La ototoxicidad del cisplatino involucra citocinas y red de señalización STAT6

Reactivos

El cisplatino y el bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difenil-tetrazolio (MTT) se compraron a Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, EE. Los materiales de cultivo plástico se compraron a Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). El medio esencial modificado (DMEM) de Dulbecco, el suero fetal bovino (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) y otros reactivos de cultivo de tejidos se obtuvieron de Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Proteína recombinante de IL-4 e IL-13 de ratón, anticuerpos contra IL-4, IL-13, TNF-α, IL-1β, IL-6 y kits de ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) (QuantikineR) para citoquinas se compraron a R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Estos anticuerpos se utilizaron para inmunohistoquímica a una concentración de 1:200. Se compraron anticuerpos contra p-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) e IkB a Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, CA, USA).

Cultivo celular y viabilidad

El establecimiento y caracterización de las células auditivas HEI-OC1 inmortalizadas condicionalmente se describió en nuestro informe anterior 1. La expresión de marcadores específicos de OHC como Math1 y Miosina 7a sugiere que las células HEI-OC1 representan precursores de OHC. Las células HEI-OC1 se mantuvieron en DMEM con alto contenido de glucosa (Gibco BRL) que contenían 10% de FBS. Para los experimentos descritos a continuación, se cultivaron células HEI-OC1 en las siguientes condiciones permisivas: 33 ° C y 5% de CO2 en DMEM suplementado con 10% de FBS. Las células (3 × 104 células/pocillo de una placa de 24 pocillos) se incubaron con cisplatino de 20 µM durante 24 h. Para determinar la viabilidad celular, se añadió MTT (0,25 mg) a una suspensión celular de 1 ml durante 4 h. Después de lavar las células y tres lavados con PBS (pH 7,4), el producto de formazan insoluble se disolvió en DMSO. La densidad óptica (DO) de cada pozo de cultivo se midió mediante un lector de microplacas (Titertek Multiskan, Laboratorios de flujo) a 590 nm. Se tomó la DO de las células de control para indicar viabilidad al 100%. Para examinar los efectos de varias citocinas, se agregaron anticuerpos neutralizantes contra citocinas a los cultivos durante 30 minutos, después de lo cual se cultivaron con cisplatino de 20 µM durante 24 h.

Animales

Se compraron ratones STAT4−/− (generación de retrocruzamiento N10), STAT6−/− (generación de retrocruzamiento N6) y ratones WT BALB/c del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME, EE.UU.). Los ratones homocigotos STAT4 y STAT6 KO fueron identificados por PCR. Los ratones KO no mostraron anomalías en el desarrollo. Los experimentos se realizaron en ratones de 6 semanas de edad, y todos los ratones fueron emparejados en 3 días. Los ratones fueron alimentados con una dieta comercial estándar mientras estaban alojados a una temperatura ambiente de 20-22 ° C y una humedad relativa de 50 ± 5% bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 h en una instalación específica libre de patógenos. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Wonkwang.

Ensayo de reportero de luciferasa

Las células se transfectaron transitoriamente con plásmido reportero de luciferasa NF-kB utilizando el reactivo de transfección Lipofectamina 2000. Después de 36 h de incubación, las células fueron tratadas con cisplatino durante 12 h en presencia de anticuerpos neutralizantes de citoquinas. Las células se lavaron dos veces con tampón de PBS y posteriormente se lisaron en tampón de lisis de reportero (Promega, Madison, WI, EE. UU.). A continuación, se mezcló una alícuota de 20 µl de lisado con 100 µl de reactivo de ensayo de luciferasa, tras lo cual se midió la intensidad de la luz emitida utilizando un luminómetro AutoLumat LB953 (EG y G Berthold, Bad Wildbad, Alemania). Finalmente, la actividad de la luciferasa se midió por triplicado, se promedió y luego se normalizó contra la actividad de la β-galactosidasa utilizando el sistema de ensayo de galactosidasa (Galacto-Light, Tropix Inc. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Transfección con construcciones siRNA

siRNAs prediseñados contra ratones STAT4, STAT6 y siRNA codificado de control se compraron a Santa Cruz Biotechnology. Las líneas sensoriales de los SIRNAS frente a STAT4 y STAT6 son las siguientes. La construcción de siRNAs STAT4 es un conjunto de tres secuencias de siRNA de la siguiente manera: Cadena de Sentido Dúplex 1: 5′-IndexTermGUA GCU GUG GUA AUU UCA A-3′, Cadena de sentido Dúplex 2: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA A-3′, y Cadena de sentido Dúplex 3: 5′-IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA A-3′ (número de acceso al ARNm: NM_011487). La construcción de siRNAs STAT6 es un conjunto de tres secuencias de siRNA de la siguiente manera: Cadena de Sentido Dúplex 1: 5′-IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC A-3′, Cadena de sentido Dúplex 2: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG A-3′, y Cadena de sentido Dúplex 3: 5′-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG A-3′ (número de acceso al ARNm: NM_009284). Las células se transfectaron transitoriamente con 100 nM de constructos de ARNip en reactivo de transfección de ARNip X-tremeGENE (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la incubación a 33 °C y 5% de CO2 durante 36 h, las células se trataron con cisplatino durante 24 h. Las muestras se prepararon y analizaron para el análisis de viabilidad o Western blot. La interferencia de la expresión fue confirmada por el análisis de inmunoblots.

