La activación de proteasa ClpP resulta de la reorganización de las redes de interacción electrostática en los poros de entrada

Modo de unión de ACP1 a EcClpP

Para dilucidar la base estructural para la activación de ClpP por ACP128, estructuras de NmClpP y EcClpP (Fig. 1a)en complejo con análogos ACP1 se buscaron. Si bien no se logró una estructura de NmClpP con ACP1 unido a pesar de los repetidos intentos, se determinó una estructura del complejo EcClpP+ACP1-06 con una resolución de 1,9 Å (Fig. 1b, c, Tabla 1), que contiene un tetradecámero en la unidad asimétrica (Cadenas A-N). La densidad electrónica de los residuos N-terminales que forman los bucles axiales de EcClpP no está clara en todas menos una subunidad (Cadena B). En estructuras publicadas anteriormente, estos bucles axiales son altamente flexibles y generalmente están desordenados en el cristal en ausencia de activadores o a través de la preclusión por el empaque de cristal23. Se observó una densidad electrónica inequívoca para una sola molécula ACP1-06 en una bolsa formada por subunidades D y E, mostrando dos configuraciones diferentes del compuesto (Fig. 2a, b). Ambas configuraciones se modelaron en la densidad electrónica, en la que la primera posiciona la porción de trifluorometilpiridina del compuesto dentro de una bolsa hidrofóbica (configuración hacia abajo), mientras que la segunda la posiciona fuera de la bolsa hidrofóbica expuesta al disolvente (configuración hacia arriba) (Fig. 2a). Las 13 bolsas hidrofóbicas restantes muestran una densidad de electrones ambigua para ACP1-06. Modelamos y refinamos las 14 moléculas ACP1-06 en configuraciones ascendente y descendente con una ocupación de 0,5, lo que resultó en una densidad electrónica mejorada para cada ligando.

Los modos de unión de ACP1-06 (Fig. 2b-d) aproximados a los de los ADEP observados en estructuras cristalinas de diferentes ClpPs bacterianos (Fig. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Tenga en cuenta que los compuestos sintetizados por nuestro grupo se numeran como ACP1-AA y ADEP-AA, mientras que los compuestos de estudios de otros grupos se nombran como en los respectivos artículos publicados. Todos los contactos proteicos con ACP1-06 son de naturaleza no polar, excepto por dos enlaces electrostáticos notables que ocurren entre (1) la cadena lateral hidroxilo fenólico de Y76 y el oxígeno amido de ACP1-06, y (2) la cadena lateral guanidinilo de R206 (el penúltimo Arg en EcClpP) y un oxígeno sulfonilo de ACP1-06 (Fig. 2b). Las dos últimas interacciones están presentes en ambas configuraciones de ACP1-06. Además, R206 (Cadena E) se estabiliza mediante unión iónica con E65 de una subunidad adyacente (Cadena D) (Fig. 3a, b).

En la configuración descendente, la fracción trifluorometilpiridina de ACP1-06 ocupa una cavidad hidrofóbica formada por L62, T93 y F96 (Cadena D), y Y74, Y76, I104, L203 y L128 (Cadena E) (Figs. 2b y 3b). Esta es la misma cavidad ocupada por el anillo del residuo exocíclico de Phe de los diferentes análogos de ADEP cocristalizados con ClpP, como en nuestro NmClpP + ADEP-0419 (Fig. 2e, f) o las estructuras EcClpP+ADEP140 (Fig. 2c, d). Por el contrario, en la configuración up, la fracción trifluorometilpiridina gira alrededor del enlace C–S y se expone al disolvente mientras hace contactos de van der Waals con Y74, I104, F126 y L203 (Cadena E) (Figs. 2b y 3b). La mitad de la gema-dimetilo se apila contra el anillo plano de Y74 (Cadena E), mientras que la cadena alifática extendida que termina con un anillo fenilo orto-cloro sustituido, se asienta en una ranura no polar entre dos hélices de subunidades adyacentes (Fig. 3b). Esta hendidura de unión está formada por L62 (Cadena D), F63 (Cadena D), A66 (Cadena D), L37 (Cadena E), V42 (Cadena E) y la porción no polar de E40 (Cadena E) (Figs. 2b y 3b).

