Medición comparativa de CNP y NT-proCNP en muestras de sangre humana: una evaluación metodológica

Introducción

Péptido natriurético tipo C (CNP), identificado en 1990 por Sudoh et al., es el miembro más antiguo de la familia de péptidos natriuréticos . El CNP estimula selectivamente el receptor de péptido natriurético humano 2 (NPR2), que activa la quinasa dependiente de GMPc (cGK) elevando la concentración intracelular de GMPc . Además, el CNP se une a NPR3 y, a su vez, desactiva la proteína quinasa A por inhibición dependiente de proteínas Gi de la adenilato ciclasa . El PNC tiene propiedades antiproliferativas y anti-migratorias y también fue identificado como un factor relajante derivado del endotelio . Además, la PNC inhibe la reestenosis neointimal, reduce el remodelado constrictivo vascular y la lesión por isquemia-reperfusión cardíaca . El PNC desempeña un papel importante en el crecimiento óseo, la reproducción, el crecimiento nervioso, la reendotelización, así como en la función renal, pancreática y cardíaca . Además, recientemente se ha reconocido que el CNP está involucrado en el desarrollo de la formación de placa aterosclerótica .

Debido a la gran cantidad de funciones de CNP, este péptido ha alcanzado un interés creciente en la investigación cardiovascular durante los últimos años. Sin embargo, los estudios relativos a las concentraciones de PNC en muestras de sangre son inconsistentes. Algunos de estos estudios midieron concentraciones de CNP o su pro-péptido amino-terminal (NT-proCNP) en muestras de suero y otros utilizaron muestras de plasma . Desafortunadamente, aún no se han informado detalles sobre posibles retrasos durante la toma de muestras de sangre y el procesamiento posterior de las muestras. En la literatura disponible hasta el momento, no existen datos sobre la diferencia de concentraciones de CNP/NT-proCNP entre muestras de suero y plasma. Además, la influencia del retraso en el procesamiento de las muestras de sangre sigue sin estar clara. Además, la concentración de PNC en muestras de suero y plasma varió notablemente (Tabla 1). Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue responder a las siguientes preguntas metodológicas: (1) ¿Causa sesgo el procesamiento tardío de las muestras de sangre almacenadas a temperatura ambiente? (2) ¿Hay alguna diferencia entre las concentraciones séricas y plasmáticas de CNP o NT-proCNP? (3) ¿Estas diferencias dependen del tiempo?

Métodos

Estudiamos a 12 voluntarios varones (edad media 29 ± 2 años, peso normal, sin tratamiento farmacológico, sin antecedentes de enfermedades cardiovasculares u otras, 3 fumadores). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos investigados. Se tomaron trillizos de muestras de sangre en ayunas de todos los voluntarios a las 8 de la mañana. Las muestras de sangre se recolectaron utilizando el sistema de recolección S-Monovette® de 7,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) que contenía activador de la coagulación (Caolín) para muestras de suero, citrato de sodio para muestras de plasma o EDTA de potasio para muestras de sangre completa. Todas las muestras para análisis basales se centrifugaron inmediatamente a 2.000 × g durante 10 minutos a 4 ° C y el sobrenadante se almacenó a -70°C hasta el análisis. Para los análisis intermedios (30 minutos o 2 horas), las muestras de plasma se centrifugaron a 2.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se retiró y se almacenó a temperatura ambiente durante 30 minutos o 2 horas. Después de la coagulación de la sangre, las muestras de suero se procesaron de forma idéntica a las muestras de plasma. El sobrenadante se guardó y también se almacenó a temperatura ambiente durante 30 minutos o 2 horas. Se almacenaron muestras de sangre completas a temperatura ambiente sin centrifugación. Después de 30 min o 2 horas, las muestras de sangre completas se centrifugaron a 2.000 × g durante 10 min a 4 ° C. El sobrenadante se retiró y se almacenó a -70°C hasta el análisis. La concentración de CNP se midió utilizando el Kit de EIA CNP-22 (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración de NT-proCNP se midió utilizando el Kit EIA de NT-proCNP (Biomedica, Viena, Austria) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se utilizó ANOVA unidireccional para la comparación entre los grupos. Para las comparaciones de pares, se aplicó la prueba t. Los datos se muestran como medias ± desviación estándar (DE) o intervalo de confianza del 95% (IC del 95%). Se asumió significación estadística con p < 0,05. Los datos se analizaron con MedCalc ® para Windows, Versión 10.0.1.0 (Software MedCalc, Mariakerke, Bélgica).