Medición de citoquinas proinflamatorias mediante ELISA

Para medir la secreción de citoquinas proinflamatorias de las células tratadas con cisplatino, se recolectaron sobrenadantes de cultivo en cada momento y los niveles de citoquinas proinflamatorias secretadas se determinaron mediante ELISA (Kits de citoquinas Quantikinas; R& D Systems Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Preparación de extractos citosólicos y nucleares

Las células se lavaron con PBS frío, se rasparon y centrifugaron a 1 000× g durante 5 minutos a 4 °C. El pellet de la célula se resuspendió en 200 µl de tampón de lisis (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo y 0,5 mm ditiotreitol) y luego se incubó en hielo durante 15 minutos. Al final de la incubación, se agregaron 10 µl de NP-40 al 10% y el tubo se agitó en vórtice durante 10 s. Después de la centrifugación a 13 000× g durante 1 minuto a 4 °C, el sobrenadante (extracto citosólico) se recogió y almacenó a -80 °C, mientras que el pellet se procesó posteriormente para obtener los extractos nucleares. El pellet se resuspendió en tampón de extracción (5 mm HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, fluoruro de fenilmetilsulfonilo de 0,5 mM, EDTA de 0,2 mM, ditiotreitol de 0,5 mM y glicerol al 25% (vol/vol)) y se incubó durante 30 min a 4 °C. Los extractos nucleares se aislaron por centrifugación a 13 000× g durante 30 min a 4 °C. El sobrenadante se retiró y se almacenó a -80 ° C hasta que se utilizó para el análisis de western blot. Finalmente, la concentración de proteínas se determinó por el método Lowry.

Análisis de Western blot

El análisis de Western blot se realizó de la siguiente manera. Brevemente, las células fueron cosechadas y lavadas dos veces con PBS heladas. Los lisados fraccionados total y nuclear / citosólico se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida SDS al 12% durante 3 h a 20 mA, después de lo cual se transfirieron a nitrocelulosa. La membrana se incubó en proteína de leche en polvo al 5% (peso/vol) en PBS que contenía 0,05% (vol/vol) Tween-20 (PBS-T) durante 1 h, después de lo cual se lavaron en PBS-T, y luego reaccionaron con anticuerpo primario (1:1 000) durante 1 h. A continuación, la membrana se lavó ampliamente con PBS-T y luego se incubó con anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con HRP (1:3 000) durante 1 h. Después de lavados extensos, las bandas de proteínas en la membrana se visualizó utilizando reactivos quimioluminiscentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sustrato Supersignal; Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).

Experimento in vivo de ototoxicidad de cisplatino

Todos los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos de seis ratones cada uno. Los animales del grupo 1, que se consideraron un grupo de control, recibieron inyección intraperitoneal de PBS. A los animales del grupo 2 se les administró cisplatino (4 mg/kg de peso corporal) por inyección intraperitoneal durante 4 días consecutivos. Los animales fueron matados bajo anestesia con gas CO2 al día siguiente de la inyección final de cisplatino, después de lo cual se extirpó el hueso temporal de la oreja derecha.

Medición de ABR

Para un análisis posterior del umbral auditivo, se midió el ABR antes y 24 h después del tratamiento final de cisplatino. A continuación, se compararon los cambios en el umbral ABR entre el pretratamiento y el posttratamiento. Los ratones se anestesiaron con un cóctel de ketamina (40 mg / kg) y xilazina (10 mg/kg) y se mantuvieron calientes con una almohadilla térmica durante el registro ABR. Se insertó un electrodo de aguja subdérmico (activo) en el vértice, mientras que los electrodos de tierra y de referencia se insertaron subdérmicamente en la piel suelta debajo de las pinnas de las orejas opuestas. Los estímulos de prueba consistieron en ráfagas de tono de fase alternas a frecuencias de 4, 8, 16 y 32 kHz. Las señales se generaron utilizando el software SigGen de Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, EE. UU.). Cada ráfaga de tono (duración de 1 ms) se cerraba a través de una ventana Blackmann, y tenía un tiempo de subida y bajada de 0,5 ms sin meseta. Los estímulos se calibraron antes de cada sesión de prueba, grabando la salida del altavoz con un micrófono colocado a la altura de la cabeza de los animales. Las formas de onda ABR se promediaron en respuesta a ráfagas de 300 tonos en cada frecuencia probada. En cada frecuencia, la amplitud de la señal se atenuaba automáticamente en pasos de 10 dB desde 90 dB SPL hasta que las ondas ABR desaparecían en trazas grabadas con ajustes de filtro de 100-3 000 Hz. El juicio del umbral fue realizado fuera de línea por dos observadores independientes, ciegos experimentalmente, basados en los registros ABR.

