Microdelección del cromosoma Y en un padre y sus cuatro hijos infértiles

Resumen

Las microdelecciones de Yq están asociadas con azoospermia y oligozoospermia severa. En general, los hombres con deleciones son infértiles y, por lo tanto, las deleciones no se transmiten a los hijos a menos que se realice la fertilización in vitro (FIV) y la inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI). Reportamos una familia inusual caracterizada por múltiples miembros con infertilidad y microdeleción de Yq. Se obtuvieron antecedentes reproductivos completos, análisis de semen y muestras de sangre de miembros relevantes de la familia. La preparación y cuantificación del ADN se realizaron utilizando kits comerciales. Para el cribado se utilizaron un total de 27 pares de conjuntos de cartilla basados en sitios etiquetados de secuencia específicos para los loci de la región de microdeleción Y. Posteriormente, se analizaron las manchas sureñas con deleted in azoospermia (DAZ) y el motivo de unión ribosómica (RBM) de los ARN para su confirmación. The proband, his three brothers and father were all found to be deleted for DAZ but not RBM. En el momento del análisis, la persona afectada era el padre de azoospermia, mientras que sus cuatro hijos fueron severamente oligozoospérmicos o azoospermia. A diferencia de su padre, los cuatro hijos son infértiles y no tienen descendencia, a excepción de uno de ellos que logró una hija solo después del tratamiento de FIV/ICSI para la infertilidad. Las microdelecciones de Yq que involucran el gen DAZ están asociadas con una expresión fenotípica variable que puede incluir una fertilidad evidentemente normal.

Introducción

La infertilidad ocurre en aproximadamente el 14% de las parejas (Mosher, 1985) y se estima que las anomalías en la pareja masculina están presentes en hasta la mitad de los casos (Swerdloff et al., 1985). Los esfuerzos para evaluar las causas de la azoospermia han demostrado que después de la exclusión de las causas tradicionalmente reconocibles (es decir, cariotipo anormal, obstrucción, varicocoele, defecto hormonal, etc.).), la mayoría de los casos (50-75%) son inexplicables y se denominan idiopáticos (Pryor et al., 1997). Recientemente, se ha reportado que hasta el 30% de los hombres con azoospermia `idiopática’ tienen microdeleciones del cromosoma Y (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Exactamente cómo y si estas microdelecciones causan azoo/oligozoospermia es objeto de una intensa investigación y debate.

Esencial para el argumento de que las microdeleciones Y causan infertilidad es la observación de que los hombres fértiles rara vez manifiestan microdeleciones Y. Se han notificado microdeleciones en cuatro de los 200 hombres fértiles estudiados (Pryor et al., 1997). Sin embargo, las eliminaciones en estos hombres fueron muy pequeñas y lo más probable es que representaran polimorfismo insignificante. No se han reportado eliminaciones relativamente grandes del tipo asociado con la infertilidad masculina en hombres con fertilidad normal. Aunque generalmente se asume que estas eliminaciones surgen de novo y que no se esperaría la transmisión de la microdeleción Y de padre a hijo, se han reportado algunos casos raros de transmisión de la microdeleción del cromosoma Y de padre a hijo (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Sin embargo, solo en tres casos se ha notificado transmisión vertical de una microdeleción del locus de azoospermia (DAZ) de padre a hijo (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Ahora describimos una familia de cuatro generaciones en la que un padre azoospermico y sus cuatro hijos infértiles comparten una microdeleción aparentemente idéntica que incluye el locus DAZ. Esta familia representa el primer y único reporte de transmisión vertical espontánea de deleción de DAZ a múltiples descendientes. Proporciona evidencia de que una sola microdeleción Yq puede resultar en una expresión fenotípica variable en diferentes individuos. Es clínicamente significativo, ya que la presencia de una microdeleción no es un marcador absoluto de infertilidad y puede asociarse con una fertilidad aparentemente normal.

Materiales y métodos

El cribado para microdeleción de Yq se realizó de forma rutinaria para infertilidad masculina utilizando un protocolo revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Colegio de Médicos & Cirujanos de la Universidad de Columbia. Se tomaron muestras de los pacientes después del consentimiento informado.

Los resultados del análisis de semen

se analizaron utilizando los criterios de la OMS con un microscopio de contraste de fase Nikon.

Las concentraciones de hormonas séricas

La hormona foliculoestimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la testosterona se midieron mediante un ensayo enzimoinmunométrico quimioluminiscente en dos sitios en fase sólida (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Ángeles, CA, EE.UU.). Los rangos normales para hombres son FSH < 10 mUI/ml; LH <10 mUI/ml; y testosterona 270-1070 ng / dl.

