Ensayos simplificados de ChIP-exo

Anticuerpos

IgG de conejo (Sigma) conjugado con Dynabeads se utilizó contra cepas marcadas con TAP en las que el objetivo era la proteína A que contenía el TAP-tag. Se utilizó anticuerpo miliporo 07-729 contra muestras de K562 dirigidas a CTCF.

Purificación de Tn5

Se ordenó una construcción personalizada de Tn5 E54K E110K P242A L372P14 en un vector pET-45b ( + ) (GenScript) para expresar Tn5 hiperactiva con una etiqueta His6 de terminal N. El plásmido está disponible en Addgene (Addgene ID: 112112). Se transformaron células de E. coli competentes BL21(DE3) (Biolabs de Nueva Inglaterra) y se cultivó una sola colonia a 37 °C a un OD600 de 0,4 en 500 ml de LB + 50 µg/ml ampicilina + 30 µg/ml de cloranfenicol. Las células fueron transferidas a una incubadora a 25 ° C e inducidas con isopropil-β-D-galactopiranósido de 0,5 mm durante 4 h. Las células se recolectaron por centrifugación, se lavaron una vez con tampón ST y el pellet celular se congeló en forma instantánea en nitrógeno líquido.

La Tn5 se purificó como se describió previamente10, con pocas modificaciones. Brevemente, las células se resuspendieron en 10 volúmenes (ml/g) de tampón TEGX100 (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerol, 0,1% Tritón-X 100) que contenían IPC y fluoruro de fenilmetilsulfonilo de 100 µM y se lisaron mediante incubación con lisozima (Sigma; 1 mg / 1 g de pellet celular) a temperatura ambiente durante 30 min. El lisado se centrifugó a 20.000 × g durante 20 minutos a 4 °C, y el sobrenadante se precipitó con 0,25% de polietilenimina (Sigma) y se centrifugó a 10.000 × g durante 15 minutos. El sobrenadante se precipitó con sulfato de amonio de saturación al 47% (0.28 g/ml) durante una incubación de 30 minutos, y luego centrifugado a 20.000 × g durante 15 minutos.

El pellet se resuspendió en 50 ml de Tampón de Carga de Afinidad de Níquel (fosfato potásico de 50 mM, pH 7,4, KCl de 50 mM, glicerol al 20%) y se cargó en una columna HisTrap HP (GE Healthcare; 5 ml) a 1,5 ml/min equilibrada con el mismo tampón. La columna se lavó secuencialmente con Tampón de Lavado I (fosfato potásico de 50 mM, pH 7,4, 1 M KCl, imidazol de 50 mM, glicerol al 20%), Tampón de lavado II (fosfato potásico de 50 mM, pH 7.4, 500 mm KCl, 50 mM imidazol, 20% glicerol), y luego se eluyó Tn5 con Tampón de Elución de Afinidad de níquel (fosfato potásico de 50 mM, pH 7,4, 500 mM KCl, 500 mM imidazol, 20% glicerol) a 2 ml/min. El eluato se diluyó a 300 mm KCl con Tampón de Dilución (fosfato de potasio de 50 mM, pH 7,4, 20% de glicerol), y el volumen final se ajustó a 50 ml con tampón TEGX300 (Tris-HCl de 20 mM, pH 7,5, NaCl de 300 mM, EDTA de 1 mM, glicerol de 10%, Tritón-X 100 de 0,1%).

A continuación, la muestra se cargó en una columna HiTrap Heparina HP (GE Healthcare; 1 ml) equilibrada con TEGX300 a 1 ml/min. Después del lavado con volúmenes de 5 columnas de tampón, se ejecutó un gradiente de NaCl lineal de 10 ml (300 mm a 1,2 m) para eluir. Tn5 eluido de la columna a aproximadamente 600 mm de NaCl. Las fracciones que contenían el pico de elución principal se combinaron (3,5 ml) y se dializaron durante la noche contra Tampón TEGX300 que contenía un 30% de glicerol, y luego se almacenaron a -80 °C.