Preparación de la superficie del órgano de los explantes de Corti

Todos los ratones se mataron al día siguiente de la inyección final de cisplatino. El hueso temporal se diseccionó y se fijó en paraformaldehído al 4% durante 16 h a 4 ° C, y se enjuagó con 0,1 M de PBS. El hueso temporal se descalcificó con EDTA al 10% en PBS durante 3 días. La cóclea fue cuidadosamente diseccionada. A continuación, se diseccionaron la estría vascular y el ligamento espiral, dejando el órgano de Corti. El giro medio de la cóclea se sumergió en faloidina etiquetada con TRITC (Sigma P1951, 1:100) en PBS durante 20 min. Después de tres lavados con PBS, la muestra se examinó bajo un microscopio de fluorescencia utilizando filtros apropiados para TRITC (excitación: 510-550 nm, emisión: 590 nm).

Tinción inmunohistoquímica y ensayo de TÚNEL

El hueso temporal extraído se fijó en paraformaldehído al 4% durante 16 h y luego se descalcificó con EDTA al 10% en PBS durante 2 semanas, después de lo cual se deshidrató y se incrustó en cera de parafina. Secciones de 5 µm se desparafinizaron en xileno y se rehidrataron a través de concentraciones graduales de etanol. Para el estudio de inmunohistoquímica, se utilizó un kit de inmunohistoquímica (DAKO LSAB Universal K680, Carpinteria, CA, EE.UU.) y los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Después de lavar las secciones en PBS, se bloqueó la unión inespecífica con albúmina sérica bovina al 1% durante 1 h. Se agregaron anticuerpos primarios (diluidos en 1:200) a los portaobjetos, después de lo cual se procedió a la incubación durante 1 h. Después de lavados repetidos con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado durante 30 min y luego se cubrieron durante 30 min con un anticuerpo secundario que contenía peroxidasa de rábano picante. Finalmente, las secciones se teñieron en una solución de sustrato recién preparada (3 mg de 3-amino-9-etilcarbazol en 10 ml de tampón de acetato de sodio (pH 4,9), 500 µl de dimetilformamida, peróxido de hidrógeno al 0,03%) durante 5 min. Los núcleos de las células inmunotintadas fueron luego contrarrestados con hematoxilina de Mayer (Sigma-Aldrich Co.). Se detectaron células apoptóticas in situ utilizando el ensayo TUNEL (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Alemania). Brevemente, una sección fue desparafinada y rehidratada. Después de la incubación con proteinasa K de 20 µg/ml (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), la peroxidasa endógena se bloqueó incubando las muestras al 2% de H2O2 en metanol durante 30 min en RT. A continuación, las secciones de tejido se lavaron en PBS y se incubaron con solución de etiquetado durante 1 h a 37 °C. Los núcleos se un microscopio de fluorescencia.

Amplificación de la PCR con transcriptasa inversa

Para la PCR coclear, el hueso temporal del oído izquierdo se recolectó rápidamente y se sumergió en RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, EE. UU.) hasta su uso a -20 ° C. Luego, se diseccionaron las cócleas enteras y se utilizaron para extraer ARN total mediante el uso de TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Después de la extracción del ARN total usando Trizol (Invitrogen), el ADNc monocatenario se sintetizó a partir del ARN total. A continuación, se realizó PCR con ADN polimerasa Taq (Takara, Takara Shuzo, Japón) sometiendo las muestras a 30 ciclos de 95 °C para 40 s, 58 °C para 40 s y 72 °C para 50 s. Diez microlitros de los productos de PCR se separaron en gel de agarosa al 1,2% y se visualizaron bajo luz UV. Las secuencias de los cebadores utilizados para la amplificación de PCR fueron las siguientes: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, reversa, 5 ‘- IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3’).

Análisis estadístico

Cada experimento se realizó al menos tres veces, y todos los valores reportados representan las medias ± DE de los análisis triplicados. El análisis estadístico multivariado se realizó mediante análisis de varianza y pruebas de Duncan, utilizando el software estadístico SPSS 11 (Chicago, IL, EE. UU.). Se utilizaron ANOVA de dos vías y/o ANOVA de una vía para determinar la significación de los resultados. Los resultados estadísticos fueron revisados por un bioestadístico de nivel de maestría. Valores de P < 0.05 fueron considerados estadísticamente significativos.