ADN genómico

La extracción de ADN genómico de sangre completa se realizó mediante lisis de glóbulos rojos, seguida de lisis de glóbulos blancos y sus núcleos. Las proteínas celulares se eliminaron por precipitación de sal, y el ADN genómico se precipitó con isopropanol utilizando el kit de extracción de ADN de Puregeno (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; número de catálogo. D-5004).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Los cebadores se produjeron como oligonucleótidos secos en un sintetizador de ADN automatizado (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Se seleccionaron un total de 27 sitios marcados con secuencia específica del cromosoma Y (Figura 1) a partir de un mapa de STS (Vollrath et al., 1992). Incluyen los tres loci de espermatogénesis AZFa, AZFb y AZFc propuestos (según Vogt et al., 1996) que abarca los intervalos Yq 5, 6 y 7. Como protocolo de cribado rápido, se utilizó un sistema multiplex de PCR compuesto de dos a seis pares de cebadores diferentes en un total de seis reacciones multiplexadas (Tabla I). Con cada prueba de PCR, se incluyó un control femenino y un control masculino normal. Todas las reacciones de PCR se ejecutaron en placas de policarbonato (Techne®) en una máquina MJ Research®. Las condiciones de PCR fueron esencialmente las descritas anteriormente (Henegariu et al., 1993). Brevemente, en una reacción de volumen total de 14 µl, se utilizaron 50 ng de ADN genómico como plantilla, 1 µl de solución patrón de imprimación (mezcla I o II o III o IV o V o VI consistente en 10 pmol por imprimación), 12 µl de `mezcla en frío PCR’ (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l de cada dNTP, 5% DMSO, 1× tampón de reacción de polimerasa Taq sin Mg2+), 1,25 UI de polimerasa de ADN Taq (Promega) y 1 una gota de aceite. Las mezclas completas se colocaron directamente en un termociclador precalentado a 94°C. Las condiciones de ciclo para 27 ciclos fueron: 94°C, 30 s (fusión); 55°C, 45 s (recocido); y 72°C, 60 s (extensión). El tiempo de extensión final fue de 5 min. Los productos de reacción PCR se separaron en geles de agarosa al 3% (Bio-Rad, grado ultra puro) mediante electroforesis en tampón TBE. Los productos de PCR fueron teñidos con bromuro de etidio y visualizados por exposición a luz ultravioleta. Los STB que no mostraron amplificación en reacciones múltiples se confirmaron mediante PCR de reacción única con controles positivos y negativos adecuados. Se consideró que un STS estaba ausente después de tres fallos de amplificación.

Hibridación sureña

Se realizó un blot sureño de acuerdo con el protocolo establecido (Sambrook et al., 1989). Brevemente, 5 µg de ADN genómico se digirió con HindIII o TaqI, se ejecutó en un gel de agarosa al 0,7% en tampón estándar de TBE, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó con sondas marcadas con 32P. La sonda DAZ fue el inserto purificado de un plásmido (pDP1577)que contenía el ADNc de longitud completa (Reijo et al., 1995). De manera similar, la sonda RBM fue la inserción de plásmido de un clon de ADNc RBM (MK5) (Ma et al., 1993).

Determinación de paternidad

La paternidad de los cuatro hijos se confirmó al mostrar la segregación esperada de cuatro marcadores autosómicos altamente polimórficos (Weber y May, 1989). Estos fueron D21S156, D21S270, D13S132, y D13S159 con heterocigosis de 0,83, 0.86, 0.84 y 0,90, respectivamente.

Hibridación fluorescente in situ (FISH)

FISH para DAZ se realizó con Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996), utilizando métodos establecidos (Yu et al., 1996).

Resultados

El probanda (individuo III 8 en la Figura 2) y su cónyuge (III-9) se presentaron en la Clínica de Infertilidad Reproductiva-Endocrinología en el Columbia-Presbyterian Medical Center con queja de infertilidad primaria durante 3 años. Las pruebas revelaron cariotipo normal y niveles hormonales séricos normales, mientras que los análisis de semen mostraron oligozoospermia grave (Tabla II). El cribado de microdeleción por PCR basado en STS reveló la presencia de una microdeleción en el subintervalo 6D–6F del brazo largo del cromosoma Y (Figura 1). Durante la discusión, el proband informó que sus dos hermanos mayores (III-4 y III-6) eran conocidos por ser azoospermicos e infértiles. El estudio posterior reveló que los tres hermanos tenían una microdeleción aparentemente idéntica. La biopsia testicular realizada en uno de ellos (III-6) demostró el síndrome de «células de Sertoli solamente».