Preparado de cromatina de levadura

Las cepas Saccharomyces cerevisiae (Open Biosystems) marcadas con GRIFO se cultivaron en 500 ml de medio de levadura peptona dextrosa hasta un OD600 = 0,8 a 25 °C. Las células se entrecruzaron con formaldehído a una concentración final del 1% durante 15 minutos a temperatura ambiente, y se apagaron con una concentración final de glicina de 125 mm durante 5 minutos. Las células se recogieron por centrifugación y se lavaron en 1 ml de tampón ST (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) a 4 °C y se dividieron en dos alícuotas. Las células se pelaron de nuevo, se eliminó el sobrenadante y el pellet se congeló instantáneamente.

Se lisó una alícuota de cultivo de 250 ml en 750 µl de Tampón de Lisis FA (50 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, Tritón al 1%, 0.desoxicolato de sodio al 1% e IPC) y 1 ml de volumen de perlas de circonia/sílice de 0,5 mm batiendo perlas en una máquina Mini Beadbeater-96 (Biospec) durante tres ciclos de 3 minutos de encendido/5 minutos de apagado (las muestras se mantuvieron en hielo durante el ciclo de apagado). El lisado se transfirió a un tubo nuevo y se microcentrificó a velocidad máxima durante 3 minutos a 4 ° C para pelletear la cromatina. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 750 µl de Tampón de Lisis FA suplementado con SDS al 0,1% y transferido a un tubo cónico de poliestireno de 15 ml. La muestra se sonicó en un Bioruptor (Diagenode) durante 15 ciclos con intervalos de encendido/apagado de 30 s para obtener fragmentos de ADN de 100 a 500 pb de tamaño. Un ensayo ChIP-exo procesó el equivalente a un cultivo celular de 50 ml (~6 × 108 células). Esto representa una cantidad conveniente en lugar de una cantidad mínima necesaria.

Preparado de cromatina K562

Las células de leucemia mielógena crónica humana (K562, ATCC) se mantuvieron entre 1 × 105 y 1 × 106 células/ml en medios DMEM suplementados con suero fetal bovino al 10% a 37 °C con 5% de CO2. Las células se lavaron con PBS (Na2HPO4 de 8 mm, KH2PO4 de 2 mM, NaCl de 150 mM y KCl de 2,7 mm), luego se reticularon con formaldehído a una concentración final de 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente y se apagaron con una concentración final de glicina de 125 mm durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en 1 ml de SB para lavar. Las células fueron alícuotas para contener 100 millones de células, centrifugadas, se eliminó el sobrenadante y el pellet se congeló instantáneamente.

Se lisó una alícuota de 100 millones de células (para uso en chips múltiples) en 500 µl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0.5% de NP40 e inhibidor completo de la proteasa (IPC, Roche) incubando en hielo durante 10 min. El lisado se microcentrifugó a 2500 rpm durante 5 min a 4 °C. Se retiró el sobrenadante, se resuspendió el pellet en 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,32% SDS e IPC) y se incubó en hielo durante 10 min para lisar los núcleos. La muestra se diluyó con 600 µl de tampón de dilución de inmunoprecipitación (Tampón de Dilución IP: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 e IPC) hasta una concentración final de (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-X 100, 0.2% de SDS e IPC), y sonicado con un Bioruptor (Diagenode) durante 10 ciclos con intervalos de encendido/apagado de 30 s para obtener fragmentos de ADN de 100 a 500 pb de tamaño.

Preparación de tejido de ratón

El Dr. Yanming Wang proporcionó generosamente tejidos de cerebro, pulmón, hígado y riñón de ratón macho de 16 semanas de edad.Los tejidos de ratón se procesaron a 100 mg y se generó cromatina como se describió previamente21 con modificaciones menores. En resumen, se picaron 100 mg de tejido de ratón en trozos sobre hielo, se fijaron con formaldehído al 1% durante 10 minutos y luego se apagaron con una concentración final de glicina de 125 mm durante 5 minutos. Las células se hilaron, se lavaron con PBS y luego se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis de células de Farnham frío (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 e IPC). Las células se incubaron en un rototor durante 20 minutos a 4 C. Los núcleos aislados se aislaron por hilado y resuspendido en tampón de lisis nuclear RIPA (1 × PBS, 1% NP-40, 0,5% nadeoxicolato, 0,5% SDS e IPC). Los núcleos se sonicaron con un Bioruptor (Diagenode) durante 10 ciclos con intervalos de encendido/apagado de 30 s para generar ADN en el rango de tamaño de 100-500 bp. El número de células hepáticas se estimó como se describió previamente22, utilizando un factor de conversión de 1 mg de peso húmedo del tejido equivale a ~250.000 células.

