Los mecanismos de reordenamiento cromosómico en el genoma humano

Los DSB patológicos se definen arbitrariamente como DSB que no tienen un propósito fisiológico y pueden provocar disfunción celular.

Roturas aleatorias de ADN debido a radiación ionizante o radicales libres oxidativos

En muchos reordenamientos cromosómicos, los DSBs en uno o ambos genes parecen estar ubicados aleatoriamente dentro de grandes regiones de muchas kilobases. El posicionamiento aleatorio y la aparente falta de propensión a secuencias sugieren mecanismos DSB inespecíficos de secuencia, como los radicales libres oxidativos, la radiación ionizante o, con menos frecuencia, la hidrólisis espontánea de la columna vertebral del ADN.

Aproximadamente la mitad de la radiación ionizante natural del medio ambiente se origina en metales pesados naturales de la tierra, como uranio, torio e incluso potasio. La otra mitad de la radiación ionizante emana de la radiación cósmica que no está totalmente bloqueada por la atmósfera. En total, alrededor de 3 x 108 partículas de radiación ionizante pasan a través de cada uno de nosotros cada hora , produciendo radicales libres de hidroxilo del agua a su paso. Este tracto de radicales libres hidroxilo causa daños en el ADN, rompiendo así ambas hebras de ADN.

Aproximadamente el 0,1% del oxígeno que respiramos se convierte en radicales libres . Esto genera 3 x 1022 radicales libres por hora dentro de cada uno de nosotros, y estos radicales libres dañinos se distribuyen a través de las 1014 células del cuerpo humano. Los radicales libres causan predominantemente daño al ADN de una sola hebra, pero dos eventos cercanos de este tipo pueden resultar en un DSB.

Acción de trapo en sitios RSS crípticos en ubicaciones fuera de objetivo de una manera específica de secuencia: rupturas de tipo J de V(D)

La secuencia de consenso de heptámero/nonámero RSS no es de ninguna manera exclusiva de los loci de Ig y TCR, y el complejo de TRAPO puede cortar en sitios que difieren sustancialmente del consenso de 16 pb . El motivo minimalista para el corte de TRAPO es solo CAC. Por lo tanto, el complejo RAG puede actuar en sitios de locus de receptores no antígenos similares a RSS, denominados crípticos RSS (cRSS). Esto ocurre en muchos de los reordenamientos observados en el linfoma linfoblástico agudo de células T humanas . En estos casos, en lugar del complejo de RAG emparejando un 12-RSS con un 23-RSS, un 12-RSS con un 23-cRSS o un 23-RSS con un 12-cRSS. Llamamos a estas rupturas de tipo V(D)J porque se producen a través del mismo mecanismo que la recombinación V(D)J normal, independientemente del hecho de que uno de los sitios esté fuera de los loci receptores de antígeno habituales (es decir, está fuera del objetivo).

Acción de TRAPO en estructuras de burbujas de ADN y otras regiones de heterología de una manera específica de estructura

Además de su modo de corte específico de secuencia, el complejo de TRAPO también puede nick de una manera específica de estructura en sitios de transición de dsDNA a ssDNA, como ocurre en los bordes de estructuras de ADN de burbujas o incluso desajustes de base única . Tal actividad del complejo de TRAPO puede haber surgido porque el complejo de TRAPO está acostumbrado a crear estructuras horquillas, lo que implica una distorsión sustancial del ADN. Por lo tanto, cualquier región de desajuste o deslizamiento es un objetivo potencial para que el complejo de TRAPO lo atrape en las células linfoides.