En las estructuras de EcClpP unidas a ACP1-06 y ADEP1, se encuentra el puente salino intrasubunitario entre R36 y E40, donde la cola alifática cercana de ADEP1 o el anillo fenilo sustituido por cloro de ACP1-06 forma una interacción hidrofóbica con la cadena lateral de E40 (Fig. 3b, c). Los dos activadores se estabilizan aún más en el sitio hidrofóbico mediante dos patrones de enlace de hidrógeno distintos. Mientras que ACP1-06 se asegura a través de una interacción iónica expuesta al disolvente entre su grupo sulfonilo y el residuo C-terminal R206 (Fig. 3b), ADEP1 se mantiene en su lugar por dos enlaces de hidrógeno con el grupo hidroxilo de Y76 aislado dentro del sitio hidrofóbico (Fig. 3c). Un enlace de hidrógeno mediado por solventes entre E65 y el grupo carbonilo de la cadena lateral N-acil Phe de ADEP1 refuerza aún más su interacción con EcClpP (Fig. 3c). Este enlace de hidrógeno adicional, así como el mayor tamaño del anillo depsipéptido cíclico, que tiene más área de superficie con la que formar interacciones de van der Waals en comparación con el grupo trifluorometilpiridina más pequeño de ACP1, puede explicar la unión generalmente más estricta observada para ADEP que para ACP1s28.

En la estructura EcClpP+ACP1-06, encontramos una densidad electrónica inexplicable en las 14 subunidades que se extienden desde el residuo nucleofílico S111 de la tríada catalítica, lo que sugiere una modificación covalente (Fig. 1a, b). La densidad se extiende aproximadamente en ángulo recto en direcciones opuestas lejos de las cadenas laterales S111. A pesar de los extensos esfuerzos, no pudo equiparse de manera convincente con péptidos, productos de acilcetona o varias moléculas conocidas de inhibidores de la serina proteasa.

El modo de unión de ADEP a NmClpP

NmClpP tiene una secuencia pro más corta en el extremo N, mientras que tiene cuatro residuos adicionales en el extremo C en comparación con EcClpP (Fig. 1a). Aunque el NmClpP se expresó como una proteína de longitud completa que llevaba un His6-tag N-terminal, observamos repetidamente la falta de unión a la resina de ácido Ni-nitrilotriacético. La secuenciación N-terminal de la proteína purificada reveló que el NmClpP maduro comienza en el residuo Y6 (Fig. 1a), indicando autoproteólisis para liberar su pro-secuencia N-terminal (1MSFDN5).

Previamente, habíamos determinado la estructura de NmClpP con ADEP-0419. En este estudio, determinamos la estructura de apo-NmClpP a 2,0 Å y NmClpP con ADEP-14 unido a 2,7 Å (Fig. 1b, c, Suplemento Fig. 1c, cuadro 1). La estructura de apo-NmClpP contiene un tetradecámero en la unidad asimétrica y no muestra una densidad clara para ninguno de los 14 bucles axiales N-terminales. Se observa una densidad electrónica débil para los bucles formados por residuos G133-G137 en la hebra β8 de la región del mango (Fig. 1a). La unidad asimétrica para el cristal NmClpP + ADEP-14 contiene dos tetradecámaras (Suplemento Fig. 1d). No se observó densidad electrónica para los residuos 1-22 de las 28 subunidades debido al empaquetamiento de cristales (Fig. 1c, Suplemento Fig. 1d). Además, la hebra β8 (residuos 130-137; Fig. 1a) es solo parcialmente visible en todas las subunidades. El ADEP-14 está vinculado a NmClpP en una configuración similar al ADEP-04 (Figs. 2e, f y 3e, f). Brevemente, la fracción difluorofenil del ADEP-14 ocupa una bolsa hidrofóbica formada por Y67, L95, L97 y L119 de una subunidad, y V49, L53, T84 y F87 de una subunidad adyacente (Fig. 3e). El anillo de seis miembros de la fracción de ácido pipecólico está expuesto al disolvente y es estabilizado por el anillo fenilo de F117 y las cadenas laterales hidrofóbicas de L97, L119 y L196 (Fig. 3e). La sustitución adicional de metilo en el residuo de alo-treonina del anillo depsipéptido (Fig. 1b) está expuesto al disolvente. Al igual que el ADEP-04, el ADEP-14 está asegurado en la bolsa hidrofóbica altamente complementaria por dos interacciones de enlace de hidrógeno entre el grupo hidroxilo fenólico de Y67, el grupo amino del residuo de difluorofenilalanina y el grupo alanino carbonilo en el anillo depsipéptido, y un enlace de hidrógeno mediado por solventes con E56 (Fig. 3e, f). La cadena lateral del ácido octadienoico del ADEP-14 se encuentra en el estrecho canal hidrofóbico formado por L53, F54 y S57 de una subunidad, y R27, L28, E31, I33, F35 e Y67 de la subunidad vecina (Fig. 3e).