Inmunoprecipitación de cromatina

Se diluyó a 200 µl con tampón de dilución IP un equivalente de cultivo de 50 ml de levadura o equivalente de 10 millones de células de cromatina K562 y se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo apropiado. Se añadió un volumen de lecho de 10 µl de cabezales de IgG-Dynabeads a las muestras de levadura; y se añadieron 3 µg de anticuerpo anti-CTCF con un equivalente de 10 µl de purín de proteína A Mag Sepharosa (GE Healthcare) a las muestras de K562.

ChIP-exo 1.1

ChIP-exo 1.1 se realizó previamente described7,8,23. En resumen, se llevaron a cabo los siguientes pasos enzimáticos con cromatina inmunoprecipitada aún en la resina con múltiples lavados de sal entre cada paso: Pulido final de polimerasa de ADN T4, polinucleótido quinasa T4, fragmento de cola A de Klenow, ligadura de adaptador Read_2 mediada por ADN ligasa T4, relleno de polimerasa de ADN phi29, segunda polinucleótido quinasa T4, digestión de exonucleasas lambda y digestión de exonucleasas RecJf. Después de la reticulación inversa nocturna y el tratamiento con proteinasa K, se llevaron a cabo los siguientes pasos en solución: extensión de cebador phi29, segundo fragmento de Klenow, ligadura de adaptador Read_1 mediada por ADN ligasa T4 y PCR.

ChIP-exo 3.0 y 3.1 (versión basada en etiquetas)

Después de la inmunoprecipitación, se llevaron a cabo los siguientes pasos en la resina. Para ensamblar la Transposasa, se incubó Tn5 en una Mezcla de Transposasa de 10 × que contenía los siguientes componentes y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente: Tn5 de 12,5 µM, glicerol al 50% y adaptador de 7,5 µM (NexA2/ME comp). Ver la Tabla suplementaria 1 para las secuencias de oligonucleótidos utilizadas en este estudio.

El material de viruta sobre resina se lavó secuencialmente con Tampón de Lisis FA, Tampón NaCl (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Tritón-X 100, 0.desoxicolato de sodio al 1%), Tampón LiCl (Tris-HCl de 100 mM, pH 8,0, LiCl de 500 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 1%) y Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C.

La reacción de marcado (30 µl) que contiene: Tris-HCl de 20 mM, pH 7,5, MgCl2 de 5 mM, dimetilformamida al 10% y 1 × La Mezcla de marcado del paso 1 (concentración final: 1,25 µM Tn5, 5% de glicerol, adaptador de 750 nM) se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Después de la incubación, la resina se lavó dos veces con tampón de clorhidrato de guanidina (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM clorhidrato de guanidina, 2 mM EDTA, 1% Tritón-X 100, 0.desoxicolato de sodio al 1%) durante 5 minutos a 37 °C, luego una vez con tampón LiCl y Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C.

La reacción de relleno (30 µl) que contiene: 10 U de polimerasa (NEB) phi29, 1 × tampón de reacción (NEB) phi29, 2 × (200 µg/ml) ASC y dNTPs de 165 µM se incubó durante 20 minutos a 30 A continuación, se lavó con 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0 a 4 °C. La reacción de cinasa (30 µl) que contenía: 10 U T4 PNK (NEB), 1 × Tampón de ADN Ligasa T4 (NEB) y 2 × ASC se incubó durante 15 minutos a 37 °C; luego se lavó con 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0 a 4 °C. La digestión de exonucleasas λ (100 µl) que contenía: Exonucleasa de 20 U λ (NEB), tampón de reacción de exonucleasa de 1 × λ (NEB), Tritón-X 100 al 0,1% y DMSO al 5% se incubó durante 30 minutos a 37 °C; luego se lavó con Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C. La digestión de exonucleasa RecJf (100 µl) contiene: exonucleasa RecJf de 75 U (NEB), NEBuffer 2 de 2×, Tritón-X 100 al 0,1%, y se incubó DMSO al 5% durante 30 min a 37 °C; luego se lavó con 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 a 4 °C.