Transposición mediada por RAG como mecanismo para el reordenamiento cromosómico

De 1998 a 2007, varios laboratorios propusieron que el complejo RAG podría insertar los extremos romos que contienen RSS de la recombinación V(D)J, denominados extremos de señal, en nuevas ubicaciones en el genoma. Esto se llama transposición de TRAPO, y ocurre a un nivel bajo usando una forma truncada de las proteínas de TRAPO llamadas trapos centrales (revisadas en ). Sin embargo, los esfuerzos para encontrar eventos de transposición de RAG in vivo mostraron que estos eran mucho menos comunes que la integración aleatoria del ADN . Por último, no hay ejemplos de neoplasias linfoides humanas (o cualquier otro tipo de neoplasia maligna) en las que el genoma haya sido alterado por una inserción transposicional de TRAPO de los extremos de la señal (o cualquier otra variante aparente de dicha transposición).

Acción de ayuda en lugares fuera de objetivo

Como se mencionó en la discusión anterior de recombinación de cambio de clase, la AYUDA puede convertir C a U o metil C o T en cualquier región de ADNss. Esto parece ocurrir no solo en las secuencias de conmutación y dominios variables de los loci de Ig, sino también en algunas ubicaciones patológicas, como algunos oncogenes como c-myc . Cuando son el objetivo de la ayuda, estas regiones pueden tener mutaciones puntuales o DSBs . Se cree que la acción de ayuda en la región de cambio de IgH durante la RSC y la acción de AYUDA independiente en el gen c-myc para crear un DSB son la base de los dos DSB iniciadores en las translocaciones de c-myc en ratones y en humanos . Uno podría considerar las interrupciones de este tipo como interrupciones de tipo CSR (como se mencionó anteriormente en la discusión de la recombinación de cambio de clase) o interrupciones de tipo SHM, donde SHM se refiere a eventos iniciados con AYUDA del tipo similar a lo que ocurre normalmente en la hipermutación somática.

Supuesta acción combinada de AID y trapos en sitios de CpG: rupturas de tipo CpG

Recientemente, informamos que los DSBs en ciertos loci en translocaciones en etapas pro-B/pre-B-el bcl – 2 de t(14;18), el bcl-1 de t(11;14) y E2A de t(1;19)-tienen una fuerte propensión a ocurrir en la secuencia de dinucleótidos CpG.

La translocación de bcl-2 es la translocación más común en el cáncer, se presenta en >90% de los linfomas foliculares y en un tercio de los linfomas difusos de células grandes. El cincuenta por ciento de las roturas en el gen bcl-2 ocurren dentro de la región de punto de ruptura principal (MBR), que es un punto de acceso de 175 bp en el exón de 3′ más en la región que codifica el 3’UTR. Dos puntos calientes de uso menos frecuente se encuentran 18 y 29 kb más distales al gen bcl-2, la región intermedia de cúmulos bcl-2 de 105 bp (icr) y la región de cúmulos menores bcl-2 de 561 bp (mcr), respectivamente. Cualquiera de los sitios de GpC dentro de cualquiera de estas tres zonas de translocación bcl-2 puede ser un objetivo para un OSD . El trece por ciento de las interrupciones de translocación de bcl-2 se encuentran en la rci y el 5% en la rcm.

El uso de GPC se aplica también al cúmulo de translocación principal bcl-1, que es la ubicación involucrada en la translocación t(11;14). La translocación de bcl-1 ocurre en casi todos los linfomas de células del manto, con 30% de las roturas que ocurren en el cúmulo de translocación principal de bcl-1 (CMT) a 150 bp.

También se producen roturas de tipo CpG en una tercera neoplasia linfoide, la t(1;19) en un pequeño porcentaje de LLA pre-B, una translocación que ocurre entre el gen Pbx1 y el gen E2A. Las roturas en el gen E2A ocurren en una zona de solo 23 pb, y estos DSB también están significativamente agrupados alrededor de sitios de GpC . Las tres translocaciones que involucran a bcl-2, bcl-1 y E2A ocurren en la etapa pro-B/pre-B del desarrollo de células B.

