Fronteras en Fisiología

Introducción

La familia de proteínas de unión estrecha es crucial para la fisiología celular, ya que la falta o el deterioro se asocian con enfermedades y disfunción de muchos órganos y tejidos, como se muestra, por ejemplo, en el oído interno (Wilcox et al., 2001; Florian et al., 2003), riñón (Konrad et al., 2006; Günzel et al., 2009), tracto gastrointestinal (Resnick et al., 2005; Amasheh et al., 2009), epidermis (Furuse et al., 2002; Tebbe et al., 2002), y los capilares cerebrales (Nitta et al., 2003; Wolburg et al., 2003). Las claudinas representan una familia de proteínas transmembrana que comprende al menos 27 miembros (Mineta et al., 2011). Además de sus cuatro dominios de hélice transmembrana, contienen dos bucles extracelulares (ECL1 y ECL2), un corto terminal N y un terminal C (Suzuki et al., 2014). Los patrones específicos de expresión de claudina determinan y reflejan la permeabilidad selectiva de los epitelios, y la capacidad de las proteínas de claudina para interactuar en cis (dentro de la misma membrana) y en trans (entre las membranas de la célula vecina) permite la formación de barreras formadoras y de poros formando hebras de unión apretadas (Van Itallie y Anderson, 2006).

La claudina – 5 se expresa fuertemente en endotelia capilar y domina la unión estrecha (TJ) de la barrera hematoencefálica (BBB), ya que la expresión es >100 veces mayor en comparación con cualquier otra claudina (Ohtsuki et al., 2007). Además, se expresa en una variedad de tejidos epiteliales, incluidos los pulmonares (Soini, 2011), los tejidos exocrinos (Comper et al., 2009), intestinal (García-Hernández et al., 2017) y del tracto urinario (Koda et al., 2011). Sin embargo, la claudina-5 causa una barrera más fuerte en los capilares cerebrales que en otros tejidos (Reinhold y Rittner, 2017) y su función se ve afectada en trastornos neurodegenerativos y neuroinflamatorios (Greene et al., 2019). Por lo tanto, claudin-5 es crucial para mantener la acreditación. Pero la BBB no solo es protectora, sino que también limita las opciones terapéuticas, ya que los medicamentos no pueden penetrar esta barrera.

Nitta et al. (2003) informaron que el BBB es más permeable a moléculas de 800 Da de tamaño en ratones deficientes en claudina-5 en comparación con ratones de tipo salvaje (Nitta et al., 2003). Esto fue de acuerdo con los experimentos de transfección que demostraron un efecto de sellado de claudina-5 en monocapas de células Caco-2 (Amasheh et al., 2005).

Otra claudina formadora de barreras importante es la claudina-3, que se ha informado sella selectivamente la barrera contra el paso de iones de carga y solutos sin carga (Milatz et al., 2010). También se expresa en la unión endotelial estrecha de los capilares cerebrales y su pérdida funcional se observa en fases de inflamación del microvaso, glioblastoma y plexo coroideo de pacientes con esclerosis múltiple (Engelhardt et al., 2001; Wolburg et al., 2003).

Las propiedades de barrera se pueden modificar dinámicamente, p. ej., se demostró que la incubación con caprato de sodio disminuye de forma rápida y reversible la resistencia eléctrica transepitelial en la línea celular intestinal humana HT-29/B6 (Krug et al., 2013). El caprato de sodio abre transitoriamente barreras que contienen claudina-5 en uniones estrechas de células epiteliales y endoteliales (Del Vecchio et al., 2012).

Esto indica que claudin – 5 es un objetivo prometedor para la mejora de la administración de medicamentos en la BBB.

En este estudio, nuestro objetivo fue emplear el sistema de expresión heteróloga de ovocitos Xenopus laevis (Vitzthum et al., 2019) para el análisis de la interacción y pertubación de claudina-5 y claudina-3. Debido a la falta de contactos celulares endógenos, este sistema de expresión unicelular permite el análisis de claudinas específicas sin interferencia de otras proteínas de unión estrecha.

