Hematopoyesis clonal en pacientes con vasculitis| Hematológica asociada a anticuerpos citoplásmicos anti neutrófilos

Hematopoyesis clonal de potencial indeterminado (CHIP), definida por la presencia de una mutación genética hematológica somática asociada al cáncer con una frecuencia de alelos variante ≥2%, se produce en la sangre periférica de al menos el 10% de los individuos de edad avanzada mayor de 60 años de edad sin antecedentes de un trastorno hematológico.21 Las mutaciones afectan principalmente a los reguladores epigenéticos de la transcripción DNMT3A, TET2 y ASXL1, lo que lleva a una ventaja competitiva de las células madre hematopoyéticas mutadas con un sesgo de diferenciación posterior hacia el compartimento mieloide.43 La frecuencia del CHIP aumenta con la edad y se asocia con un mayor riesgo de desarrollar neoplasias hematológicas malignas y enfermedades cardiovasculares, lo que lleva a un aumento de la mortalidad general.5

Utilizando un modelo de ratón con macrófagos con deficiencia de Tet2, se demostró que la aterosclerosis y la enfermedad coronaria son impulsadas por el CHIP a través de una función inflamasómica alterada, lo que lleva a un aumento de los niveles de citoquinas proinflamatorias.6 Nuestro grupo detectó recientemente una correlación entre las mutaciones de DNMT3A y la enfermedad crónica de injerto contra huésped, lo que proporciona más pruebas de un papel importante de la CHIP en las reacciones inflamatorias crónicas.7 Sin embargo, se sabe poco sobre el papel del CHIP en las enfermedades autoinmunes. Un estudio en 56 pacientes con artritis reumatoide no mostró correlación entre el CHIP y la actividad de la enfermedad.8 Las vasculitis autoinmunes asociadas a anticuerpos citoplasmáticos de neutrófilos (ANCA) comprenden una variedad de vasculitis necrotizantes, incluida la granulomatosis con poliangeítis y poliangeítis microscópica, y se caracterizan por una inflamación grave de los vasos pequeños, que puede afectar a todos los sistemas de órganos. Los ANCA están dirigidos contra los autoantígenos mieloperoxidasa (MPO) y proteinasa 3 (PR3). Al unirse a sus antígenos expresados en la superficie celular, la ANCA IgG provoca la activación incontrolada de neutrófilos y monocitos, lo que provoca daño endotelial e insuficiencia de órganos terminales. En la mayoría de los individuos, la carga de mutación más alta de CHIP se puede encontrar en las células mieloides,4 que son las únicas células respondedoras primarias que expresan autoantígenos en AAV. Además, el TET2 y el DNMT3A desempeñan un papel central en el silenciamiento de genes al regular la metilación del ADN. De hecho, se ha informado de silenciamiento defectuoso de genes en células mieloides de pacientes con VAA. Este proceso desregulado incluyó los autoantígenos ANCA y se correlacionó con el riesgo de recaída.119

En resumen, los datos recientes apoyan la idea de posibles vínculos, con respecto a la patogénesis y los resultados clínicos, entre el CHIP y las enfermedades autoinmunes/afecciones inflamatorias. Por lo tanto, caracterizamos el CHIP en una gran cohorte de pacientes con AVA, examinando la prevalencia, los cambios dinámicos a lo largo del tiempo, las manifestaciones orgánicas, el silenciamiento del antígeno ANCA y la activación in vitro inducida por ANCA.

Se recogieron muestras de sangre periférica de pacientes con AVA, atendidos en los departamentos y pabellones ambulatorios de nefrología Charité/HELIOS (Berlín, Alemania, entre abril de 2005 y octubre de 2018. Los datos demográficos y clínicos de los pacientes fueron extraídos de sus historias clínicas. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la inclusión en el estudio, que se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo la aprobación ética de los comités de ética locales.

Se analizó el ADN de sangre completa para detectar el CHIP utilizando una versión personalizada del Panel de Secuenciación Mieloide Illumina TruSight (Tabla Complementaria en Línea S1) en un secuenciador NextSeq. El análisis de secuenciación se realizó utilizando un centro de secuenciación de la plataforma Illumina BaseSpace. Solo se incluyeron variantes no sinónimas con frecuencias alélicas ≥2%. Las variantes candidatas se validaron mediante secuenciación profunda específica (Métodos Complementarios en Línea). Se identificaron un total de 46 mutaciones somáticas en 34 de 112 pacientes con VAA (30,4%) con una frecuencia de alelos de variante mediana de 5.2% (Cuadro Complementario en Línea S2). Mientras que 25 pacientes tenían una sola mutación, ocho tenían dos y un paciente tenía cinco. Los genes mutados con mayor frecuencia fueron DNMT3A (19/46 = 39,1%), TET2 (7/46=15,2%) y ASXL1 (4/46=8,7%) (Figura 1A). De las 46 mutaciones, 26 eran sin sentido, 18 eran truncantes y dos eran mutaciones en el sitio de empalme. El cambio de base más frecuente en las mutaciones sin sentido fue C > T (16/30) (Figura suplementaria en Línea S1).