El bcl – 2 MBR es reactivo con una sonda química para varamiento simple llamada bisulfito . Al igual que el bcl-2 MBR, este bcl-1 MTC es relativamente pequeño (150 pb) y presenta una reactividad similar al bisulfito . Estas zonas altamente reactivas de bisulfito son ricas en corridas de Cs. Basado en el dicroísmo circular, la cristalografía de rayos X, la RMN y el sondeo químico, tales series de Cs tienden a adoptar una estructura de ADN que es intermedia entre el ADN en forma B y el ADN en forma A, denominado intermedio B/A. La estructura intermedia B / A tiene una cinética de apertura más rápida, tal vez dando cuenta de parte del aumento observado en la reactividad del bisulfito. Tales regiones inusuales del ADN pueden ser más propensas a eventos de deslizamiento, tal vez inducidos por la replicación o transcripción del ADN. Esto puede explicar su vulnerabilidad en los ensayos de recombinación minicromosómica .

El Cs de las GPC dentro o directamente adyacentes a estas zonas intermedias B/A tienen un mayor riesgo de sufrir desaminación . Esta desaminación no se aplica a todos los Cs de la región, sino solo a los Cs que se encuentran dentro de los sitios de CpG. La única característica distintiva de tales Cs dentro de los GPC es que pueden ser metilados por la metiltransferasa de ADN. Cuando las Cs regulares se desaminan, se convierten en U, lo que resulta en un desajuste U:G. Pero cuando el metil Cs se desaminan, se convierten en T, lo que resulta en un desajuste T:G. La reparación de desajustes U:G es muy eficiente, pero la reparación de desajustes T:G no es eficiente. De hecho, la reparación del desajuste T:G es tan ineficiente que representa aproximadamente la mitad de las mutaciones puntuales en el gen p53 en una amplia gama de cánceres humanos. Estos sitios de desajuste T: G están siempre en sitios CpG.

¿Qué causa la interrupción en estos sitios de desajuste de T:G? Curiosamente, esta desaminación en estos puntos calientes de translocación linfoide parece ocurrir en la etapa pre-B de diferenciación. Esta es la etapa del desarrollo de las células B cuando la recombinación de D a J se produce con mayor vigor. Dado que las translocaciones de bcl-2 y bcl-1 ocurren en esta etapa, es probable que esta sea la etapa de la translocación. Hemos demostrado que el complejo de TRAPO puede causar un DSB en sitios de pequeñas estructuras de burbujas, e incluso desajustes de pares de bases individuales. (Como se mencionó anteriormente, esta acción del complejo de TRAPO refleja su actividad de nucleasa específica de la estructura, tal vez una característica que refleja las acciones específicas de la estructura del complejo de TRAPO durante el paso de formación de horquillas de la recombinación V(D)J.) Por lo tanto, hemos propuesto que el complejo RAG haga que los DSBs en los sitios de T: G no coincidan.

Si el complejo de RAG causa los DSBs en los sitios de CpG, ¿por qué no se producen tales roturas de tipo CpG en las células pre-T, que también expresan el complejo enzimático de RAG? El linaje de células B expresa una citidina deaminasa para recombinación de cambio de clase e hipermutación somática. Como se mencionó anteriormente, esta enzima se llama desaminasa inducida por activación (AID). La AYUDA se expresa en células B, pero no en otras células somáticas. La AYUDA se expresa en mayor medida en las células B cuando se encuentran en los centros germinales. Sin embargo, se ha descrito un bajo nivel de expresión de ayuda en las células pre-B. Además, se cree que las células B que acaban de salir de la médula ósea, llamadas células B de transición, también expresan AYUDA . Por lo tanto, hay un período de tiempo en el que las células B están completando la recombinación V(D)J y comienzan a expresar AYUDA cuando tanto la AYUDA como el complejo de TRAPO están presentes en las células B. Se ha demostrado que AID es capaz de desaminizar metil C a T. Por lo tanto, proponemos que AID es probablemente responsable de la mutación de meC a T en sitios de CpG en células B tempranas. El desajuste T:G resultante es cortado por el complejo de TRAPO, dando como resultado un DSB. Este modelo explica tres picos de translocación ubicados dentro del bcl-2 MBR, todos los cuales están centrados en sitios de CpG .