Resultados

Como se muestra en la Figura 1a, las concentraciones basales de PNC en muestras de suero, plasma y sangre completa fueron de 0,997 ± 0,379 ng/ml, 1,933 ± 0,699 ng/ml y 0,991 ± 0,489 ng/ml, respectivamente. Las concentraciones plasmáticas de PNC fueron significativamente más altas en comparación con las muestras de suero y sangre completa en todos los momentos (ANOVA, p = 0,001 al inicio, p < 0,001 a los 30′ min. y p = 0,003 a 120′ min.). No se observaron diferencias significativas entre las muestras de sangre completa y de suero en ningún momento (ANOVA, p > 0,05). Las concentraciones basales de NT-proCNP en muestras de suero, plasma y sangre completa fueron de 58,5 ± 28,3 pg/ml, 60,3 ± 23,9 pg/ml y 50,7 ± 21,4 pg/ml, respectivamente (Figura 1b). No se encontró diferencia significativa entre los grupos en ningún momento (ANOVA, p > 0,05). En muestras de sangre completa, la concentración de lactato aumentó significativamente después de 2 horas en comparación con el valor basal (3,2 ± 0,8 mm vs.2,0 ± 0,6 mM, p < 0,001). Además, el valor de pH disminuyó de 7.34 ± 0.03 al inicio a 7,29 ± 0,03 después de 2 horas (p < 0,001).

Discusión

Nuestro estudio reveló que CNP y NT-proCNP son estables en suero y en muestras de sangre completa durante al menos dos horas a temperatura ambiente. En consecuencia, lo más probable es que la estabilidad del péptido CNP no se vea afectada por ningún retraso en el procesamiento de muestras durante al menos dos horas. Ya se ha notificado que el ProCNP (protocolo del fabricante, condiciones de almacenamiento desconocidas de muestras de sangre) es estable durante al menos 2,5 horas. En consecuencia, nuestros experimentos confirmaron la estabilidad de NT-proCNP incluso a temperatura ambiente. La concentración de NT-proCNP en todos los tipos de muestras se mantuvo constante durante el transcurso del tiempo hasta 2 horas, lo que indica una estabilidad duradera de esta proteína. Como se indica en la Tabla 1, la concentración media de NT-proCNP (56,5 ± 24.3 pg/ml) medido en este estudio estuvo dentro del rango notificado (ver Tabla 1) de individuos sanos (3,7-432 pg / ml).

En contraste con NT-proCNP, la concentración de CNP fue significativamente mayor en muestras de plasma en comparación con muestras de suero y sangre completa (Figura 1). Hasta el momento, ni nuestro grupo ni el servicio técnico de fabricantes encontraron evidencia alguna sobre la influencia del tipo de muestra en el ensayo ELISA utilizado en este estudio. Sin embargo, al inicio, el sobrenadante de las muestras de plasma y de sangre completa eran idénticos con la excepción del tipo de inhibidor de la coagulación de la sangre utilizado. Este inhibidor fue citrato de sodio en el grupo plasmático y EDTA en el grupo de muestra de sangre completa. Las muestras de sangre completa revelaron resultados comparables a las muestras de suero (p = 0,98). Por lo tanto, es muy probable que el citrato de sodio pueda influir significativamente en la concentración medida de CNP en plasma y, en consecuencia, falsificar los resultados obtenidos con esta técnica.

Inesperadamente, las concentraciones basales de PNC en muestras de plasma y suero fueron aproximadamente mil veces superiores a las de otros informes (Tabla 1) . En todos estos estudios se utilizó el Radioinmunoanálisis (RIA-Kit) para la determinación de las concentraciones de CNP. Por el contrario, en otros dos estudios, las concentraciones de CNP medidas en muestras de suero y plasma fueron comparables a nuestros resultados con respecto a la magnitud de la dimensión . Curiosamente, en estos últimos estudios, se utilizó el mismo Kit ELISA que en nuestra investigación. Incluso después de una evaluación exhaustiva de diversos factores internos y externos, no se pudo encontrar una explicación satisfactoria de esta discrepancia. Las mediciones de control utilizando CNP exógeno en suero humano revelaron un error de medición no significativo de + 7,8% (95% –KI: -). El péptido CNP utilizado para la curva de referencia fue sintetizado por el propio fabricante (Phoenix). En contraste, el péptido CNP utilizado como control «exógeno» fue proporcionado por Bachem. Según aseguraron ambos fabricantes, las secuencias de aminoácidos eran idénticas y se formaron enlaces disulfuro en ambos péptidos.