En comparación con las prevalencias de CHIP notificadas previamente en cohortes de control no seleccionadas de edad y tecnología de secuenciación similares15128743,la prevalencia de CHIP en pacientes con AVA fue significativamente mayor (30,4% vs.13,5%, P<0,001) (Figura 1C, Tabla Suplementaria en Línea S3). Teniendo en cuenta las diferentes tecnologías de secuenciación utilizadas en estos estudios, investigamos una cohorte de control emparejada por edad y sexo de 112 individuos sanos, entre los cuales se encontraron 22 mutaciones en 20 sujetos (controles sanos vs.pacientes con VAA: 17,9 vs. 30,4%, P=0.042) (Cuadro Suplementario En Línea S4, Cifras Suplementarias En Línea S2-S4). Cabe destacar que encontramos una proporción relevante de pacientes con AVA con CHIP ≤55 años (6/33=18,2%) (Figura 1B). Se dispuso de muestras de sangre periférica de seguimiento para 19 pacientes con AVA con CHIP. La mediana de seguimiento fue de 2,3 años (intervalo, 0,3-10,9 años). La carga mutacional de muestras seriadas de estos 19 pacientes en dos a cuatro puntos de tiempo se cuantificó mediante secuenciación profunda.171674 Mientras que cinco pacientes mostraron un aumento relevante en el tamaño de los clones, dos pacientes tuvieron clones ligeramente decrecientes y 12 pacientes no mostraron ningún cambio en el tamaño de los clones a lo largo del tiempo (Figura 1D, Figura Suplementaria en Línea S5). A continuación, investigamos una muestra de seguimiento de cada uno de los 20 pacientes con CHIP, recolectada de 2 a 10 años después de la muestra inicial. Ninguna de las 20 muestras de seguimiento mostró una nueva mutación.

Se realizaron análisis estadísticos exploratorios para identificar asociaciones entre CHIP y parámetros clínicos (76 pacientes con granulomatosis con poliangeítis y 34 con poliangeítis microscópica). Los pacientes con CHIP eran significativamente mayores que los pacientes con CHIP (mediana de 70,5 vs.63,0 años, respectivamente, P=0,017). La prevalencia de CHIP no fue mayor entre los pacientes que habían recibido tratamiento inmunosupresor antes de la toma de muestras (100% de esteroides, 90% de ciclofosfamida, 20% de rituximab, 16% de azatioprina, 13% de metotrexato). No se observaron diferencias en los recuentos sanguíneos, el ancho de distribución de los glóbulos rojos, los niveles de creatinina, las comorbilidades, el desarrollo de neoplasias malignas, el estado de actividad de la enfermedad y el riesgo de recaída de AVA con respecto al estado de CHIP. Sin embargo, los patrones de manifestación de la enfermedad fueron diferentes: los pacientes con CHIP afectados por granulomatosis con poliangeítis mostraron menos enfermedad renal (68,2 frente a 88,5%, P=0,049) y afectación del sistema nervioso (0% frente a 19,2%, P=0,028) (Tablas Suplementarias Online S5-S8, Figuras Suplementarias Online S6-S8).