La unión a ACP1 y ADEP produce efectos alostéricos distintos en el barril de ClpP

Utilizando estructuras de formas apo y compuestas de EcClpP y NmClpP (Fig. 1c), probamos los efectos alostéricos que ocurren al unirse al activador. Como se muestra en la Fig. 2, la unión del activador actúa como una cuña que causa el desplazamiento lateral de dos subunidades adyacentes. El alcance del cambio conformacional global causado por la unión ACP1-06 (rmsd = 0,84 Å en relación con apo-EcClpP) es similar al de ADEP-04 (rmsd = 0.73 Å en relación con apo-NmClpP), pero menor que el de ADEP-14 (rmsd = 2,47 Å en relación con apo-NmClpP). Curiosamente, la dirección de desplazamiento es diferente entre las dos clases de activadores (Fig. 2 y Películas Complementarias 1-4). Entre los dos ADEP, el ADEP-14 causa una mayor perturbación estructural general en el cilindro NmClpP (comparar Películas suplementarias 3 vs.4). La unión de ADEP resulta en una expansión de la superficie apical de NmClpP acompañada de constricción en la región ecuatorial. El pivote para este movimiento está en la región del mango compuesta por hélice aE y hebra β8. Este fenómeno se observa en todas las estructuras ClpP ligadas a ADEP conocidas hasta la fecha, con diversos grados de compactación del cilindro ClpP 15,18,19,23,40. Por el contrario, la unión de ACP1-06 a EcClpP provoca un movimiento hacia adentro de todas las subunidades que resulta en el apriete del cilindro ClpP (Película Suplementaria 1). Por lo tanto, las estructuras muestran que los ACP1 y los ADEP activan el ClpP al inducir distintos efectos alostéricos.

En las estructuras EcClpP y NmClpP unidas al activador, los enlaces electrostáticos de interfaz anillo-anillo que estabilizan el tetradecámero permanecen conservados a pesar de los cambios conformacionales (Fig. Suplementaria. 3). Además, a pesar del cambio estructural global tras la unión del activador, las tríadas catalíticas Ser-His-Asp de EcClpP y NmClpP mantienen geometrías catalíticamente competentes, ya que solo se producen pequeños cambios en la columna vertebral de Ca cerca del sitio activo (Fig.Suplementaria. 1a a c). El análisis de todas las estructuras existentes de ClpP unidas a ACP1 y ADEP muestra que la unión compuesta también resulta en la contracción de la región ecuatorial (Fig. 4).

Cuantificamos la compactación del cilindro ClpP sobre la unión ACP1 o ADEP midiendo los volúmenes de las respectivas cámaras catalíticas (Fig. 4). La unión de ACP1-06 causa una disminución de ~5% en el volumen de la cámara catalítica en relación con apo-EcClpP. La unión de ADEP1 a EcClpP produce una disminución similar en el volumen de la cámara catalítica. Esto también se observa para otras estructuras ClpP ligadas al activador, como el NmClpP unido al ADEP-14, el BsClpP unido al ADEP y el complejo heterooligomérico MtClpP1P2 unido al ADEP (Suplemento Fig. 4).