Se eluyó ADN de la resina y se realizó un tratamiento de reticulación inversa y Proteinasa K (40 µl) que contenía: 30 µg de Proteinasa K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.EDTA de 5, 2 mM, NaCl de 200 mM y SDS al 0,5% incubados durante 16 h a 65 °C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se purificó con perlas magnéticas de ampura de Agencourt (Beckman Coulter) siguiendo las instrucciones del fabricante y utilizando un volumen de 1,8 × de suspensión de AMPura añadida al volumen de ADN (72 µl).La muestra se elutó de las ampollas en 10 µl de agua, y se realizaron los siguientes pasos enzimáticos en solución.

Ligadura de adaptador (versión 3.0): para la reacción de extensión de imprimación (volumen de reacción total 20 µl); a la muestra resuspendida se añadió 1 × tampón de reacción phi29, 2 × ASC, dNTPs de 100 µM y oligonucleótido de secuencia ME de 0,5 µM (total de 9 µl) y se incubó durante 5 minutos a 95 °C, luego 10 minutos a 45 °C para permitir que el tiempo oligo se recociera. La muestra se desplazó a 30 °C antes de agregar 10 U de polimerasa phi29 (1 µl) e incubar durante 20 minutos a 30 °C; luego durante 10 minutos a 65 °C para inactivarse, y se desplazó a 37 °C.

Para la reacción de cola A (volumen de reacción total 30 µl); a la reacción de extensión de cebador se le añadió un fragmento de Klenow de 10 U, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, dATP de 100 µM (total de 10 µl) y se incubó durante 30 min a 37 °C, luego durante 20 min a 75 °C para inactivarse, y se desplazó a 25 °C. Para la segunda reacción de ligasa de adaptador (volumen de reacción total de 40 µl); a la reacción de cola A se le añadió 2.000 U T4 de ADN ligasa (enzimática), 1 × Tampón de ligadura rápida NEBNext (NEB), adaptador de 375 nM (ExA1-58/13) e incubado durante 1 h a 25 °C.

Ligadura por férula (versión 3.1): para ligadura por adaptador (40 µl); al ADN resuspendido se añadió 1.200 U de ligasa de ADN T4, 1 × Tampón de ligasa de ADN T4, adaptador de 375 nM (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) y se incubó durante 1 h a 25 °C.

Ambas versiones 3.0 y 3.1: la reacción de ligadura se purificó con perlas de AMPura y se resuspendió en 15 µl de agua. La muestra fue amplificada a través de PCR. Para amplificación de PCR (volumen de reacción total de 40 µl); al ADN resuspendido se añadió 2 U de polimerasa de Arranque en caliente por fusión (Thermo scientific), 1 × Tampón HF por fusión (Thermo scientific), dNTPs de 200 µM, 500 nM cada imprimación (P1.3 y NexA2-iNN) y amplificado durante 18 ciclos (20 s a 98 °C de desnaturalización, 1 min a 52 °C de recocido y 1 min a 72 °C de extensión). Una cuarta parte de la reacción se amplificó durante seis ciclos adicionales (24 en total) y la presencia de bibliotecas se determinó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%.

Selección de tamaño: Los productos PCR de 200-500 pb se purificaron en gel a partir de un gel de agarosa al 2% utilizando el Kit de Extracción de gel QIAquick (Qiagen).

ChIP-exo 4.0 y 4.1 (versiones de ligadura de ADN de una sola hebra)

Después de la inmunoprecipitación, se llevaron a cabo los siguientes pasos en la resina. El material de viruta de la resina se lavó secuencialmente con Tampón de Lisis FA, Tampón NaCl, Tampón LiCl y Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C. La reacción de reparación final (50 µl) que contenía: Polimerasa de ADN (NEB) de 7,5 U T4, Polimerasa de ADN I (NEB) de 2,5 U, PNK de 25 U T4, Tampón de Ligasa de ADN de 1 × T4 y dNTPs de 390 µM se incubó durante 30 minutos a 12 °C; MM Tris-HCl, pH 8,0 a 4 °C. La digestión de exonucleasa λ (100 µl)que contenía: exonucleasa de 20 U λ, tampón de reacción de exonucleasa de 1 × λ, Tritón-X 100 al 0,1% y DMSO al 5% se incubó durante 30 minutos a 37 °C; luego se lavó con Tris-HCl de 10 mM, pH 8.0 a 4 °C. Digestión de exonucleasa RecJf (100 µl)que contiene: exonucleasa RecJf de 75 U, nebulizador 2 de 2×, Tritón-X 100 de 0,1% y swas DMSO de 5% incubados durante 30 minutos a 37 °C; luego lavados con Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C.

