Mutación única en una región altamente conservada de cloranfenicol acetiltransferasa permite la producción de acetato de isobutilo directamente a partir de celulosa por Clostridium thermocellum a temperaturas elevadas

Cepas bacterianas y plásmidos

los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 2. La cepa de Clostridium thermocellum DSM1313 h hpt (M1354) se utilizó como huésped para la producción de ésteres a temperaturas elevadas. Cabe señalar que la eliminación del gen de la hipoxantina fosforribosiltransferasa (hpt, Clo1313_2927) en el DSM1313 de tipo salvaje permite la ingeniería genética mediante la selección de contador de 8-azahipoxantina (8-AZH); esta eliminación no tiene ningún efecto adverso conocido sobre el crecimiento y el metabolismo celular . El plásmido pNW33N, que contiene CATSa, es termoestable y se utilizó para expresar varios gatos en C. thermocellum. Los plásmidos pET se utilizaron para la clonación molecular y la expresión enzimática en E. coli.

Productos químicos y reactivos

Todos los productos químicos se compraron a Sigma-Aldrich (MO, EE.UU.) y / o Thermo Fisher Scientific (MA, EE.UU.), a menos que se especifique en otra parte. Para la clonación molecular, se obtuvieron enzimas de restricción y ligasa T4 de New England Biolabs (MA, EE. UU.). La polimerasa de ADN de arranque en caliente de Phusion II se utilizó para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Medios y cultivo

Para la clonación molecular y la expresión de proteínas, las cepas de E. coli se cultivaron en caldo de lisogenia (LB) que contenía antibióticos apropiados, a menos que se indique lo contrario. Para la caracterización in vivo de CATSa en E. coli, se utilizó medio híbrido M9 con 20 g/L de glucosa. Para el cultivo de C. thermocellum, se utilizó el medio mínimo MTC o el medio CTFuD-NY, según se especificó en los experimentos. La densidad óptica (DO) se midió mediante un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, EE.UU.).

Análisis de alineación de secuencias múltiples

El análisis de alineación de secuencias múltiples (MSA) se realizó utilizando MEGA7 . Las secuencias de proteínas fueron alineadas por ClustalW y visualizadas por Espcript 3.0 (http://espript.ibcp.fr). Las características clave en las estructuras proteicas de 3U9F, 4CLA y 2XAT se extrajeron de CAT_SALTI, CAT3_ECOLIX y CAT4_PSEAE, respectivamente.

Modelado molecular y simulaciones de acoplamiento

Estructuras tridimensionales (3D)

La estructura 3D de CATSa y alcoholes de interés se generó por primera vez utilizando las herramientas Swiss-Model y ‘Builder’ de MOE (Software de Entorno Operativo Molecular, versión 2019.01), respectivamente. La estructura 3D del complejo CATSA delimitado por sustrato dual (es decir, acetil-CoA-isobutanol–CATSa) se obtuvo extrayendo un isobutanol del complejo isobutanol–CATSa y luego agregándolo al complejo acetil–CoA-CATSa. Todas las estructuras fueron preparadas por la herramienta’ QuickPrep ‘ de MOE con parámetros predeterminados y optimizadas aún más por la minimización de energía con el campo de fuerza Amber10:EHT.

Simulación de acoplamiento

Para realizar simulaciones de acoplamiento, se buscó el bolsillo de enlace potencial utilizando la herramienta’ Site Finder ‘ de MOE. Se seleccionó el sitio con mejor puntuación, consistente con los sitios catalíticos reportados , para estudios adicionales. Las simulaciones de acoplamiento se realizaron como se describió anteriormente . Brevemente, acetil-CoA y cada alcohol se acoplaron utilizando el protocolo de ajuste inducido con el método de colocación de Triángulos y la función de puntuación ΔG de Londres. Después de las simulaciones de acoplamiento, se seleccionó la pose de unión mejor puntuada, que mostraba la interacción crucial entre el residuo y el sustrato en la desviación media cuadrada de la raíz (RMSD) < 2 Å. Como ejemplo, para el acoplamiento acetil-CoA, se eligió la pose de unión que muestra el enlace de hidrógeno entre el hidroxilo del Ser-148 y el N71 del CoA . Para el acoplamiento de alcohol, se seleccionó la pose de unión que muestra el enlace de hidrógeno entre el N3 de His-189 y el hidroxilo de alcohol .