La activación de ClpP resulta en la reorganización de la red de unión electrostática en los poros axiales

En la estructura de apo-NmClpP, dos enlaces electrostáticos cerca del poro axial estabilizan la interfaz de dos subunidades adyacentes cualesquiera (Fig. 3d, Suplemento Fig. 5). Primero, el grupo carboxilato E58 cargado negativamente de una subunidad forma un par iónico con el grupo de guanidinio R27 cargado positivamente de la subunidad adyacente. En segundo lugar, los grupos hidroxilo S57 y carboxilato E31 de dos subunidades adyacentes forman un enlace de hidrógeno. Al unirse a ADEP, estos dos enlaces no covalentes se rompen, mientras que el enlace iónico entre R27 y E31 de la misma subunidad se acorta, es decir, se fortalece (Fig. 3e, f). En apo-EcClpP, solo un enlace iónico entre E67 y R36 une dos subunidades adyacentes, ya que el residuo equivalente a S57 de NmClpP es una alanina en EcClpP y, por lo tanto, es incapaz de formar un enlace de hidrógeno con E40 (Fig. 3a). Al igual que en NmClpP, la unión de ACP1 o ADEP1 a EcClpP elimina el enlace iónico de la intersubunidad E67-R36 y da lugar a un enlace iónico intrasubunidad más fuerte entre R36 y E40 (Fig. 3b, c, Suplemento Fig. 5).

Para verificar aún más estas observaciones, diseñamos mutantes puntuales NmClpP y EcClpP que conducen a la pérdida de los enlaces electrostáticos de intersubunidades anteriores. Como se muestra en la Fig. 4a, mientras que WT NmClpP fue incapaz de degradar la proteína caseína, se encontró que el mutante NmClpP E58A degradaba la caseína a una tasa más alta que el mutante E31A. Es importante destacar que el doble mutante E31A + E58A tenía una actividad aún mayor que los mutantes individuales. El grado de activación del NmClpP con doble mutante es similar al observado en presencia de ADEPs de 1 µM o ACP1s de 10 µM (Fig. 4a). Se observó un comportamiento similar para EcClpP con mutaciones similares (E40A y E67A; Fig. 4b). El respectivo doble mutante EcClpP no es soluble y no se pudo probar.

Posteriormente, determinamos las estructuras de rayos X de los mutantes NmClpP E58A y NmClpP E31A + E58A (Tabla 1). Los sitios catalíticos de ambos mutantes no están perturbados (Fig. 1e). En el mutante único NmClpP E58A, la mutación suprime el enlace iónico de la intersubunidad E58-R27 y da lugar a una interacción intrasubunidad R27–E31 más fuerte, mientras que el enlace de hidrógeno entre S57 y E31 permanece (Fig. 4c). Un «efecto de cuña» similar se observa en la estructura, como se muestra por el sutil cambio conformacional global en la columna vertebral Ca del mutante NmClpP (rmsd = 0.33 Å en relación con WT NmClpP) (Película Suplementaria 5). La mutación de E31 y E58 a alanina para generar el doble mutante NmClpP E31A + E58A (rmsd = 0,29 Å en relación con WT NmClpP) elimina las dos interacciones electrostáticas estabilizadoras de la intersubunidad, así como el enlace iónico intrasubunidad R27–E31 presente en el único mutante NmClpP E58A (Fig. 4d y Película suplementaria 6) y en NmClpP enlazado a ADEP (Fig. 3e, f). Por lo tanto, el mutante doble NmClpP E31A + E58A es diferente del NmClpP unido a ADEP con el enlace iónico de la intrasubunidad eliminado, pero no obstante es una proteína activada con actividad proteolítica intrínseca comparable a la del ClpP activado por moléculas pequeñas (Fig. 4a). Al igual que el NmClpP unido a ADEP, ambos mutantes simples y dobles NmClpP tienen volúmenes reducidos de cámara catalítica debido a la compactación del barril de ClpP (Fig. 4).