Sin embargo, los resultados de las mediciones de control interno pueden resumirse de la siguiente manera: En primer lugar, las mediciones de control realizadas en nuestro estudio revelaron que los kits ELISA se utilizaron correctamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En segundo lugar, las mediciones realizadas con muestras de control confirmaron la idoneidad de la curva estándar aplicada. En tercer lugar, las muestras de suero de control que contenían PNC exógeno revelaron una precisión aceptable y los resultados estuvieron dentro del orden de magnitud esperado. En cuarto lugar, una mayor concentración de CNP en muestras de plasma es probablemente un artefacto causado por citrato de sodio.

Según lo informado por Clerico y compañeros de trabajo, también se conocen grandes diferencias en los resultados entre los diferentes métodos de AIR y EIA, por ejemplo, ANP y BNP . Clerico y sus compañeros de trabajo concluyeron que las grandes diferencias en estos resultados se deben muy probablemente a la especificidad de los anticuerpos monoclonales o policlonales utilizados, el diseño del sistema de inmunoanálisis (ensayo competitivo vs .no competitivo), la matriz analítica (suero vs. EDTA vs. plasma heparinizado) utilizada y la gran cantidad de formas circulantes de péptidos natriuréticos, como se informó anteriormente para los inmunoanálisis de ANP y BNP. Estas fuentes metodológicas de sesgo también pueden ser concebibles para los ensayos CNP y NT-proCNP y, por lo tanto, explican la gran diferencia en los resultados de los estudios citados (Tabla 1).

Limitaciones del estudio

Reconocemos que un tamaño de muestra de 12 es demasiado pequeño para concluir que no hay diferencia en absoluto. Sin embargo, desde un punto de vista estadístico, sería importante especificar cuán grande debe ser la diferencia para tener relevancia médica. Hasta donde sabemos, esto último aún no está claramente definido. Por lo tanto, las medias y los intervalos de confianza del 95% de todas las medidas se dieron en la figura para permitir a cada lector extraer su propia interpretación de los datos también.

En referencia a las concentraciones séricas y plasmáticas, debe mencionarse que los valores notificados en la Tabla 1 se midieron con diferentes métodos (AIR, ELISA) en pacientes que padecían diferentes enfermedades. Habría sido muy útil comparar los ensayos CNP-RIA con los ensayos CNP-ELISA utilizando directamente las mismas muestras, porque una diferencia de mil veces en el orden de magnitud sigue siendo notable. Desafortunadamente, las mediciones de los ensayos RIA no estaban disponibles en nuestro laboratorio. Para la concentración de NT-proCNP, esta última comparación fue investigada por Olney y compañeros de trabajo, mostrando que el ELISA comercial (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Viena, Austria) dio valores que fueron una media del 21% (rango 11-52%) de los valores de AIR. La validación cruzada del patrón de referencia del kit ELISA utilizando el ensayo RIA mostró un desacuerdo del 15%.

Resumen

Las mediciones de CNP y NT-proCNP probablemente no se vieron afectadas por el retraso de la extracción de la muestra o el tipo de muestra de sangre (excepto para CNP en muestras de plasma). Para las muestras de plasma, solo las muestras de sangre anticoagulada con EDTA fueron adecuadas para el ensayo ELISA de CNP utilizado en este estudio. En consecuencia, la concentración de CNP y NT-proCNP podría utilizarse en aplicaciones clínicas para determinar los efectos de CNP. También se debe considerar que la concentración de NT-proCNP, siendo solo un subproducto del péptido activo, puede ocultar la verdadera naturaleza del CNP. Sin embargo, sigue sin explicarse la discrepancia en las concentraciones de PNC medidas determinadas por los ensayos RIA o por los ensayos ELISA, pero lo más probable es que se deba a problemas metodológicos. Por lo tanto , como se recomienda para el ANP y el BNP, los inmunoensayos para el CNP también deben estandarizarse o armonizarse en el futuro.