Ligadura del primer adaptador: ligadura de ADNss (versión 4.0, 40 µl): para la ligadura adaptadora, se incubó 1200 U de ligasa de ADN T4, Tampón de ADN Ligasa 1 × T4 y adaptador de cadena única de 375 nM (ExA1-58-N5) durante 1 h a 25 °C; luego se lavó con Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C.

Ligadura por férula (versión 4,1, 40 µl): Ligasa de ADN de 1200 U T4, Tampón de ADN Ligasa de 1 × T4 y adaptador de 375 nM (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) se incubó durante 1 h a 25 °C; luego se lavó con Tris-HCl de 10 mM, pH 8.0 a 4 °C.

Ambas versiones 4.0 y 4.1: Se eluyó ADN de la resina y se realizó un tratamiento de reticulación inversa y Proteinasa K (40 µl) que contienen: 30 µg de proteinasa K, 25 mm de Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM de EDTA, 200 mM de NaCl y 0,5% de SDS incubados durante 16 h a 65 °C.

El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se purificó con perlas magnéticas de ampura de Agencourt (Beckman Coulter) siguiendo las instrucciones del fabricante (1,8 × volumen). La muestra se elutó de las ampollas en 20 µl de agua, y se realizaron los siguientes pasos enzimáticos en solución.

Ligadura del segundo adaptador: ligadura de ADNss (versión 4.0, volumen de reacción total 40 µl): al ADN resuspendido se añadió 1200 U de ligasa de ADN T4, 1 × Tampón de ligasa de ADN T4, adaptador de 375 nM (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) y se incubó durante 1 h a 25 °C.

Ligadura del adaptador de férula (versión 4.1, volumen de reacción total 40 µl): al ADN resuspendido se añadió 1200 U de ligasa de ADN T4, 1 × Tampón de ligasa de ADN T4, adaptador de 375 nM (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) y se incubó durante 1 h a 25 °C.

Ambas versiones 4.0 y 4.1: la reacción de ligadura se purificó con perlas ampuradas (1,8 × volumen) y resuspendidas en 15 µl de agua. La muestra fue amplificada a través de PCR. Para amplificación de PCR (volumen de reacción total 40 µl); al ADN resuspendido se añadió 2 U de Polimerasa de Arranque en Caliente por Fusión (Thermo scientific), 1 × Tampón HF por Fusión (Thermo scientific), dNTPs de 200 µM, 500 nM cada imprimación (P1.3 y NexA2-iNN) y se amplificó durante 18 ciclos (20 s a 98 °C de desnaturalización, 1 min a 52 °C de recocido, 1 min a 72 °C de extensión). Una cuarta parte de la reacción se amplificó durante seis ciclos adicionales (24 en total) y la presencia de bibliotecas se determinó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Selección de tamaños: los productos de PCR de 200 a 500 pb se purificaron en gel a partir de un gel de agarosa al 2% utilizando el Kit de Extracción de gel QIAquick (Qiagen).

Nota: El ChIP-exo 4.0 / 4.1 incorpora un adaptador universal Read_2, con el código de barras añadido posteriormente durante la PCR con cebadores largos. Siempre que se usaban cebadores largos de PCR en una construcción de biblioteca que involucraba digestión de exonucleasas lambda, las bibliotecas sufrían de dímeros adaptadores de bajo rendimiento y altos. Ahora solo usamos adaptadores de longitud completa y cebadores de PCR de longitud mínima.