Análisis de mutagénesis in silico

El análisis de mutagénesis In silico del complejo acetil-CoA–isobutanol–CATSa se llevó a cabo como se describió anteriormente . Específicamente, se utilizaron las herramientas de «exploración de alanina» y «exploración de residuos» de MOE para identificar los posibles candidatos a residuos para mutagénesis.

Clonación molecular

Construcción de plásmidos

Los plásmidos se construyeron mediante la técnica de clonación molecular estándar del método dependiente de ligasa y/o ensamblaje Gibson utilizando los cebadores enumerados en el archivo Adicional 1: Tabla S1. Los plásmidos construidos se introdujeron en E. coli TOP10 por transformación de choque térmico. Las colonias aisladas en una placa selectiva fueron cribadas por PCR y purificadas con plásmido. Los plásmidos purificados se verificaron mediante secuenciación de Sanger antes de transformarse en E. coli BL21 (DE3). La mutagénesis dirigida al sitio se realizó utilizando el protocolo de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange™ con longitud de superposición reducida o el método de ensamblaje Gibson . Para la ingeniería de C. thermocellum, el plásmido pHS005 se construyó primero y luego se modificó a pHS0024. pHS0024 no tiene hpt en la parte posterior del operón, mientras que otras secuencias del plásmido son idénticas a pHS005.

Transformación

Se utilizaron los métodos convencionales de transformación química y electroporación para la transformación de E. coli y C. thermocellum, respectivamente. Para C. thermocellum, el método, sin embargo, fue ligeramente modificado, como se describe aquí. Primero, C. thermocellum M1354 (Tabla 2) se cultivó en medio CTFuD-NY de 50 mL a 50 °C dentro de una cámara anaeróbica (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., OR, USA). El cultivo celular con DO en un rango de 0.8 – 1.0 se enfrió a temperatura ambiente durante 20 min. Más allá de este punto, todos los pasos se realizaron fuera de la cámara. Las celdas enfriadas se cosecharon a 6500 × g y 4 °C durante 20 min. Los pellets de células se lavaron dos veces con agua Mili-Q enfriada con hielo y se resuspendieron en 200 µL del tampón de transformación compuesto por sacarosa de 250 mm y glicerol al 10% (v/v). Varias alícuotas de 30 µL de las células electrocompetentes se almacenaron inmediatamente a − 80 °C para su uso posterior. Para la electroporación, las células electrocompetentes se descongelaron en hielo y se incubaron con 500-1000 ng de plásmidos metilados durante 10 min. Luego, las células se transfirieron a una cubeta de electroporación con espacio de 1 mm refrigerada por hielo (BTX Harvard Apparatus, MA, EE.UU.) seguida de dos pulsos de decaimiento exponencial consecutivos con 1.8 kV, 350 Ω y 25 µF. Los pulsos generalmente resultaron en una constante de tiempo de 7.0-8.0 ms. Las células se resuspendieron inmediatamente en CTFuD-NY fresco precalentado y se recuperaron a 50 ° C en condiciones anaeróbicas (90% N2, 5% H2 y 5% CO2) dentro de un tubo de bálsamo con tapa de goma. Después de 0-12 h de recuperación, las células se mezclaron con medio de agar CTFuD-NY fundido suplementado con 15 µg/ml de tianfenicol. Finalmente, la mezcla de células medias se vertió en una placa de petri y se solidificó dentro de la cámara anaeróbica. La placa se incubó a 50 ° C hasta 1 semana hasta que aparecieron las colonias. La eficiencia de transformación fue de 2 a 100 unidades formadoras de colonias por µg de plásmido (UFC/µg de plásmido).