El hallazgo de microdeleción en tres hermanos infértiles sugirió que era probable que su padre tuviera la misma deleción. Se realizó un estudio detallado del resto de la familia, que residía en un pequeño pueblo de la República Dominicana. Se obtuvo una historia reproductiva completa de los miembros adultos de la familia. Las relaciones familiares representadas en el pedigrí (Figura 2) se confirmaron mostrando la segregación esperada de varios marcadores polimórficos autosómicos (datos no mostrados) para los miembros de la familia relevantes (I-1, I-2, II-1, II-8 y II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). No había pruebas de no paternidad. Minuciosa estudios citogenéticos en los miembros de la familia (I-1, II-1, II-6, II-8 II-10 III-1, III-4, III-6, III-8 III-14 III-15, III-17, III-19, y IV-1), reveló cariotipos normales. Se realizó un análisis de semen en siete de los 16 varones y se obtuvieron muestras de sangre de la mayoría de los miembros de la familia.

En el cuadro II se resumen los resultados de los análisis de semen y de los análisis endocrinos de los miembros pertinentes de la familia. El caso índice (III-8), su padre (II-1) y dos de sus tres hermanos (III-4, III-6) fueron encontrados para ser azoospermia o gravemente oligozoospérmicos. El hermano mayor del proband (III-1) declinó el análisis de semen. Además, se encontró que el tío del proband (II-8) tenía azoospermia y FSH elevada con testosterona baja. Como se muestra en la Figura 1, se encontró que el proband, su padre y tres hermanos tenían microdeleción de Yq por análisis de PCR STS. El borrado sureño con las sondas DAZ (Figura 3) y RBM (datos no mostrados) confirmó que la deleción incluía el locus DAZ, pero no el locus con motivo de unión al ARN (RBM). Análisis de peces con el DAZ Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996) de los leucocitos del padre del proband (II-1) mostraron ausencia uniforme del locus DAZ (Figura 4).

El hallazgo de que el individuo II-8 en el pedigrí era azoospermico pero no tenía una microdeleción fue una sorpresa. El locus DAZ en este individuo se probó más a fondo mediante análisis sureño utilizando el ADNc DAZ y una enzima de restricción diferente (TaqI). No mostró ninguna anomalía en el locus DAZ. Además, los PECES con el DAZ Cosmid 63C9 mostraron una intensidad normal (datos no mostrados).

El proband (III-8) y su hermano mayor (III-6) buscaban tratamiento de infertilidad. Después de un amplio asesoramiento, optaron por la fertilización in vitro (FIV) y la inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI). El proband (III-8) y su esposa (III-9) se sometieron a dos ciclos de FIV-ICSI que no lograron producir un embarazo secundario a una respuesta ovárica deficiente. El hermano del proband (III-6) y su esposa (III-7) se sometieron a un ciclo de hiperestimulación ovárica controlada y se recuperaron nueve ovocitos. Once espermatozoides maduros se encontraron en tres eyaculados el día de la recuperación y se usaron para ICSI. Se fertilizaron tres ovocitos que posteriormente se dividieron y se transfirieron. Dio a luz a una niña sana (IV-2).

Discusión

Reportamos una familia excepcional en la que un padre azoospermico y sus cuatro hijos infértiles comparten una microdeleción Yq aparentemente idéntica que involucra el locus DAZ. La mutación de novo que llevó a la microdeleción de DAZ parece haberse originado en el padre del probando (II-1). Se espera que esta deleción cause azoo / oligozoospermia e infertilidad masculina, y sin embargo, concibió espontáneamente a cinco hijos y no sabía de ningún problema de fertilidad. Curiosamente, sin embargo, los cuatro hijos son estériles y son azoospermia o gravemente oligozoospérmicos.

Esta familia plantea varios problemas con respecto a la asociación entre la microdeleción yq y la infertilidad. En primer lugar, confirma que la transmisión vertical de la microdeleción Yq es posible y puede conducir a la infertilidad posterior en la descendencia masculina. En segundo lugar, es obvio que la misma deleción puede dar lugar a diferentes fenotipos en diferentes individuos. Aunque el padre (II-1) de los cuatro niños de esta familia era azoospermico en el momento del análisis, tuvo su primer hijo a la edad de 25 años y el último a la edad de 38 años. Por lo tanto, poseía algún grado de fertilidad durante un gran lapso de años. Del mismo modo, la microdeleción del cromosoma Y, específicamente DAZ, no implica necesariamente una historia de azoospermia de por vida ni excluye la formación de una familia numerosa. Sus cuatro hijos, por otro lado, son estériles y cualquiera de azoospermia o gravemente oligozoospérmicos.