Materiales y Métodos

Se recolectaron Ovocitos y Microinyección de ARN

Ovocitos de ranas africanas adultas por laparotomía quirúrgica. Para la anastesia, 0.Se utilizó MS222 al 2% (metanosulfonato de 3-aminobenzoato de etilo, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) como solución de baño durante 5-10 minutos a 20°C. Una vez alcanzada la anastesia quirúrgica, se hicieron incisiones en la piel y el músculo abdominal, se exteriorizó la masa ovárica y se extirpó tejido ovárico. El aislamiento de ovocitos se llevó a cabo mediante digestión enzimática a temperatura ambiente durante 90 min en 1,5 mg/ml de colagenasa Fisher BioReagents BP2649-1 (Fisher Scientific, Schwerte, Alemania) disuelta en solución de timbre de ovocitos (ORi), según lo descrito por Vitzthum et al. (2019). Las células foliculares se eliminaron por incubación en ORi libres de Ca2 + que contenían (en mm): NaCl (90), KCl (1), EGTA (ácido tetraacético trietilenglicol diamina) (1), 5 HEPES (5); pH 7,4 durante 10 min en un agitador mecánico a 50 rpm. Se inyectaron ovocitos de estadios V y VI (>1000 µm) (Nanolitro 2010, World Precision Instruments, Sarasota, FL, Estados Unidos) con 1 ng de ARN que codificaba claudina-5 humana, claudina-3 o agua libre de RNasa como controles. El volumen de inyección fue de 50,6 nl por ovocito. Después de la inyección, los ovocitos se incubaron a 16°C durante 3 días para la expresión de proteínas.

Aislamiento de Fracciones de Membrana e Inmunobloque

Se agruparon diez ovocitos inyectados para análisis de western blot y se resuspendieron en tampón de homogeneización de 500 µl que contenía (en mM) MgCl2 (5), NaH2PO4 (5), EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) (1), sacarosa (80) y Tris (Tris(hidroximetil)aminometano) (20); pH 7.4. Los extractos de ovocitos se centrifugaron dos veces a 200 rpm durante 10 minutos a 4 ° C para desechar los restos celulares. El sobrenadante se centrifugó a 13.000 rpm durante 30 min a 4 ° C para pelletear la membrana celular, tal como lo describen Leduc-Nadeau et al. (2007). Los gránulos se resuspendieron en tampón de homogeneización de 80 µl. La cuantificación de proteínas se realizó colorimétricamente utilizando el Kit de Ensayo de Proteínas Pierce de 600 nm (Thermo Fisher Scientific, Hennigsdorf, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en una placa de 96 pocillos. El lector de placas (Lector de Placas Multimodo PerkinElmer EnSpire, Waltham, MA, Estados Unidos) se ajustó a 562 nm y se empleó el Estándar de Albúmina Sérica Bovina (Thermo Fisher Scientific, Hennigsdorf, Alemania) de 125 a 2000 µg/ml para la evaluación. Antes de la inmunoblocción, las muestras se mezclaron con tampón 4× Laemmli (Laboratorios Bio-Rad, Múnich, Alemania), se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS al 10% y se electroforizaron. Para la transferencia de proteínas, se utilizaron membranas de PVDF y se bloquearon en leche seca descremada al 5% en solución salina tamponada Tris durante 120 min. Las proteínas se detectaron mediante inmunoblocción utilizando anticuerpos primarios elevados contra claudina – 3 o claudina-5 (invitrogen #35-2500, #34-1700, #34-1600, Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos).

Se utilizaron anticuerpos conjugados con peroxidasa contra conejos y ratones de cabra (#7074, #7076 Cell Signaling Technology, Danvers, MA, Estados Unidos) para unirse a los anticuerpos primarios y, por lo tanto, incubarse durante un mínimo de 45 minutos a temperatura ambiente. Para la detección, se utilizó el sustrato Clarity Western ECL (#1705061, Bio-Rad Laboratories GmbH, Múnich, Alemania) y se visualizaron las señales mediante un sistema ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories).

