Hasta ahora, en nuestra serie 101 de plásmidos, nos hemos abierto camino a través del mapa de plásmidos: resistencia a los antibióticos, origen de la replicación, etc. Hasta este punto podemos replicar nuestro plásmido y asegurarnos de que las células lo mantengan; el siguiente paso es conseguir que el plásmido exprese nuestro gen de interés. Introduce el promotor element el elemento responsable de iniciar la transcripción de tu inserto en ARN.
En la práctica, el término «promotor» describe la combinación del promotor (sitio de unión a la ARN polimerasa) y operadores (elementos de respuesta). Los promotores tienen entre 100 y 1000 pares de bases de largo y se encuentran aguas arriba de sus genes diana. La secuencia de la región promotora controla la unión de la ARN polimerasa y los factores de transcripción, por lo tanto, los promotores desempeñan un papel importante en la determinación de dónde y cuándo se expresará el gen de interés.
La(s) ARN polimerasa (s)
El ARN se transcribe a partir del ADN utilizando una ARN polimerasa (RNAP). En las bacterias, esto se hace por una sola enzima; sin embargo, los eucariotas tienen polimerasas múltiples que son responsables de un subconjunto específico de ARN. Para obtener esta especificidad, el RNAP eucariótico puede reconocer y unirse a elementos promotores específicos. Esto significa que el promotor presente en la columna vertebral del plásmido debe ser compatible con el tipo de ARN que se necesita fabricar: si desea ARNm (para la expresión génica), necesita usar un promotor RNAP II, mientras que los ARN pequeños (como el ARN) se transcriben de los promotores RNAP III. Este post presenta promotores para la transcripción general de RNAP II y RNAP III; sin embargo, el uso de LTR virales como promotores de RNAP II se emplea comúnmente en construcciones lentivirales y retrovirales y discutiremos estos en un futuro post sobre partes de vectores virales.
Especificidad del promotor
Además de elegir un promotor basado en el tipo de transcripción de ARN, también deberá asegurarse de que su plásmido tenga un promotor adecuado para trabajar en su organismo huésped. Debido a que la maquinaria de transcripción difiere entre tipos de células u organismos, los promotores deben ser variables de manera similar. Los promotores bacterianos solo funcionan en células procariotas y, por lo general, solo en la misma especie o en especies estrechamente relacionadas de las que se derivaron. Del mismo modo, los diversos tipos de células eucariotas (mamíferos, levaduras, plantas, etc.) requieren promotores únicos y hay muy poco cruce. En términos generales, los promotores de las bacterias son menos diversos y complejos, y tienen menos partes que las de las células eucariotas. Algunos promotores son constitutivamente activos y en todo el tiempo, mientras que otros son controlados con más cuidado. Los promotores regulados pueden actuar solo en ciertos tejidos o en ciertos momentos de desarrollo, o puede haber formas de encenderlos o apagarlos a voluntad con una sustancia química, calor o luz. En la célula, los promotores mismos están controlados por otros factores reguladores: potenciadores, elementos de contorno, aislantes y silenciadores; sin embargo, puede ocurrir cierta «filtración» de la transcripción. Esto normalmente no es un gran problema para las células, pero puede confundir los resultados de la investigación o incluso matar las células si el gen de interés es tóxico. Para combatir esto, los científicos han creado promotores sintéticos, que típicamente incluyen alguna combinación de otros elementos promotores, y tienden a estar más regulados.
Promotores comunes para eucariotas y procariotas
Hemos incluido dos tablas de referencia a continuación que enumeran algunos de los promotores bacterianos y de mamíferos más comunes. Estas listas no son exhaustivas, pero deberían ser un buen lugar para comenzar cuando intentes elegir a tu promotor perfecto.
Promotores Eucariotas
| Promotor | utiliza Principalmente para | transcripción de ARN | Descripción | Expresión | consideraciones Adicionales |
| CMV | expresión General | arnm | Fuerte expresión de mamíferos promotor del citomegalovirus humano | Constitutiva | Puede contener un potenciador de la región. Se puede silenciar en algunos tipos de células. |
| EF1a | Expresión general | ARNm | La fuerte expresión de los mamíferos a partir del factor de elongación humano 1 alfa | Constitutivo | Tiende a dar una expresión consistente independientemente del tipo de célula o fisiología. |
| SV40 | Expresión general | ARNm | Promotor de expresión de mamíferos del virus vacuolador de simios 40 | Constitutivo | Puede incluir un potenciador. |
| PGK1 (humano o ratón) | Expresión general | ARNm | Promotor mamífero del gen de la fosfoglicerato quinasa. | Expresión generalizada constitutiva | , pero puede variar según el tipo de célula. Tiende a resistir la regulación descendente del promotor debido a la metilación o desacetilación. |
| Ubc | Expresión general | ARNm | Promotor mamífero del gen humano ubiquitina C | Constitutivo | Como su nombre indica, este promotor es ubicuo. |
| humanos beta actina | expresión General | arnm | Mamíferos promotor de la beta actina gen | Constitutiva | Omnipresente. La versión de pollo se usa comúnmente en híbridos promotores. |
| CAG | Expresión general | ARNm | Promotor híbrido fuerte de mamíferos | Constitutivo | Contiene potenciador de CMV, promotor de actina beta de pollo y aceptor de empalme de globina beta de conejo. |
| TRE | Expresión general | ARNm | Promotor del elemento de respuesta de tetraciclina | Inducible con tetracilina o sus derivados. | Normalmente contiene un promotor mínimo con baja actividad basal y varios operadores de tetraciclinas. La transcripción se puede activar o desactivar dependiendo del transactivador tet que se utilice. |