El gen DAZ se ha propuesto como factor de azoospermia en el cromosoma Y. Esta familia muestra claramente que, si bien DAZ puede tener un papel crítico en la espermatogénesis, no es esencial para la fertilidad. Además, la pérdida total del cúmulo de genes DAZ puede asociarse con un cuadro histológico de `células de Sertoli solamente’, así como con detención de la maduración del esperma (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Varios autores han encontrado una mala correlación entre la localización de las microdeleciones Y (incluidas las deleciones DAZ) con el fenotipo clínico e histológico de los pacientes (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). Los hallazgos en esta familia coinciden en que tal correlación puede resultar bastante problemática. La biopsia testicular del hermano del proband (III-6) mostró una imagen de `solo células de Sertoli’, mientras que el proband (III-8 con un recuento de espermatozoides de 0,5×106/ml) claramente se esperaría que tuviera algún grado de maduración de espermatozoides en la biopsia. Además, es posible que la biopsia testicular no sea representativa de todo el testículo porque puede haber heterogeneidad geográfica para la espermatogénesis, como en el caso de los individuos III-6 cuyos eyaculados contenían espermatozoides maduros.

Solo podemos especular sobre la base de las diferencias fenotípicas entre miembros de la familia con la misma deleción. Es bien sabido que las eliminaciones idénticas dentro de los autosomas pueden dar lugar a fenotipos diferentes (Schinzel, 1994). Uno puede postular que tales diferencias son consecuencias de la exposición de cada individuo a su entorno o la expresión de varios genes modificadores. Un padre fértil ha sido descrito con una microdelección que se ensanchó cuando se transmitió a su hijo infértil(Stuppia et al., 1996). Aunque las extensiones variables en los bordes de la eliminación pueden existir entre los diferentes miembros de nuestra familia, estas extensiones moleculares no se pueden distinguir mediante el mapeo de intervalos. Por análisis de PCR, el mismo STSs no pudo amplificarse en nuestros cinco individuos y la hibridación Meridional con la sonda DAZ confirmó una deleción completa de este grupo de genes. Aunque es posible que las eliminaciones observadas, de hecho, no sean idénticas y las áreas adyacentes puedan contener genes importantes que modulan el grado de expresión fenotípica, estos resultados aún indican una gran superposición de ADN Y eliminado (incluida la pérdida del grupo de genes DAZ) en cada individuo de esta familia única.

Nos fascinó el hecho de que el tío del proband (II-8) tiene infertilidad y azoospermia, pero no tiene microdeleción aparente por la prueba de STS. Dado que el análisis de frotis sureño utilizando las sondas RBM y DAZ, así como los análisis de PECES utilizando un cosmido DAZ, fueron completamente normales, nos vemos obligados a concluir que tiene una etiología diferente subyacente a su infertilidad. Es cierto que es posible que tenga una mutación/perturbación más pequeña o puntual o un reordenamiento proximal/distal que no es detectable por los métodos actuales. No dio antecedentes de exposición a gonadotoxinas u otros factores definibles que pudieran afectar la espermatogénesis.

Hasta hace poco, la microdeleción Y ha tenido poca importancia clínica, ya que un hombre con deleción no se reproduce, en general. Sin embargo, utilizando ICSI y aspiración de esperma testicular (TESA), combinada con FIV, ahora es posible que los hombres oligo/azoospermicos con microdeleción Y logren embarazos (Mulhall et al., 1997; Silber et al., 1998, e individual III-6). Esto ha fomentado la preocupación de que tales embarazos puedan producir descendencia masculina con microdeleciones similares y posterior infertilidad(Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). De hecho, la microdeleción Yq se puede transmitir a la descendencia masculina a través de ICSI (Kent-First et al., 1996). La familia que reportamos sugiere que los hombres con microdeleciones Yq (como el individuo II-1) que logran embarazos transmitirán la misma microdeleción y el riesgo de infertilidad a sus hijos (individuos III-1, III-4, III-6, III-8). Por lo tanto, se debe ofrecer a los pacientes un cribado de microdeleción Y antes de la ICSI y se les debe aconsejar sobre la certeza de transmitir la microdeleción Yq y posiblemente la infertilidad a sus hijos. A medida que más investigación se centra en las etiologías genéticas de la infertilidad masculina, la identificación de los genes involucrados en la espermatogénesis debe proporcionar información sobre la fisiopatología de la infertilidad masculina y una base más racional para iniciar la terapia.

Agradecemos a las familias por su cooperación en el estudio; al Dr. David C. Page por proporcionar la sonda de ADNc DAZ y su inestimable ayuda con este manuscrito; al Dr. Kun Ma por proporcionar la sonda de ADNc MK5 (RBM1) ; Dr. Peter Vogt por el ADN de individuos microdeleteados de Yq utilizados para validar nuestra metodología de PCR STS; y C. C. Yu y Patricia Lanzano por su invaluable asistencia técnica.

Este estudio fue financiado en parte por los premios para el personal de la Oficina de Ensayos Clínicos del Columbia Presbyterian Medical Center.