Inmunohistoquímica

Los ovocitos inyectados se fijaron en un 4% de PFA (16% de paraformaldehído, E15700, Science Service, Múnich, Alemania) durante 4 horas a temperatura ambiente, seguido de un gradiente de deshidratación del 70% de etanol al xilol (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) en 48 horas. Las muestras se incrustaron en parafina y se seccionaron (5 µm) utilizando un microtomo Leica RM 2245 (Leica Microsystems Heidelberg, Alemania). Poco antes del tratamiento inmunohistoquímico, la parafina se eliminó a través del gradiente de xilol a etanol. Los puntos de unión inespecíficos se bloquearon utilizando suero de cabra al 5% en solución salina tamponada con fosfato y se incubaron con los mismos anticuerpos primarios que para la inmunoblocción. Las muestras se incubaron con los anticuerpos secundarios Alexa Fluor – 488 goat anti-rabbit y Alexa Fluor-594 goat anti-mouse (Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y se examinaron mediante microscopía de inmunofluorescencia de barrido láser confocal (LSM 710, Zeiss, Oberkochen, Alemania).

Microscopía electrónica de fractura por congelación

La microscopía electrónica de fractura por congelación se realizó como se informó recientemente (Greene et al., 2019). Para la fijación, los ovocitos inyectados se incubaron en glutaraldehído (2,5% en tampón de cacodilato de 0,1 M) durante la noche a 4°C. Después del lavado con tampón de cacodilato, los ovocitos se prepararon para la fractura por congelación. Las muestras se crioprotegieron en glicerol al 30% y se congelaron en nitrógeno líquido. Después de fracturarse y sombrearse con platino y carbono (BAF400D; Balzers, Liechtenstein), el material orgánico restante se eliminó mediante un lavado de hipoclorito de sodio. Los ovocitos se analizaron en un microscopio electrónico de transmisión (EM-10, Zeiss, Oberkochen, Alemania) y se fotografiaron con una cámara digital (Tröndle GmbH). El análisis morfométrico de los hilos de unión apretados se realizó con un aumento de 20.000×.

Ensayo de Ovocitos emparejados y Cuantificación de Áreas de Contacto

El manitol se implementó para reducir el tamaño de los ovocitos inyectados y permitir la extracción mecánica de la membrana vitelina con fórceps sin dañar la membrana plasmática. se colocaron de 5 a 10 ovocitos en una placa de petri (35 mm de diámetro, Thermo Fisher, Henningsdorf, Alemania, #153066) llena de ORi. Se añadió manitol y se disolvió hasta lograr una contracción hipertónica de las células (aproximadamente 400 mOsmol/l durante 10 min). Tras la desvitelinización manual, los ovocitos se transfirieron inmediatamente a una placa de 24 pocillos (1. 86 cm2 de superficie, TPP Techno Plastic Products, Trasadingen, Suiza, # 92024) que contienen 2 ml de ORi. En cada pozo, dos células se agruparon suavemente empujándolas juntas con una pipeta Pasteur (1 ml, Thermo Fisher, Henningsdorf, Alemania, #PP88SB) y una sonda bulbosa.

Los pares de ovocitos con expresión de claudina-5 (cldn5-cldn5), expresión de claudina − 3 (cldn3-cldn3), coexpresación de claudina-3 y claudina − 5 (cldn3,5-cldn3,5) y ovocitos de control (control-control) se mantuvieron juntos hasta 48 h en ORi a 16°C.

se empleó para cuantificar el área de contacto de ovocitos agrupados después de 1, 24 y 48 h. En estos momentos se tomaron imágenes de pares de ovocitos naïve en platos de cultivo de 24 pocillos utilizando un microscopio Leica DMI6000 B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). El diámetro del área de contacto se midió utilizando la escala de micrones (LAS-AF 3.2.0). Las áreas de contacto se consideran circulares y, por lo tanto, el área de contacto se calculó utilizando la ecuación circular A=π∙r2.

Ensayo de Impulso de presión hidrostática

Las membranas de vitelina se eliminaron mecánicamente como se describió anteriormente y los ovocitos se agruparon de forma analágica en el ensayo de ovocitos emparejados. Además, se probaron pares mixtos de ovocitos (control–cldn5 y control–cldn3) en el ensayo de impulso de presión hidrostática (HPI). Después de 24 h de estabilización, se creó un impulso hidrostático definido utilizando una pipeta electrónica de un solo canal (EE-300R, Eppendorf Research Pro, versión de software 2.06.00, Hamburgo, Alemania).