Otras causas de SBD patológicos de mecanismo desconocido

Ciertas translocaciones están muy relacionadas con el tratamiento con inhibidores de la topoisiomerasa tipo II . Después de este tratamiento, algunos pacientes desarrollan neoplasias malignas secundarias con estas translocaciones características. Las topoisomerasas en general hacen roturas de una o dos hebras para enrollar o desenrollar el ADN, por lo que tienen una actividad de nucleasa como parte de su función. Después de enrollar o desenrollar el ADN, normalmente vuelven a sellar la(s) rotura (es). Se ha propuesto que la interrupción o prevención del resellado puede dar lugar a interrupciones estables en los reordenamientos cromosómicos .

Algunos DSB surgen en sitios cercanos repeticiones de ADN directas o invertidas. Tales repeticiones pueden dar lugar a estructuras de ADN deslizadas que contienen regiones de ADN monocatenario, que pueden ser objetivos para la escisión. El mejor ejemplo de esto es la translocación constitucional t(11;22)(q23;q11), que contiene un palíndromo rico en varios cientos de bases, con potencial para la formación cruciforme.

Combinación de múltiples mecanismos DSB dentro de un reordenamiento

Dado que se requieren dos DSB para generar una translocación, las dos interrupciones a menudo no están relacionadas entre sí. En las translocaciones bcl-2 y bcl-1, por ejemplo, la ruptura en el locus de IgH es una ruptura de tipo V(D)J generada por la acción específica de la secuencia del complejo de TRAPO durante la recombinación V(D)J. (Uno podría considerar esto como un fracaso en la finalización del proceso normal de recombinación V (D)J.) El OSD en el locus bcl-2 o bcl-1 es un corte de tipo CpG que se ha propuesto que se debe a la acción secuencial de la AYUDA y a la actividad de picadura específica de la estructura del complejo RAG .

Incluso dentro de un lugar determinado, puede haber una amplia gama de mecanismos de OSD. Los loci SCL y LMO2 soportan predominantemente DSB de tipo V(D)J, pero un tercio o más de los DSB son incompatibles con los requisitos de secuencia para DSB de tipo V(D)J, y estos pueden deberse a daños de radicales libres, radiación ionizante o fallas de topoisomerasa. Por lo tanto, los diferentes loci dentro de una sola célula son propensos a diferentes tipos de mecanismos de OSD.

DSB inducidos por replicación

Durante la replicación de ADN, las eliminaciones pueden surgir debido al deslizamiento de la hebra de síntesis en la hebra de la plantilla. Los reordenamientos cromosómicos que ocurren en puntos críticos específicos, ya sea en células somáticas cancerosas o durante divisiones gametogénicas/iniciales del desarrollo como translocaciones constitucionales, se denominan translocaciones recurrentes que se pueden observar en muchos pacientes. Las translocaciones no recurrentes son aquellas que ocurren en diferentes lugares de un paciente a otro, pero alteran o inactivan un gen que causa una enfermedad. A diferencia de las translocaciones recurrentes que hemos discutido en cáncer anteriormente, los mecanismos que causan el intercambio de hebras en translocaciones no recurrentes parecen involucrar el cambio de plantilla durante la síntesis replicativa de ADN. Estos interruptores de plantilla pueden ocurrir en pequeñas regiones de homología de secuencias de ADN, como 5 pb. Este cambio de plantilla se ha denominado replicación inducida por rotura mediada por microhomología (MMBIR) o Bloqueo de horquilla y Cambio de Plantilla (FoSTeS). Para uniones de translocación no recurrentes que involucran varios largos tramos de secuencia de regiones del genoma que normalmente están separadas entre sí, se han propuesto múltiples eventos de cambio de plantilla como mecanismo .