Esta reorganización de la red de enlace se observa para todas las estructuras ClpP activadas disponibles en la EOP, ya sea en presencia de activadores de moléculas pequeñas o debido a mutaciones específicas (Fig. 6). Por ejemplo, la unión del activador de moléculas pequeñas a B. subtilis ClpP (BsClpP), S. aureus ClpP (SaClpP), M. tuberculosis ClpP (MtClpP) y Homo sapiens ClpP (HsClpP) suprime uno o dos enlaces electrostáticos de intersubunidades cerca del poro axial, y da lugar a una interacción iónica intrasubunitaria más fuerte (Fig. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. En MtClpP2, el enlace iónico de intersubunidad equivalente a la interacción E58–R27 en NmClpP no existe18. El residuo equivalente para E58 de NmClpP es L66 en MtClpP2 y no puede participar en una interacción iónica con K35 de MtClpP2 (equivalente a R27 de NmClpP). En su lugar, un enlace de hidrógeno entre intersubunidades entre S65 y E39 estabiliza la interfaz (Fig. 6g, h). La unión de ADEP a MtClpP2 rompe el enlace de hidrógeno S65–E39 y fortalece el enlace iónico intrasubunidad entre K35 y E3918.

Curiosamente, incluso la variante SaClpP Y63A activada41, con la mutación activadora encontrada en el centro del sitio hidrofóbico, y, por lo tanto, no equivalente a las mutaciones activadoras de NmClpP presentadas aquí, apoya nuestro modelo propuesto de reorganización de la red de enlace de hidrógeno alrededor del poro axial tras la activación de ClpP (Fig.Suplementaria. 6f). En la estructura del mutante SaClpP Y63A, la distancia entre el par iónico de la intersubunidad (Q54–R23) se incrementa, mientras que el puente salino de la intrasubunidad (R23–D27) se fortalece (Fig.Suplementaria. 6d, f). También generamos la mutación equivalente Y63A tanto en EcClpP como en NmClpP. El mutante NmClpP Y67A era insoluble, mientras que el EcClpP Y76A tenía una actividad ligeramente superior al mutante E40A, pero inferior a la del mutante E67A (Fig. 4b).

La activación de ClpP resulta en una reducción de la heterogeneidad estructural de los bucles axiales N-terminales

Como se discutió anteriormente, en el bucle axial ordenado del complejo NmClpP+ADEP-04 formando la horquilla de giro β1–β2, la unión ADEP libera R27 de un enlace iónico de intersubunidad con E58 y fortalece el enlace iónico intrasubunidad con E31 de hélice aA (Fig. 5a). En consecuencia, R27 forma un enlace iónico con D23 de la hebra β1 del bucle axial. Esta interacción estabilizadora se observa en todas las estructuras ligadas al activador de ClpP donde se ordenan los bucles axiales (Fig. 5a a e).

Para la estructura EcClpP+ACP1-06, los bucles axiales (residuos 14-31) están ordenados parcialmente en el cristal con solo 1 de cada 14 bucles axiales formando la horquilla β1–β2 (Fig. 1c-el pedido completo parece estar parcialmente impedido por los efectos de empaque de cristales). En el bucle axial ordenado de la subunidad A, la liberación de R36 del enlace iónico de la intersubunidad con E67 le permite formar un enlace iónico intrasubunidad más fuerte con E40 de hélice aA (Fig. 5f). Sin embargo, no hay interacción iónica estabilizadora entre E22 de la hebra β1 y R36 de la hélice aA, probablemente debido al ordenamiento parcial (Fig. 5f). Un enlace de hidrógeno adicional entre D32 de la hebra β2 y S21 de la hélice aA ancla el bucle axial al dominio del núcleo EcClpP (Fig. 5f). De manera similar, los bucles axiales en la estructura Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4 están ordenados solo parcialmente 21. El enlace de hidrógeno conservado entre el residuo Arg de hélice aA y un residuo cargado negativamente de la hebra β1 no se ve en los bucles axiales EfClpP parcialmente ordenados, aunque EfClpP tiene residuos potenciales de enlace de hidrógeno formando en la hebra β1 (T6), y en los filamentos de conexión de bucle β1 y β2 (E9, Q10, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