Los ovocitos se mantuvieron en placas de 24 pocillos que contenían 2 ml de ORi y se comprobó la posición central antes de la aplicación del volumen de pipeteo de 250 µl de ORi. La velocidad de dispensación se ajustó uniformemente a la velocidad máxima, lo que equivale a una velocidad de dispensación de 0,9 s. Además, el ángulo (45°) y la distancia de aplicación (∼1,3 cm) se aplicaron uniformemente. La presión ambiental, la viscosidad de los ORi y el diámetro de la abertura de la punta de la pipeta se mantuvieron en condiciones constantes. Se empleó microscopía de campo brillante para cuantificar las áreas de contacto 30 min después de aplicar la presión hidrostática y compararlas con las áreas de contacto antes de la aplicación. La configuración experimental se describe en la Figura 1.FIGURA

Incubación de caprato

Para la incubación de caprato, se añadió caprato sódico (#C4151, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en concentraciones finales de 50, 100 y 500 µM, u ORi como grupo de referencia, a los ovocitos 24 h después del emparejamiento. Los ovocitos se mantuvieron en 24 placas de pocillos que contenían 2 ml de ORi y la solución de caprato se disolvió en un volumen de adición definido de 250 µl de ORi por pocillo. El ancho del área de contacto se cuantificó a los 30, 60 y 120 minutos después de la adición.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con JMP Pro 14.0.0 (NC, Estados Unidos). Los datos se presentan como medianas y se muestran como cambios porcentuales basados en la combinación agrupada en los primeros puntos de examen. Las figuras 4 y 5 se presentan como gráficos de caja, que representan el primer cuartil (25%), la mediana (50%) y el segundo cuartil (75%). Los bigotes se dibujan hacia abajo hasta el percentil 10 y hasta el percentil 90. Se comprobó la distribución normal mediante la prueba de Shapiro-Wilk.

Se utilizó la prueba de Kruskal–Wallis para la comparación múltiple, seguida de una corrección de Dunn-Bonferroni. los valores de p se dan como números continuos.

Resultados

Expresión de Claudin-5 e Integración en X. membrana Plasmática de Ovocitos de laevis

Para probar la expresión e integración exitosas de la proteína de unión apretada claudina-5 en la membrana plasmática de ovocitos, 3 días después de la inyección de claudina-5 cRNA, se analizaron fracciones de membrana mediante inmunoblotaje. Todas las muestras de tres animales individuales (d1–d3) revelaron señales específicas de claudina-5 a 23 kDa, mientras que los ovocitos inyectados con agua libre de RNasa no mostraron señales específicas para la expresión de claudina-5 (Figura 2A).FIGURA

Para la visualización de las proteínas expresadas dentro de la membrana plasmática, se realizaron tinciones inmunohistoquímicas y se analizaron mediante microscopía de escaneo láser confocal (Figura 2B). Se detectaron señales específicas y se distribuyeron uniformemente por toda la membrana plasmática de los ovocitos que expresaban claudina-5. De acuerdo con los inmunoblots, no se detectaron señales específicas en las membranas plasmáticas de los ovocitos de control.

Así, después de la inyección de cRNA, la claudina-5 se expresó con éxito e integró en la membrana plasmática de los ovocitos de X. laevis.

La coexpresión de claudina-3 y claudina-5 en pares de ovocitos reveló señales específicas para claudina-5 (roja) y claudina-3 (verde) en ambas células (Figura 2C). Las membranas plasmáticas de los ovocitos mostraron una fusión de las células vecinas proporcionada por la interacción directa cldn3, 5-cldn3, 5 (amarillo).

Se ven parches de Hebras de Unión Estrecha en Ovocitos que Expresan Claudina-5

Se analizaron membranas plasmáticas de ovocitos y la visualización de hebras de unión estrecha fue exitosa (Figura 3). La microscopía electrónica de fractura por congelación mostró parches de morfología de hebras en las membranas plasmáticas de ovocitos inyectados con claudina-5, y la organización de hebras de ovocitos que expresan claudina-5 fue altamente organizada y de forma angular (Figura 3A). Las hebras de unión apretadas se detectaron principalmente en la cara protoplasmática (P-) de la membrana. Los ovocitos inyectados con Claudina-3 mostraron hebras de unión apretadas redondeadas y altamente organizadas, como se informó anteriormente (Vitzthum et al., 2019; Figura 3B). La microscopía electrónica de fractura por congelación de los ovocitos coexpresores de claudina-3 y claudina-5 reveló fibrillas que tienen propiedades de claudina-3 y claudina-5. La arquitectura de la hebra fibrilar de los ovocitos coexpresores apareció redondeada y compleja como ovocitos que expresan claudina – 3, pero también discontinua y más angulada como se muestra para las células que expresan claudina-5 (Figura 3C). Los ovocitos de control tenían una superficie lisa típica (Figura 3D).FIGURA