Caracterización in vivo de CATSa y sus variantes en E. coli

Para la caracterización in vivo de CATSa y sus variantes en E. coli, se realizaron cultivos de alta densidad celular como se describió anteriormente con una adición de 2 g/L de varios alcoholes. Para la extracción in situ de ésteres, cada tubo se superpuso con hexadecano al 25% (v/v). Para confirmar la expresión proteica de CATSa y sus variantes, el 1% (v/v) de células madre se cultivaron durante la noche a 37 °C y 200 rpm en tubos de cultivo de 15 mL que contenían 5 mL de medio LB y antibiótico. Luego, el 4% (v/v) de los cultivos durante la noche se transfirieron a 1 ml de medio LB que contenía antibiótico en una microplaca de 24 pocillos. Los cultivos se cultivaron a 37 ° C y 350 rpm utilizando un agitador de microplacas de incubación (Fisher Scientific, PA, EE. UU.) hasta que la DO alcanzó 0,4–0,6 y luego fue inducida por 0.β-d-1-tiogalactopiranósido de isopropilo de 1 mM (IPTG) durante 4 h con una membrana de sellado que facilita la respiración para evitar la evaporación y la contaminación cruzada (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, EE. UU.). Las muestras de proteína se obtuvieron utilizando el reactivo completo B-PER (cat # 89822, Thermo Scientific, MA, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se analizaron por SDS-PAGE.

Caracterización enzimática

Purificación de His-tag

Para la expresión enzimática, se inoculó un cultivo nocturno con un 1:proporción de 50 en medio LB fresco que contiene 1 mM IPTG y antibiótico, seguido de incubación nocturna a 18 °C (hasta 20 h) en una incubadora agitadora a 200 rpm. Las células inducidas se recolectaron por centrifugación a 4 ° C y 4700 × g durante 10 min. El pellet celular se lavó una vez con agua milipora y se resuspendió en el reactivo B-PER completo. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la mezcla se centrifugó a 17.000×g durante 2 minutos. El sobrenadante se recogió y se designó como extracto crudo. Para la purificación de su etiqueta, el extracto crudo se incubó con agarosa superflow de HisPur Ni–NTA en un lote, como recomienda el fabricante. Luego, la resina se lavó con al menos tres volúmenes de tampón de lavado, que consistían en Tris–HCl de 50 mM (pH 8,0), NaCl de 300 mM, imidazol de 10 mM y EDTA de 0,1 mm. Las proteínas unidas a la resina se elutaron con un tampón de elución de 300 µL que contenía 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 50 mm de NaCl, 300 mM de imidazol y 0,1 mm de EDTA. La muestra eluida fue desalada y concentrada a través de una columna de filtro de Amicón con corte de peso molecular de 10 kDa. Finalmente, la muestra de proteína se suspendió en 200 µL de tampón Tris–HCl de 20 mM (pH 8,0). La concentración de proteínas se midió mediante el ensayo de Bradford con albúmina sérica bovina (ASC) como proteína de referencia.

Ensayo de desplazamiento térmico

Para medir la temperatura de fusión de proteínas (Tm), se empleó un ensayo de termofluor con SYPRO Orange . Se mezclaron entre 10 y 250 µg de proteína purificada His-tag con 5× SYPRO Naranja en un volumen final de 50 µL en una placa qPCR de 96 pocillos. La placa se selló con tapas de PCR antes de ejecutar el ensayo. Se utilizó la máquina de PCR en tiempo real StepOne (Applied Biosystems, CA, EE. UU.) para ejecutar el ensayo con los siguientes parámetros: reportero ROX, incremento de 1 °C por ciclo, retención de 1 minuto en cada ciclo y rango de temperatura de 20 a 98 °C. Los datos se recopilaron, exportaron y procesaron para calcular la Tm.

Ensayo de 5,5′-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB)

La velocidad de reacción de cada GATO se determinó mediante un ensayo de DTNB en una placa de 384 pocillos. El volumen total de reacción fue de 50 µL con el tampón de reacción compuesto de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Las concentraciones de acetil-CoA (Coala Biosciences, TX, EE. UU.) y alcoholes se variaron según lo especificado en cada experimento. Se utilizaron concentraciones finales de enzimas de 0,05 µg/mL y 10 µg/ml para las reacciones al cloranfenicol y a los alcoholes, respectivamente. La cinética de reacción se recogió midiendo la absorbancia a 412 nm cada minuto durante 1 h a 50 ° C en un lector de microplacas (lector de microplacas Synergy HTX, BioTek). La velocidad de reacción se calculó utilizando el coeficiente de extinción de una curva estándar de coenzima A libre (MP Biomedicals, OH, EE.UU.) bajo la misma condición. Cabe señalar que, dado que la temperatura máxima de funcionamiento recomendada para el lector de placas es de 50 °C, el ensayo enzimático de alto rendimiento para CAT a temperaturas elevadas solo se realizó para determinar los parámetros cinéticos enzimáticos.