| UAS | Expresión general | ARNm | Promotor de Drosophila para unir sitios de unión de Gal4 | Específico | Requiere la presencia del gen Gal4 para activar el promotor. |
| Ac5 | Expresión general | ARNm | Promotor fuerte de insectos del gen 5c de la actina de Drosophila | Constitutivo | Comúnmente utilizado en sistemas de expresión para Drosophila. |
| Polihedrina | expresión General | arnm | insectos Fuerte promotor de baculovirus | Constitutiva | Comúnmente utilizados en sistemas de expresión de células de insecto. |
| CaMKIIa | Expresión génica para optogenética | ARNm | Promotor de la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina | Específico | Utilizado para la expresión neuronal/SNC. Modulada por calcio y calmodulina. |
| GAL1, 10 | Expresión general | ARNm | Promotores adyacentes de levadura, transcritos divergentemente | Inducibles con galactosa; represibles con glucosa | Se pueden usar de forma independiente o en conjunto. Regulado por GAL4 y GAL 80. |
| TEF1 | Expresión general | ARNm | Promotor del factor de elongación de transcripción de levadura | Constitutivo | Análogo al promotor EF1a de mamíferos. |
| GDS | Expresión general | ARNm | Promotor de expresión de levadura fuerte de gliceraldehído 3-fosfago deshidrogenasa | Constitutivo | Muy fuerte, también llamado TDH3 o GAPDH. |
| ADH1 | Expresión general | ARNm | Promotor de levadura para alcohol deshidrogenasa I | Reprimido por etanol | La versión de longitud completa es fuerte con alta expresión. Los promotores truncados son constitutivos con expresión más baja. |
| CaMV35S | Expresión general | ARNm | Promotor vegetal fuerte del Virus del Mosaico de la Coliflor | Constitutivo | Activo en dicots, menos activo en monocots, con cierta actividad en células animales. |
| Ubi | Expresión general | ARNm | Promotor vegetal del gen ubiquitina de maíz | Constitutivo | Da una alta expresión en las plantas. |
| H1 | expresión de ARN pequeño | ARN shRNA | Del promotor de ARN de la polimerasa III humana | Constitutivo | Puede tener una expresión ligeramente inferior a U6. Puede tener una mejor expresión en las células neuronales. |
| U6 | expresión de ARN pequeño | shRNA | Del promotor nuclear pequeño U6 humano | Constitutivo | También se utiliza U6 murino, pero puede ser menos eficiente. |
Promotores procarióticos
| Promotor | Se utiliza principalmente para | Descripción | Expresión | Consideraciones adicionales |
| T7 | transcripción/ expresión general in vitro | Promotor del bacteriófago T7 | Constitutivo, pero requiere ARN polimerasa T7. | Cuando se utiliza para la transcripción in vitro, el promotor impulsa la transcripción sensorial O antisentido dependiendo de su orientación hacia el gen. |
| T7lac | Altos niveles de expresión génica | Promotor del bacteriófago T7 más operadores de lac | Expresión basal insignificante cuando no se indujo. Requiere ARN polimerasa T7, que también es controlada por el operador lac. Puede ser inducido por IPTG. | Se encuentra comúnmente en vectores pET. Muy estrictamente regulado por los operadores de lac. Bueno para modular la expresión génica a través de concentraciones de inductores variadas. |
| Sp6 | transcripción/ expresión general in vitro | Promotor del bacteriófago Sp6 | Constitutivo, pero requiere ARN polimerasa SP6. | SP6 polimerasa tiene una alta procesividad. Cuando se utiliza para la transcripción in vitro, el promotor impulsa la transcripción sensorial O antisentido dependiendo de su orientación hacia el gen. |
| araBAD | Expresión general | Promotor del operón metabólico arabinosa | Inducible por arabinosa y represión de catabolitos reprimidos en presencia de glucosa o por unión competitiva de la fucosa anti-inductora | Más débil. Se encuentra comúnmente en vectores pBAD. Es bueno para una regulación rápida y una expresión basal baja; sin embargo, no es adecuado para modular la expresión génica a través de concentraciones de inductores variadas. |
| trp | Altos niveles de expresión génica | Promotor de E. el triptófano coli operon | Represible | se apaga con altos niveles de triptófano celular. |
| lac | expresión General | Promotor del operón lac | Constitutiva en la ausencia de represor lac (lacI o lacIq). Puede ser inducida por IPTG o lactosa. | Promotor con fugas con expresión algo débil. La mutación lacIq aumenta la expresión del represor 10x, ajustando así la regulación del promotor de lac. Bueno para modular la expresión génica a través de concentraciones de inductores variadas. |
| Ptac | expresión General | promotor Híbrido de alc y del prt | Regulado como el promotor lac | Contiene -35 región de trpB y -10 región de alc. Regulación muy estricta. Bueno para modular la expresión génica a través de concentraciones de inductores variadas. Generalmente mejor expresión que lac sola. |
| pL | Los altos niveles de expresión génica | El promotor del bacteriófago lambda | Puede regular la temperatura | A menudo emparejado con el represor cI857 sensible a la temperatura. |
| T3 | transcripción/expresión general in vitro | Promotor del bacteriófago T3 | Constitutivo, pero requiere ARN polimerasa T3 | Cuando se usa para la transcripción in vitro, el promotor impulsa la transcripción sensorial O antisentido dependiendo de su orientación al gen |
Aunque esta lista es un excelente lugar para comenzar, las tablas anteriores no profundizan en los promotores de tejidos o de desarrollo específicos disponibles para los científicos. A menudo, los plásmidos se utilizan para fines terapéuticos, y en esos casos es importante identificar los promotores específicos de los tejidos adecuados, como describen los investigadores de los NIH aquí.
Nota: A. Max Juchheim contribuyó a la redacción de este artículo.