Ensayo pareado de ovocitos para el Análisis de la Trans-Interacción de Claudina

Todas las combinaciones agrupadas mostraron un aumento dependiente del tiempo en el área de contacto durante el período de tiempo medido (Figura 4 y Tabla 1).CUADRO

El área de contacto de los ovocitos de control inyectados con agua aumentó al 129% después de 24 h y al 150% después de 48 h. Los pares agrupados de ovocitos que expresaban claudina – 3 también mostraron un aumento de las áreas de contacto al 147% (24 h) y al 162% (48 h). Pares agrupados de ovocitos coexpresores de claudina – 3 y claudina-5 mostraron áreas de contacto del 168% (24 h) y del 209% (48 h). Pares agrupados de ovocitos que expresaban claudina – 5 sola mostraron áreas de contacto del 120% (24 h) y del 127% (48 h). Por lo tanto, las áreas de contacto en todas las combinaciones probadas fueron comparables.

El Ensayo de Impulso de Presión Hidrostática Revela la Unión Específica de Claudina de Pares de Ovocitos

En un enfoque separado, los ovocitos que expresaban claudina-3 o claudina-5 o coexpresaban ambas claudinas se agruparon después de la desvitelinización mecánica. Los ovocitos se desafiaron utilizando un IPH y las áreas de contacto se midieron y calcularon 30 min después del desafío y se compararon con las áreas iniciales después del período de estabilización de 24 h (Figura 5 y Tabla 2). Después del desafío de presión hidrostática, el área de contacto de los ovocitos de control inyectados con agua disminuyó al 89%. Pares agrupados de ovocitos que expresaban claudina-5, claudina-3 o que coexpresaban claudina-3 y claudina-5 retuvieron áreas de contacto más grandes (97%, p = 0,0235; 96%, p = 0,003; 98%, p = 0,0253). Las áreas de contacto de los ovocitos de control inyectados con agua mezclada y los ovocitos que expresan claudina (control-cldn5 y control-cldn3) no difieren significativamente de los ovocitos de control (93%, p = 0,2900; 83%, p = 0,4455).CUADRO

Incubación Con Caprato

En un experimento piloto de incubación, se inyectaron ovocitos y se emparejaron en combinaciones que expresaban claudina-5 (cldn5–cldn5) o se inyectaron con agua libre de RNasa como controles (control–control). Se incubaron pares con concentraciones finales de caprato de sodio de 50, 100 o 500 µM. La incubación de pares de ovocitos con ORi sirvió como grupo de referencia. Los ovocitos se agruparon y después de 24 h de estabilización, se inició la incubación y se midieron los anchos de contacto 30, 60 y 120 min después de la adición (Figura suplementaria S1).

La adición de ORi dio lugar a una disminución inicial de las áreas de contacto tanto en pares de ovocitos que expresan claudina como en pares de ovocitos inyectados con agua que se dispersan 60 o 120 minutos después de la adición. Esto está delineado por la forma parabólica de la línea de conexión entre las áreas de contacto medianas a lo largo del tiempo (curvas rojas en la Figura Suplementaria S1). Sin embargo, la incubación con caprato de sodio de 100 y 500 µM aumentó las áreas de contacto ligeramente (100 µM) o fuertemente (500 µM) 30 minutos después de la adición de caprato de 5,1 × 105 a 5,2 × 105 µm2 y de 4,3 × 105 a 4,9 × 105 µm2.

Discusión

En el presente estudio, empleamos el modelo clásico para modelar transportadores y enfermedades humanas (Tammaro et al., 2009; Nenni et al., 2019), los ovocitos X. laevis, para un análisis en profundidad de la interacción de claudina-5 y la contribución funcional al sello de unión. Con este fin, se estableció un enfoque novedoso, la introducción de un IPH para la interacción desafiante dentro del área de contacto de ovocitos Xenopus agrupados.

