era un polar Phenomenex Synergi RP80A, 250 mm × 2.0 mm, 4 µm (Phenomenex, Torrance, CA). La columna se mantuvo a 40°C. Los componentes de la fase móvil eran ácido fórmico (A) de 12 mm y metanol (B), con un caudal inicial de 0,25 ml/min. La fase móvil inicial se mantuvo durante 1 min y consistió en un 40% de B para muestras de plasma y un 35% de B para muestras de orina. El porcentaje de B se incrementó linealmente durante los siguientes 4 minutos hasta el 90% para el plasma y el 60% para la orina, y luego se mantuvo constante durante 1 minuto con un aumento de flujo lineal a 0,3 ml/min para la orina y el plasma. Para el gradiente de retorno, el porcentaje de B se redujo linealmente durante 1 minuto a 40% (plasma) o 35% (orina), que luego se mantuvo constante. El caudal se mantuvo en 0,3 ml/min durante 1 minuto y luego disminuyó linealmente durante 1 minuto a 0,25 ml/min y luego se mantuvo constante. El tiempo total de ejecución fue de 12,5 minutos. Para los ensayos de plasma y orina, el espectrómetro de masas se operó en el modo de electrospray positivo y se configuró para la monitorización selectiva de iones de m/z 230 (clonidina) y m/z 236 (clonidina-d4) con un tiempo de permanencia de 289 mseg para cada ion.
Parámetros Farmacocinéticos. Los parámetros farmacocinéticos en estado estacionario se determinaron utilizando técnicas estándar no compartimentales. El área bajo la curva concentración-tiempo de clonidina en plasma durante un intervalo de dosificación (AUCt) se calculó utilizando la regla trapezoidal lineal. El aclaramiento oral aparente (CL / F) se calculó mediante CL/F = Dosis/AUCt. El aclaramiento renal de clonidina (CLrenal) se calculó mediante CLrenal = Ae,τ/AUCt, donde Ae,τ = la cantidad de clonidina excretada inalterada en la orina durante un intervalo de dosificación. El aclaramiento de creatinina se calculó por CrCl = (VolumeUrina × CreatinineUrina) / (CreatinineSérum× τ). El aclaramiento renal de clonidina ajustado para la tasa de filtración glomerular (TFG) se calculó mediante CLrenal ajustado para TFG = CLrenal – fu × CrCl, donde se supuso que la fracción no unida en plasma (fu) era de 0,80 (Hulter et al., 1979). En todos nuestros sujetos, el intervalo de dosificación relativamente corto no permitió estimar con precisión la semivida de la clonidina, que previamente se había notificado que era de 11,1 ± 3,3 y 10,8 ± 2,2 h en adultos sanos no embarazadas (Cunningham et al., 1994; Fujimura et al., 1994).
Estadísticas. Nuestros parámetros farmacocinéticos de clonidina en el embarazo se compararon con parámetros publicados previamente en voluntarios sanos no embarazadas (CL/F, Porchet et al., 1992; Cunningham et al., 1994) (CLrenal, Fujimura et al., 1994). Se utilizó regresión lineal para determinar la correlación entre el aclaramiento de creatinina y el aclaramiento renal de clonidina. Se utilizó la prueba t de Student no emparejada para comparar los grupos de embarazadas y no embarazadas. Un valor de p <0,05 fue considerado significativo. Todos los resultados se reportan como media ± D. S.