Discusión
Los gusanos adultos de C. sinensis que se incubaron en caldo produjeron más de 4.000 huevos/gusano/día al principio. A partir de entonces, los recuentos de huevos disminuyeron a poco más de 1,000 en el día 7, y a 300-400 a los 14 días. Los recuentos fueron inferiores a 100 a los 28 días en los medios de caldo. Los conteos fueron similares entre sí entre 3 medios de caldo. Al contrario de esto, los conteos en el soultion de Locke fueron de 220±44 y 1023±64 en el día 1 y 3, respectivamente. Estos recuentos fueron más bajos que los de los medios de caldo al principio, pero los gusanos produjeron más huevos al día 21 y después. Los gusanos en el caldo producían sus huevos más vigorosamente en la fase inicial de incubación, mientras que los de la solución de Locke producían menos huevos al día, pero durante un período más largo. El recuento diario de huevos de 4.000 por un gusano adulto era compatible con el número medio estimado de 3.770 huevos de un ser humano infectado .
Sobre la base de los recuentos de huevos, el total de huevos producidos por un gusano adulto incubado, que se recuperó de conejos después de 8 semanas de infección, se estimó en 37.274±2.988 en promedio. Estos recuentos totales de huevos fueron similares, independientemente de la solución o el medio de cultivo. Los recuentos diarios de óvulos disminuyeron rápidamente y el útero se vació durante el cultivo. Por lo tanto, los actuales recuentos diarios de huevos representaban que los gusanos cultivados in vitro producían solo los huevos intrauterinos que se preformaron en su útero mientras vivían en conejos antes del cultivo. Con base en los datos, se estima que una C. sinensis grávida contiene alrededor de 37.000 huevos en su útero y produce alrededor de 4.000 huevos al día. En consecuencia, los óvulos pueden permanecer en el útero alrededor de 10 días para la maduración intrauterina. La mayoría de los óvulos en el útero se encontraron maduros y el miracidio ya se desarrolló, pero algunos de ellos eran inmaduros, principalmente en el útero proximal. Esos huevos inmaduros no se desarrollaron aún más durante el cultivo. Estos hallazgos sugieren que los gusanos cultivados no pueden formular nuevos huevos viables y la maduración de huevos preformados inmaduros también es imposible mediante el cultivo in vitro.
Los huevos de C. sinensis tienen un tamaño de 28-31×13-16 µm, con un opérculo en su extremo cónico y un pequeño botón abopercular . En el presente estudio, los huevos expulsados mostraron un contorno anormal a medida que el gusano sobrevivió más tiempo. La longitud media del huevo se redujo gradual y significativamente en la solución de Locke (27,49±0,48 µm) y en todos los medios de caldo. La reducción de longitud resultó en una reducción del valor FMI. Se propuso el FMI como parámetro de análisis biométrico para aproximar el volumen de huevos de las aletas heterófilas y opistorquíidas . En la presente investigación, los valores de FMI disminuyeron en el día 60 en la solución de Locke y en el día 90 en medios de caldo. Los valores de FMI disminuidos sugieren una reducción del volumen del huevo por contracción de la longitud y degeneración del contenido. La mayoría de los huevos producidos después de 60 días de cultivo in vitro se deformaron, y su relación longitud/anchura fue inferior a 1,7 y el valor FMI fue inferior a 7.000. La mayoría de esos huevos se determinó que no eran viables cuando se teñían con azul tripano. El cultivo durante 60 días podría ser el período máximo de viabilidad de los huevos.
La observación microscópica clara reveló la acumulación de vacuolas y masas oscuras dentro de la cáscara de huevo, ya que el cultivo duró más de 60 días. Las vacuolas y las masas oscuras parecían ser células vitelinas deformes como se muestra en O. viverrini . Esos materiales en los huevos sugerían que las células de vitelina u otros materiales formadores de huevos estaban degenerados y los huevos eran abortivos. Los huevos maduros que forman el miracidio pueden sobrevivir mucho tiempo, pero los abortados no. La degeneración de los materiales internos podría haber inducido deformidad y reducción del volumen de los óvulos. Un estudio encontró huevos deformados en adultos maduros con Equinostoma caproni almacenados en la solución de Locke hasta 4 meses a 4 ° C. Una posible explicación para los cambios anteriores puede ser un curtido inadecuado de quinona que está asociado con el proceso de formación de la cáscara de huevo . El cultivo in vitro a largo plazo puede haber afectado a este proceso enzimático mediado por fenol-oxidasa, lo que resulta en una cáscara de huevo deformada . Por lo tanto, el cultivo in vitro prolongado de C. sinensis puede deformar los huevos, así como su viabilidad.
Los huevos maduros de C. sinensis contienen una perilla abopercular muy discreta. O. viverrini, una platija hepática estrechamente relacionada, también muestra una perilla abopercular muy pequeña o ligeramente desarrollada de los huevos . En el presente estudio, la perilla abopercular de la cáscara del huevo se hizo más prominente en la mayoría de los huevos después de 60 días de incubación. La aparición de una perilla abopercular tan prominente era obvia en la mayoría de los huevos degenerados. Krejci y Fried demostraron que en el caso de Echinostoma caproni y E. trivolvis, respectivamente, la perilla abopercular puede estar poco profunda o profundamente incrustada en la cáscara del huevo. En el presente estudio no se observó el moldeado de la perilla abopercular que rodea la concha. La perilla abopercular prominente puede ser una extensión de la perilla discreta normal existente en respuesta a la fisiología cambiante de los gusanos moribundos. En conjunto, es difícil para los gusanos producir huevos viables normales mediante cultivo in vitro.
La estructura superficial de los huevos, observada por SEM, parecía ser una característica morfológica adecuada para comprender el estado de la cáscara del huevo. Entre los opistórquidos, la superficie del huevo de C. sinensis está extremadamente esculpida para crear arrugas entrelazadas de diferente altura, lo que ayuda a acumular fibras acuáticas naturales y a aumentar la posibilidad de contacto con huéspedes moluscos . En el presente estudio, se observó una disminución de la arruga superficial por SEM de los óvulos abortados. Esta disminución de las arrugas con el botón abopercular prominente puede ser el resultado de un proceso de degeneración de la cáscara de huevo.
El presente estudio tuvo algunas limitaciones. No hubo datos directos de viabilidad de óvulos para comparar con cambios morfológicos. La eclosión in vitro de los huevos puede proporcionar información precisa sobre la viabilidad de los huevos, pero la de los huevos de C. sinensis sigue siendo incapaz. También los datos de morfología y fisiología de los gusanos incubados fueron limitados.
En conclusión, la C cultivada. los gusanos sinensis en medios de caldo pasan huevos viables durante 60 días que se preforman en su útero durante su supervivencia en conejos. Los huevos inmaduros preformados no pueden desarrollar miracidio mediante cultivo in vitro. Un adulto maduro de C. sinensis contiene unos 37.000 huevos en el útero y produce unos 4.000 huevos al día. Los huevos deformados con un valor FMI inferior a 7.000 y una relación longitud / anchura inferior a 1,7 no son viables.