Las claudinas Contribuyen a Propiedades de Adhesión más Fuertes

De acuerdo con los resultados anteriores de Vitzthum et al. (2019), las claudinas individuales expresadas en ovocitos no dieron lugar a un aumento de las áreas de contacto de interacción en comparación con los ovocitos de control. Sin embargo, la visualización inmunoblot e inmunohistoquímica demostró la expresión e integración exitosas en la membrana plasmática de ovocitos de X. laevis. Además, el uso de microscopía de escaneo láser confocal permitió una localización precisa de las claudinas expresadas en la membrana plasmática, ya que el agujero de alfiler bloqueaba la fluorescencia fuera de foco. No se buscó una cuantificación de las señales inmunohistoquímicas, ya que la afinidad de los anticuerpos para unirse a sus objetivos difiere.

Vedula et al. (2009) utilizaron una técnica de aspiración con micropipeta para investigar aspectos de la interacción claudina-claudina utilizando fibroblastos L transfectados con ocludina marcada con GFP, cldn-1 y cldn-2. La fuerza de separación necesaria para separar dos células entre sí era mayor en las células transfectadas cldn-1 y cldn-2 (∼2,8 y 2,3 nN, respectivamente). Aunque este enfoque podría parecer también prometedor para el análisis de interacción claudina-claudina de los ovocitos que expresan, las pruebas preliminares revelaron que un desprendimiento de ovocitos agrupados no es posible sin la interrupción de las membranas plasmáticas de los ovocitos.

Por lo tanto, como un enfoque novedoso, la fuerza de las conexiones se midió mediante un IPH. Aunque el IPH no proporciona una cuantificación de la fuerza de separación en valores absolutos (p. ej., en Newton), permite un análisis rápido y rentable de la interacción de claudina sin perturbar otras proteínas de unión apretada (p. ej., ocludina, tricelulina, mermelada-A). Las claudinas contribuyen a la unión de pares de ovocitos, ya que muestran un área de contacto más grande en comparación con los ovocitos inyectados con agua después del IPH. Esto indica una fuerte interacción trans homofílica entre las células que expresan claudina.

La arquitectura de fibras de hilo es específica para claudinas individuales (Colegio et al., 2002). En microscopía electrónica de fractura por congelación, se informó que claudin-3 ensamblaba una malla de hebras más redondeada en formas de bucle en ovocitos Xenopus (Vitzthum et al., 2019; Figura 3B) mientras que en nuestro estudio, claudin – 5 formó una malla más angular y ordenada en filas. Las imágenes revelaron que la proteína de unión apretada claudina-5 forma una malla de fibrillas en filas discontinuas de forma angular en ovocitos X. laevis. Esto está de acuerdo con las hebras de claudina-5 conocidas como cadenas de partículas asociadas a la fase P (Pionek et al., 2011). En nuestros experimentos, la forma geométrica de las fibrillas parecía no tener ningún efecto en las propiedades de adhesión de los ovocitos. De acuerdo con eso, se informó que la resistencia paracelular no estaba relacionada con el número de fibras y las propiedades formadoras de fibras (Colegio et al., 2002). Además, se ha demostrado que la claudina-3 y la claudina-5 tienen una capacidad similar para la trans-interacción homofílica en células HEK293 (Pionek et al., 2011).

Este modelo de ovocitos X. laevis, que expresa proteínas de unión única y apretada, permite observar el efecto de sustancias como el caprato de sodio en la formación de áreas de contacto entre ovocitos agrupados. Por lo tanto, puede proporcionar una herramienta útil para una detección eficiente de sustancias que afecten a la barrera de unión estrecha.

Las concentraciones de caprato de sodio de 100 y 500 µM pueden transmitir un efecto protector sobre los ovocitos que expresan claudina-5, lo que resulta en un aumento de las áreas de contacto después de 30 minutos de incubación.

Krug et al. (2013) demostraron que la incubación con caprato de sodio condujo a una disminución rápida y reversible de la resistencia transepitelial en la línea celular intestinal humana HT-29/B6. Además, la microscopía de escaneo láser confocal reveló una marcada reducción de claudina-5 en células HT-29/B6 tratadas con laurato de ácidos grasos de cadena media (Dittmann et al., 2014). El primer bucle extracelular de claudinas (ECL1) es importante para las propiedades de barrera de la unión estrecha, mientras que el segundo bucle extracelular (ECL2) está involucrado en la formación de cadenas de trans-interacción (Pionek et al., 2008; Rossa et al., 2014; Greene et al., 2019). Los aglutinantes de claudina – 5 dirigidos a ECL1 o ECL2 de claudina-5 pueden inducir la captación intracelular de la proteína de unión apretada, frustrando así las trans-interacciones de claudina-5 en el sello de unión apretada entre las células adyacentes y aflojando el espacio paracelular (Hashimoto et al., 2017).

Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la incubación con caprato de sodio conduciría a una disminución en el área de contacto de los ovocitos X. laevis expresados en claudina-5 agrupados. Inesperadamente, el aumento de las concentraciones de caprato de sodio (100 y 500 µM) condujo a un aumento de las áreas de contacto de ovocitos agrupados que expresaban claudina-5, lo que indica un efecto protector del caprato de sodio en el sellado de unión apretado. Además, se describe que el caprato de sodio induce la contracción del anillo perijuncional de actomiosina, ensanchando el espacio paracelular (Lindmark et al., 1998; Maher et al., 2009). Este efecto se basa en la fosforilación de la cadena ligera reguladora de la miosina a través de una activación de la fosfolipasa C que conduce a una escisión del fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) en trifosfato de inositol (IP3) y diacilglicerol (Tomita et al., 1995). El complejo de unión apretada unido por la proteína de andamiaje ZO-1 al citoesqueleto de actina se redistribuye desde la unión apretada al citoplasma (Lindmark et al., 1998; Turner, 2000). La citoarquitectura del ovocito de X. laevis es crucial para la regionalización citoplasmática durante la ovogénesis (Wylie et al., 1985). Sin embargo, antes de la fertilización, la expresión del gen tjp-1, el gen que codifica para ZO-1 solo se expresa 1,9 TPM en los estadios V–VI de los ovocitos (Session et al., 2016). Por lo tanto, una interacción reducida de las claudinas con el armazón citoesquelético puede explicar el resultado inesperado de la incubación de capratos. Es el alcance de futuros estudios para verificar la base mecanicista del hallazgo.

Sin embargo, un efecto variante del caprato de sodio sobre la permeabilidad paracelular se describió en la literatura anterior. En el tejido del parche de Peyer extraído del intestino de cerdos adultos, se detectó un efecto de fortalecimiento similar. Claudin-5 se incrementó significativamente después de la incubación con caprato de 5 mm. En este estudio, el caprato condujo a una resistencia eléctrica transepitelial (TEER) significativamente mayor en el epitelio asociado al folículo (Radloff et al., 2019).

Conclusión

En conclusión, expresión heteróloga de la proteína de unión apretada claudina-5 en X. los ovocitos de laevis permiten nuevos conocimientos sobre la contribución de las claudinas individuales a la interacción celular y las propiedades de adhesión de las células adyacentes. Por lo tanto, el uso del modelo de unión estrecha X. laevis para claudin-5 permite el análisis de componentes BBB en un modelo de una sola célula.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos generados para este estudio están disponibles a petición del autor correspondiente.

Declaración ética

Los tratamientos para animales se ajustaron a las directrices de la legislación alemana, con la aprobación del responsable de bienestar animal de la Freie Universität Berlin y bajo la dirección de la Inspección Veterinaria de Salud de Berlín (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, permiso G0025/16).

Contribuciones de los autores

Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito. NB y SA diseñaron, planificaron y supervisaron los experimentos y escribieron el manuscrito. NB, LS, VC, RK y PF-B realizaron los experimentos y el análisis de datos.

Financiación

Este estudio fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft, Grant No. AM141/11-1 y la Fundación H. Wilhelm Schaumann.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un conflicto de intereses potencial.

Agradecimientos

Agradecemos a Martin Grunau, Gisela Manz, Katharina Söllig y Susanne Trappe por su excelente asistencia técnica. Agradecemos el apoyo de la Iniciativa de Publicación de Acceso Abierto de la Freie Universität Berlin.

Material suplementario

El Material Suplementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2020.00857/full#supplementary-material

FIGURA S1 / Áreas de contacto de claudina-5 que expresan pares de ovocitos en µm2 durante la incubación con caprato de sodio en diferentes concentraciones (n = 6-8, respectivamente) y ovocitos inyectados en agua como controles (n = 5-7, respectivamente).