Además de las interacciones electrostáticas conservadas, los amplios contactos hidrofóbicos con el dominio de la cabeza ClpP estabilizan los bucles axiales. En EcClpP + ACP1-06, los residuos N-terminales no polares de la hebra β1 y la bobina estructurada precedente participan en interacciones hidrofóbicas con residuos no polares de hélice aA de la misma subunidad, y en las caras hidrofóbicas de las hélices aA ‘y aB’ de una subunidad vecina (Fig. 7a). Los residuos no polares en las hélices aA, aB ‘y β3’ constituyen un parche hidrofóbico continuo en la circunferencia del poro axial (Suplemento Fig. 7b) 15.

Para obtener una imagen más clara de la heterogeneidad conformacional de los bucles axiales de ClpP, se llevaron a cabo experimentos de RMN metil-TROSY. Inicialmente, se introdujo una sola mutación de cisteína en los bucles axiales de NmClpP(T10C). Se produjo proteína uniformemente deuterada y posteriormente se reaccionó con 13C-metil-metanotiosulfonato (MMTS). Esto da lugar a la unión de un único grupo visible de RMN 13CH3–S a la cadena lateral de cisteína, lo que conduce a la formación de un residuo de S-metiltio-cisteína (MTC) 42. Este método proporciona una forma fácil de monitorear la estructura y la dinámica de grandes complejos en solución. El monitoreo de las correlaciones de RMN de la sonda de espín adjunta en formas libres, unidas al activador o mutadas de la enzima proporciona una lectura de la conformación de la solución de los poros axiales.

Inicialmente, se realizaron experimentos de control para garantizar que la introducción de la fracción T10MTC no perturbe la estructura del NmClpP. En resumen, se compararon correlaciones de coherencia cuántica múltiple heteronuclear 1H-13C de WT y T10MTC marcado con NmClpP 13CH3 en la cadena lateral de residuos de ILVM en un fondo completamente deuterado y se encontró que eran prácticamente idénticas. Posteriormente, se obtuvieron correlaciones HMQC 1H–13C de NmClpP T10MTC en diferentes estados (Fig. 6a). La forma apo (contornos azules) tiene un gran número de correlaciones, lo que indica bucles axiales estructuralmente heterogéneos. Adición de exceso molar doble de ADEP-28 (actividad indicada en la Fig. 4a) sobre ClpP monomérico redujo significativamente el número de correlaciones (contornos rojos), indicativo de rigidificación u ordenamiento estructural. Por el contrario, la unión de ACP1-17 (exceso molar doble sobre ClpP monomérico; actividad indicada en la Fig. 4a) da lugar a cambios indetectables en las correlaciones observadas (contornos verdes), lo que implica que los bucles axiales no se ven afectados.

Este enfoque también se aprovechó para monitorear el efecto de las mutaciones activadoras (Fig. 4a, b) en los bucles axiales. En estos experimentos, las mutaciones activadoras se introdujeron en el fondo de la mutación T10C (etiquetado). Como se muestra en la Fig. 6a, las correlaciones del mutante NmClpP T10MTC/E31A (contornos rojos) son ligeramente menos heterogéneas que la forma pseudo-WT, mientras que las del mutante NmClpP T10MTC/E58A (contornos naranjas) son prácticamente inalteradas. La presencia simultánea de ambas mutaciones activadoras (NmClpP T10MTC/E31A + E58A) tiene un efecto mucho más dramático que las mutaciones individuales y elimina un gran número de correlaciones correspondientes a los bucles axiales (contornos negros). Esto es consistente con la observación de que el mutante doble es más activo que los mutantes individuales (Fig. 4a).