Cálculo de parámetros cinéticos para velocidades de reacción

Los parámetros de la ley de velocidad de Michaelis–Menten (Ec. 1) se calcularon para cada enzima de la siguiente manera. En primer lugar, se realizó una regresión lineal en los datos recopilados de un lector de microplacas para identificar las tasas de reacción iniciales, \(y_{i}\), a diferentes concentraciones iniciales de sustrato, \(s_{i}\), donde i = {1,2,…, n} es el número de puntos de datos recopilados. Luego, estas tasas de reacción inicial y las concentraciones de sustrato iniciales asociadas para todas las réplicas se ajustaron simultáneamente al modelo de Michaelis–Menten (Ec. 1) usando regresión no lineal robusta (Ec. 2) con un estimador de pérdida suave-L1 (Ec. 3) como se implementa en la biblioteca de computación numérica SciPy v1. 2. 0 :

El problema de mínimos cuadrados determina los parámetros \(K_ {\text{M}}\) y \(v_ {\text{max}}\) minimizando la diferencia entre las tasas de reacción predichas del modelo\ (v_{i}\) y las tasas de reacción medidas\ (y_{i}\) (Ec. 2). Se utiliza una función de suavizado \(\rho \ left (z \right)\) para hacer que el problema de mínimos cuadrados sea resistente a valores atípicos (Ec. 3). Debido a la resistencia imparcial a los valores atípicos y a la evitación de errores resultantes de los métodos de linealización convencionales, la regresión no lineal robusta proporciona la estimación de parámetros más precisa para el modelo de Michaelis-Menten .

Producción de acetato de isobutilo en C. thermocellum

Fermentación de celobiosa

La producción de acetato de isobutilo a partir de celobiosa en cepas de C. thermocellum se realizó mediante la configuración de bioconversión en dos etapas. Las células se cultivaron primero en un medio MTC mínimo que contenía 5 g/L de celobiosa en un tubo de bálsamo con tapa de goma hasta que la DO alcanzó 0,8–1.0. Las celdas se enfriaron a temperatura ambiente durante 20 min y se centrifugaron a 4700 × g y 4 °C durante 20 min. Después de retirar el sobrenadante, las células se resuspendieron en el mismo volumen de medio mínimo MTC fresco que contenía 2 g/L de isobutanol en una cámara anaeróbica. A continuación, la suspensión celular se dividió en 800 µL en un tubo de microcentrífuga de tapón de rosca de 2,0 mL con una capa de hexadecano de 200 µL. Las células se incubaron a 55 °C durante 24 h, seguido de un análisis de cromatografía de gases junto con un espectrómetro de masas (GC/MS) para cuantificar la cantidad de acetato de isobutilo producido.

Fermentación de celulosa

Para la fermentación de celulosa se utilizó un medio MTC modificado (medio C-MTC). Se utilizaron 20 g/L de Avicel PH-101 como única fuente de carbono en lugar de celobiosa, y se agregaron 10 g/L de trapeadores para aumentar la capacidad de amortiguación. El pH inicial se ajustó a 7,5 por 5 M de KOH y se esterilizó en autoclave. En una cámara anaeróbica, se inocularon 0,8 ml de cultivo celular nocturno en 15,2 ml de medio C-MTC (relación de inoculación 1:20) con 4 ml de hexadecano superpuesto. Cada tubo contenía una pequeña barra agitadora magnética para homogeneizar la celulosa. El tubo de bálsamo con tapa de goma se incubó en un baño de agua conectado con un controlador de temperatura a 55 ° C y un sistema de agitación magnética. Tras ajustar el pH con una inyección de KOH de 70 µL de 5 M, se tomaron muestras de 800 µL de cultivo celular y 200 µL de capa de hexadecano cada 12 h.El pH del cultivo se mantuvo en un intervalo de 6,4 a 7,8 durante la fermentación.