A continuación, nuestro objetivo fue investigar el silenciamiento del antígeno ANCA y la activación in vitro inducida por ANCA. Con este fin, se realizaron ensayos de estimulación de neutrófilos in vitro utilizando oxidación de dihidrorodamina con anticuerpos monoclonales contra los antígenos ANCA MPO y PR3 en un subgrupo de pacientes con AVA y controles sanos (Métodos Complementarios en Línea) que habían dado negativo para CHIP. Una reducción de la activación se observó en el CHIP en comparación con CHIP AAV pacientes (anti-MPO: índice de estimulación: 6.29 vs 13.01, P=0.057; anti-PR3: índice de estimulación 7.72 vs 13.00, P=0.026) (Figura 2A), mientras que no se observó diferencia en el índice de expresión de membrana ni en el porcentaje de células positivas (Figura 2B, C). Además, los niveles de ARNm en sangre periférica de PR3, MPO, CD177, RUNX3 y JMJD3 se midieron por reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa. CHIP AAV los pacientes mostraron una mayor expresión de la MPO y PR3 arnm en comparación con los niveles en los controles sanos (MPO: 1.94 vs 0.86, P=0,026; PR3: 2.02 vs 0,58, P=0.057), una diferencia que fue menos evidente en el CHIP de los pacientes. Sin embargo, los pacientes con AVA CHIP mostraron una expresión reducida de ARNm de RUNX3 en comparación con el nivel en controles sanos (0.28 vs 0,79, P=0.007) (Figura 2). Debido al reducido número de pacientes, no pudimos subdividir a los pacientes con AVA CHIP de acuerdo con los genes afectados o las frecuencias alélicas variantes y, por lo tanto, no pudimos evaluar su impacto potencial en nuestros hallazgos (Tabla suplementaria en Línea S9). Además, las diferencias significativas en los recuentos de neutrófilos y linfocitos entre los pacientes con AVA y los controles sanos podrían haber afectado nuestros resultados y limitado la capacidad de extraer conclusiones generalizadas (Tabla suplementaria en Línea S10).

In summary, we detected CHIP in 34 out of 112 patients (30.4%), una prevalencia significativamente mayor que la notificada en cohortes sanas y en nuestro grupo de control emparejado por edad,pero comparable al aumento de frecuencias notificado en pacientes con onco12, anemias aplásicas18 y enfermedades cardiovasculares.5 Si bien se ha propuesto la alteración de la señalización inflamatoria como mecanismo subyacente a la asociación de los síndromes mielodisplásicos con enfermedades autoinmunes/afecciones inflamatorias19,un mecanismo similar podría vincular el CHIP con dichas afecciones y, en particular, con el AVA. La transcripción de autoantígenos ANCA desregulada se observa comúnmente en AAV y podría ser alterada por CHIP. Curiosamente, los pacientes con AVA con CHIP, pero no con CHIP, mostraron una regulación al alza de la expresión de ARNm de autoantígenos que se informó anteriormente.119 Este hallazgo bastante sorprendente sugiere que la expresión de antígeno ANCA regulada al alza es presumiblemente un fenómeno secundario en VAA, inducido por señalización inflamatoria que es defectuosa en las células CHIP. En consonancia con esto, se observó una reducción de la activación de neutrófilos inducida por ANCA en pacientes con CHIP. Curiosamente, hemos demostrado previamente que la producción inducida por ANCA de especies reactivas de oxígeno juega un papel importante en la regulación descendente de la activación del inflamasoma por inhibición oxidativa de la cascada inflamasoma-caspasa-1-interleucina-1β.20 La disminución de la producción de especies reactivas de oxígeno por neutrófilos CHIP que encontramos podría, por lo tanto, contribuir a una activación sobreactuante del inflamasoma y, por lo tanto, afectar la patogénesis de los VAA. Clínicamente, encontramos menos manifestaciones renales y neuronales en pacientes con CHIP, lo que respalda la idea de que el CHIP funciona como modificador de la enfermedad en el AVA.

En el análisis longitudinal, más del 25% de los pacientes mostraron un aumento en el tamaño de los clones a lo largo del tiempo sin ningún impacto significativo de un tratamiento específico en la expansión de los clones. La frecuencia de CHIP no aumentó en pacientes tratados previamente con agentes inmunosupresores/citotóxicos y no se enriqueció para mutaciones implicadas en la respuesta al daño del ADN (Tabla Suplementaria en Línea S11). Por lo tanto, parece poco probable que la alta prevalencia de CHIP sea simplemente una consecuencia del tratamiento citotóxico y, junto con la expansión del tamaño de los clones, justifique una vigilancia más estrecha de los pacientes con VAA afectados debido al riesgo conocido de progresión a síndromes mielodisplásicos o leucemia mieloide aguda.1513

Colectivamente, nuestros datos revelan una nueva asociación de AAV con CHIP con efectos potencialmente modificadores de la enfermedad, como se muestra en la activación de neutrófilos, la regulación de la transcripción de autoantígenos y la manifestación de órganos. Reconocemos que, dadas las múltiples pruebas, los valores de P no representan el error global de tipo I. Estudios e investigaciones funcionales futuros están ahora justificados para confirmar estos resultados y descifrar los mecanismos moleculares.