La activación de ClpP produce una reducción de la heterogeneidad conformacional de la región del mango

Se utilizó el mismo enfoque basado en RMN para investigar el efecto de la unión del activador y las mutaciones en la región del mango. Un mutante de I144MTC (hélice aE) de NmClpP fue preparado y estudiado por RMN en formas unidas a apo, ADEP-28 y ACP1-17. El apo-forma (contornos azules, Fig. 6a) exhibe un par de picos, lo que indica que la región del mango está asociada con un par de conformaciones coexistentes, como se vio en nuestro trabajo anterior sobre EcClpP4. Curiosamente, la adición de ACP1 y ADEP conduce a la desaparición de uno de los picos. Dado que el sitio de unión del activador es distal a la sonda de espín de RMN, parece que la unión de ACP1 o ADEP selecciona alostéricamente una de las conformaciones en la región del mango. Alternativamente, los activadores podrían ser capaces de unir ambas formas pero inducir un cambio a un solo estado.

Experimentos de intercambio de magnetización con períodos de retardo de mezcla de 100, 200, 300, 400, 500, y 600 ms a 40 ° C no fueron capaces de detectar ninguna interconversión entre los conformadores observados para la región del mango para NmClpP en PESO. Esto indica que el proceso de intercambio es demasiado lento para ser caracterizado por RMN.

SAXS demuestra cambios conformacionales de ClpP inducidos por activadores en la solución

Para sondear aún más el estado oligomérico y los cambios estructurales al unirse al compuesto, las muestras apo-NmClpP y NmClpP+ADEP-04 se caracterizaron por SAXS (Fig. 6b-g y Suplemento Fig. 8). Las curvas combinadas finales se muestran en la Fig. 6b, y los perfiles SAXS obtenidos se asemejaban a los de estructuras huecas43. No se encontraron cambios significativos en términos de plegamiento total (Fig. 8), radio de giro (Rg) y estado oligomérico cuando se añadió ADEP-04 al NmClpP (Fig. 8c). Para analizar más a fondo los perfiles SAXS de NmClpP y generar estructuras de solución ab initio, se utilizó el programa GNOM para construir funciones de distribución de distancia de pares, p(r). El Apo-NmClpP p (r) reveló un sutil desplazamiento a la derecha y una dimensión máxima mayor (Dmax) en comparación con el NmClpP ligado al ADEP-04 (Fig. 6c y Suplemento Fig. 8c). Posteriormente, se generaron modelos de átomos ficticios (DAMs) utilizando datos SAXS para analizar visualmente las estructuras de soluciones NmClpP (Fig. 6d-g). Se generaron diez modelos para apo-NmClpP y ADEP-04, y se eligieron los más probables. Estos modelos mostraron que, en general, las dos estructuras de solución NmClpP son similares (cilindros huecos). Sin embargo, cuando se superponen con las estructuras cristalinas correspondientes, se observan fácilmente diferencias que concuerdan con las estructuras de alta resolución (Fig. 6d, e). Una medida de las alturas axiales de las diez presas para el NmClpP ligado a apo y ADEP – 04 dio como resultado valores de 93,0 ± 5,4 Å para la forma apo y 103,5 ± 6,1 Å para la forma unida a ADEP-04. Para corroborar aún más esta observación, los mapas promediados de probabilidad de presas y los mapas de ocupación DAs más altos (Fig. 6f, g). Las alturas axiales mostraron un aumento de aproximadamente 10 Å para el NmClpP ligado al ADEP-04 en comparación con el apo-NmClpP. Además, el NmClpP unido al ADEP-04 mostró una circunferencia de poro axial mayor que el apo-NmClpP (Fig. 6f, g). Por lo tanto, a pesar de la baja resolución de la técnica SAXS, los resultados sugieren que la unión de ADEP-04 a NmClpP no afecta el estado oligomérico de NmClpP, sino que causa una expansión de los poros axiales y una mayor ocupación en las partes superior e inferior de la presa NmClpP+ADEP-04 (Fig. 6e, g) en comparación con apo-NmClpP. Esto probablemente refleja los cambios conformacionales que conducen a la disminución de la heterogeneidad de la estructura de los bucles axiales N-terminales de NmClpP observados por rayos X y RMN.