El crecimiento celular se monitorizó midiendo la proteína en pellets. El pellet de celulosa celular de 800 µL de volúmenes de muestreo se lavó dos veces con agua Mili-Q y se suspendió con un tampón de lisis de 200 µL (0.2 M de NaOH, 1% de SDS) seguido de una hora de incubación a temperatura ambiente. Luego, la solución se neutralizó con 50 µL 0,8 M de HCl y se diluyó con 550 µL de agua. La mezcla se centrifugó a 17.000 × g durante 3 min. La concentración de proteínas del sobrenadante se analizó mediante el ensayo Bradford compatible con detergente (Thermo Scientific, WA, EE. UU.). El pellet residual se hervió en un horno a 98 °C durante una hora antes de cuantificar la celulosa residual.

La celulosa residual se cuantificó por el método de ácido fenol–sulfúrico con algunas modificaciones. La muestra hervida se lavó dos veces con agua Mili-Q y se suspendió en agua de 800 µL para obtener un volumen equivalente al original. La muestra fue homogeneizada por pipeteo y vórtice durante 10 s, y 20 µL de la muestra homogeneizada se transfirieron a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2,0 mL o placa de 96 pocillos y se secaron durante la noche en un horno de 55 °C. El pellet seco se suspendió en 200 µL de ácido sulfúrico al 95% y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de disolver completamente el gránulo, se añadieron 20 µL de fenol al 5% y se mezclaron con la solución de ácido sulfúrico. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, se transfirieron 100 µL de la muestra a una nueva placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 490 nm. La absorbancia se convirtió en concentración de celulosa mediante la curva estándar de Avicel PH-101 tratada con el mismo procedimiento.

Métodos analíticos

Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

Los metabolitos extracelulares se cuantificaron utilizando un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Shimadzu Inc., MD, USA). Se centrifugaron 800 µL de muestras de cultivo a 17.000×g durante 3 min, y luego, los sobrenadantes se filtraron a través de filtros de 0,2 µm y se ejecutaron con una fase móvil de 10 mN H2SO4 a 0,6 ml / min en un Aminex HPX-87H (Biorad Inc., CA, USA) a 50 °C. Se utilizaron el detector de índice de refracción (RID) y el detector ultravioleta (UVD) a 220 nm para monitorear las concentraciones de azúcares, ácidos orgánicos y alcoholes.

Cromatografía de gases junto con espectroscopia de masas (GC/MS)

Los ésteres se midieron mediante GC (HP 6890, Agilent, CA, EE.UU.) equipado con un MS (HP 5973, Agilent, CA, EE. UU.). Para el sistema GC, se utilizó la columna capilar Zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, USA) (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) para separar los analitos, y se utilizó helio como portador con un caudal de 0,5 ml/min. El programa de temperatura del horno se ajustó de la siguiente manera: temperatura inicial de 50 °C, rampa de 1 °C/min hasta 58 °C, rampa de 25 °C/min hasta 235 °C, rampa de 50 °C/min hasta 300 °C y cocción de 2 minutos a 300 °C. Se inyectó 1 µL de capa de hexadecano muestreada en la columna en el modo sin división con una temperatura del inyector de 280 °C. Para el sistema MS, se utilizó el modo de iones seleccionado (SIM) para detectar y cuantificar ésteres con los siguientes parámetros: i) acetato de etilo, m/z 45,00 y 61,00 de 4,2 a 4,6 min de tiempo de retención (RT), ii) acetato de isopropilo, m/z 45 y 102 de 4,7 a 5,0 min de RT, iii) acetato de propilo, m/z 59 y 73 de 5,2 a 5,8 min de RT, iv) isobutirato de etilo, m/z 73 y 116 de 6,1 a 6,6 min RT, acetato de (v) isobutilo, m/z 61 y 101 de 6,6 a 7,6 min RT, acetato de (vi) butilo, m/z 61 y 116 de 7,7 a 9,2 min RT, vii) isobutirato de isobutilo, m/z 89 y 129 de 10,1 a 12.como analitos estándar internos se utilizaron RT de 5 min, acetato de (viii) bencilo, m/z 108 y 150 de 13,1 a 13,8 min, y acetato de (ix) 2-fenetilo, m/z 104 y 121 de 13,8 a 15,5 min. Los ésteres fueron identificados por RT y cuantificados por las áreas de picos y curvas estándar. Las curvas estándar se determinaron utilizando ésteres puros diluidos en hexadecano a concentraciones de 0,01 g/L, 0,05 g/L, 0,1 g/L, 0,5 g/L y 1 g / L.