ChIP-exo 5.0

Después de la inmunoprecipitación, se realizaron los siguientes pasos en la resina. El material de viruta en resina se lavó secuencialmente con Tampón de Lisis FA, Tampón NaCl, Tampón LiCl y Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C. Para la reacción de cola A (50 µl) que contenía: Fragmento de Klenow de 15 U, exo (NEB), nebulizador 2 de 1 × y dATP de 100 µM se incubó durante 30 min a 37 °C; luego se lavó con Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C. La primera ligadura del adaptador reacciones de cinasa (45 µl) que contenían: ligasa de ADN de 1200 U T4, PNK de 10 U T4, Tampón de Ligadura rápida de 1 × NEBNext y adaptador de 375 nM (ExA2_iNN / ExA2B) se incubó durante 1 h a 25 °C; luego se lavó con Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C. La reacción de relleno (40 µl) que contiene: 10 U de polimerasa phi29, 1 × tampón de reacción phi29, 2 × BSA y dNTPs de 180 µM se incubó durante 20 minutos a 30 °C; luego se lavó con Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C. La digestión de exonucleasa λ (50 µl) que contiene: 10 U de exonucleasa, 1 × tampón de reacción de exonucleasa λ, 0,1% Tritón-X 100 y 5% El DMSO se incubó durante 30 minutos a 37 °C; luego se lavó con Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 a 4 °C.

Se eluyó ADN de la resina y se realizó un tratamiento de reticulación inversa y Proteinasa K (40 µl) que contenía: proteinasa K de 30 µg, Tris-HCl de 25 mM, pH 7,5, EDTA de 2 mM, NaCl de 200 mM y SDS al 0,5% incubados durante 16 h a 65 °C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se purificó con perlas magnéticas de ampura de Agencourt (Beckman Coulter) siguiendo las instrucciones del fabricante (1,8 × volumen).La muestra se elutó de las ampollas en 20 µl de agua, y se realizaron los siguientes pasos enzimáticos en solución. Para ligadura del segundo adaptador (volumen de reacción total 40 µl): al ADN resuspendido se añadió 1200 U de ligasa de ADN T4, 1 × Tampón de ligasa de ADN T4, adaptador de 375 nM (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) y se incubó durante 1 h a 25 °C. La reacción de ligadura se purificó con perlas de AMPura (1,8 × volumen) y se resuspendió en 15 µl de agua.

La muestra fue amplificada a través de PCR. Para amplificación de PCR (volumen de reacción total de 40 µl); al ADN resuspendido se añadió 2 U de Polimerasa de Arranque en caliente por fusión (Thermo scientific), 1 × Tampón HF por fusión (Thermo scientific), dNTPs de 200 µM, 500 nM cada imprimación (P1, 3 y P2.1) y amplificado durante 18 ciclos (20 s a 98 °C de desnaturalización, 1 minuto a 52 °C de recocido, 1 minuto a 72 °C de extensión). Una cuarta parte de la reacción se amplificó durante seis ciclos adicionales (24 en total) y la presencia de bibliotecas se determinó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Selección de tamaños: los productos de PCR de 200 a 500 pb se purificaron en gel a partir de un gel de agarosa al 2% utilizando el Kit de Extracción de gel QIAquick (Qiagen).

Nota: hemos encontrado que el uso de un método que no sea la purificación de gel en esta etapa conduce a un nivel inaceptablemente alto de dímeros adaptadores en la muestra final. La purificación de gel puede separar eficazmente el dímero adaptador (fragmento de 150 pb) y fragmentos más pequeños de la biblioteca ChIP-exo (fragmento de 200 pb = adaptadores de 150 pb + inserto de 50 pb).

Secuenciación de ADN

La secuenciación de ADN de alto rendimiento se realizó con un NextSeq 500 en modo de extremo emparejado produciendo lecturas de 2 × 40 pb. Las lecturas de secuencia se alinearon posteriormente con los genomas de levadura (sacCer3) y humano (hg19) utilizando bwa-mem (v0.7.9 a)24. Las lecturas alineadas se filtraron para eliminar alineaciones no únicas y duplicados de PCR. Los duplicados de PCR se definieron como lecturas de secuencia que poseían secuencias idénticas Read_1 y Read_2.

Disponibilidad de datos

Todos los archivos de secuenciación y archivos de picos de este estudio están disponibles en NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con los números de acceso GSE110681 y GSE114606. Los archivos de coordenadas, los parámetros de script y el código personalizado utilizado para generar las figuras para este documento se pueden descargar de: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.

Todos los demás datos están disponibles a petición razonable de los autores.