Genovese G, Kahler AK, Handsaker RE. Hematopoyesis clonal y riesgo de cáncer de sangre inferido de la secuencia de ADN sanguíneo. N Engl J Med. 2014; 371(26):2477-2487. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1056 / NEJMoa1409405Google Scholar
Steensma DP, Bejar R, Jaiswal S. Hematopoyesis clonal de potencial indeterminado y su distinción de los síndromes mielodisplásicos. Sangre. 2015; 126(1):9-16. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1182 / sangre-2015-03-631747Google Scholar
Buscarlet M, Provost S, Zada YF. DNMT3A y TET2 dominan la hematopoyesis clonal y demuestran fenotipos benignos y diferentes predisposiciones genéticas. Sangre. 2017; 130(6):753-762. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1182 / sangre-2017-04-777029Google Scholar
Arends CM, Galan-Sousa J, Hoyer K. Distribución del linaje hematopoyético y dinámica evolutiva de la hematopoyesis clonal. Leucemia. 2018; 32(9):1908-1919. PubMedhttps://doi.org/10.1038/s41375-018-0047-7Google Scholar
Jaiswal S, Natarajan P, Silver AJ. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. N Engl J Med. 2017; 377(2):111-121. PubMedhttps://doi.org/10.1056/NEJMoa1701719Google Scholar
Fuster JJ, MacLauchlan S, Zuriaga MA. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 2017; 355(6327):842-847. PubMedhttps://doi.org/10.1126/science.aag1381Google Scholar
Frick M, Chan W, Arends CM. Papel de la hematopoyesis clonal del donante en el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. J Clin Oncol. 2019; 37(5):375-385. PubMedGoogle Scholar
Savola P, Lundgren S, Keranen MAI. Hematopoyesis Clonal en pacientes con artritis reumatoide. Cáncer de sangre J. 2018; 8(8):69. Google Scholar
Ciavatta DJ, Yang J, Preston GA. Base epigenética para la regulación ascendente aberrante de genes autoantígenos en humanos con vasculitis ANCA. J Clin Invest. 2010; 120(9):3209-3219. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1172 / JCI40034Google Scholar
Jones BE, Yang J, Muthigi A. Gene-specific DNA methylation changes predict remission in patients with ANCA-associated vasculitis. J Am Soc Nephrol. 2017; 28(4):1175-1187. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2016050548Google Scholar
McInnis EA, Badhwar AK, Muthigi A. Dysregulation of autoantigen genes in ANCA-associated vasculitis involves alternative transcripts and new protein synthesis. J Am Soc Nephrol. 2015; 26(2):390-399. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2013101092Google Scholar
Coombs CC, Zehir A, Devlin SM. La hematopoyesis clonal relacionada con el tratamiento en pacientes con cánceres no hematológicos es común y se relaciona con desenlaces clínicos adversos. Célula Madre. 2017; 21(3):374-382.e4. PubMedhttps://doi.org / 10.1016 / j.stem.2017.07.010 Google Scholar
Desai P, Mencía-Trinchant N, Savenkov O. Las mutaciones somáticas preceden a la leucemia mieloide aguda años antes del diagnóstico. Nat Med. 2018; 24(7):1015-1023. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1038 / s41591-018-0081-zGoogle Scholar
Gibson CJ, Lindsley RC, Tchekmedyian V. Hematopoyesis clonal relacionada con desenlaces adversos después de un trasplante autólogo de células madre para linfoma. J Clin Oncol. 2017; 35(14):1598-1605. PubMedGoogle Scholar
Abelson S, Collord G, Ng SWK. Predicción del riesgo de leucemia mieloide aguda en individuos sanos. Naturaleza. 2018; 559(7714):400-404. Google Scholar
Christen F, Hoyer K, Yoshida K. Genomic landscape and clonal evolution of acute myeloid leukemia with t(8; 21): an international study on 331 patients. Sangre. 2019; 133(10):1140-1151. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1182 / sangre-2018-05-852822Google Scholar
Damm F, Mylonas E, Cosson A. Mutaciones iniciadoras adquiridas en células hematopoyéticas tempranas de pacientes con LLC. Cáncer Discov. 2014; 4(9):1088-1101. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1158 / 2159-8290.CD-14-0104Google Scholar
Yoshizato T, Dumitriu B, Hosokawa K. Mutaciones somáticas y hematopoyesis clonal en anemia aplásica. N Engl J Med. 2015; 373(1):35-47. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1056 / NEJMoa1414799Google Scholar
Sallman DA, Lista A. El papel central de la señalización inflamatoria en la patogénesis de los síndromes mielodisplásicos. Sangre. 2019; 133(10):1039-1048. PubMedhttps://doi.org/10.1182/blood-2018-10-844654Google Scholar
Schreiber A, Luft FC, Kettritz R. Phagocyte NADPH oxidase restrains the inflammasome in ANCA-induced GN. J Am Soc Nephrol. 2015; 26(2):411-424. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2013111177Google Scholar

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