En este video, observará cómo realizar el ensayo de liberación de cromo y determinar el potencial citotóxico de las células efectoras.
Las células inmunitarias son responsables de identificar y eliminar del cuerpo células potencialmente dañinas, como células cancerosas o infectadas por virus, que es una parte integral de la respuesta inmunitaria. Varias células inmunitarias, como las células T y las células NK, poseen una propiedad conocida como potencial citotóxico, que es la capacidad de identificar células diana y secretar proteínas que inducen la degradación de proteínas, la lisis y la muerte de esas células diana. La cuantificación del potencial citotóxico es fundamental para medir la activación y la potencia de las células inmunitarias, y el ensayo de liberación de cromo se utiliza comúnmente para este propósito.
Este método permite a los usuarios comparar la citoxicidad inducida por tipos específicos de células inmunitarias en diferentes condiciones, lo que es valioso para estudiar la inmunoterapia contra el cáncer y las enfermedades relacionadas con la inmunidad. Para empezar, las células diana, como las células cancerosas, se incuban con un isótopo radiactivo, cromo 51, que es absorbido por las células. A continuación, estas células radiomarcadas se co-cultivan con las células inmunitarias aisladas de interés, también llamadas células efectoras, en una placa de fondo redondo de 96 pocillos para facilitar la interacción entre los dos tipos de células.
La configuración general del ensayo consiste en incubar un número específico de células diana con diferentes concentraciones de células inmunitarias, junto con controles adecuados. El cocultivo permite a las células efectoras inducir apoptosis y lisis en las células diana, lo que resulta en la liberación del cromo intracelular 51 en el sobrenadante. Luego, en un punto de tiempo preoptimizado, el sobrenadante que contiene el cromo liberado se cosecha de todos los pozos. El cromo 51, al ser radiactivo, experimenta espontáneamente desintegración radiactiva para emitir radiación gamma. Los niveles de radiación gamma en los sobrenadantes de todos los pocillos de la placa de ensayo representan una salida cuantificable de la lisis de las células diana. Esto se mide utilizando un contador gamma, que luego se usa para determinar el potencial citotóxico de las células inmunitarias.
Para comenzar, las células diana, la línea celular de melanoma humano WM793 en este ejemplo, se preparan en una suspensión de una sola célula. Para hacer esto, primero retire el medio del matraz de cultivo de tejidos y lave las células con cinco mililitros de 1X PBS. Decanta el PBS y luego agrega un mililitro de tripsina a la placa durante aproximadamente dos minutos. Golpee suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie del matraz y, a continuación, agregue cinco mililitros de medio RPMI al matraz. Pipetee el medio hacia arriba y hacia abajo para recoger las células y agregue esta suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros.
Coloque el tubo en la centrífuga durante cinco minutos a 1200 RPM. A continuación, retire el medio del tubo asegurándose de no interrumpir el pellet celular. Golpee suavemente la parte inferior del tubo para interrumpir el gránulo celular y agregue 10 mililitros de medio al tubo. Luego, pipetee suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo para llevar las células a la suspensión. A continuación, determine la concentración celular utilizando un hemocitómetro y transfiera dos mililitros de la suspensión celular original a un tubo cónico nuevo de 15 mililitros. Coloque el tubo en una centrífuga y pelletee las células a 1200 RPM durante cinco minutos. Después de la centrifugación, vierta el exceso de medio fuera del tubo en un contenedor de residuos. Vórtice brevemente el tubo para resuspender el gránulo celular en el pequeño volumen de medio dejado atrás.
A continuación, prepárese para usar el Cromo 51 trasladándose a un espacio de laboratorio dedicado a esta radiactividad en particular. Debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento y uso seguros del Cromo 51 durante todos los pasos, así como una señalización adecuada para indicar dónde se guardan las muestras con Cromo 51. Un contador Geiger equipado con una sonda para tortitas también es necesario para servir en el espacio para una posible contaminación.
Una vez configurado para el uso adecuado de la radiactividad, agregue 100 microcurios de Cromo 51 directamente a la suspensión de células objetivo. Luego, agregue un pequeño trozo de cinta radiactiva al tubo para indicar que la muestra y el tubo ahora son radiactivos. Coloque el tubo en una incubadora de 37 grados celsius con un protector de plomo e incube durante una hora, moviendo el tubo cada 15 a 20 minutos.
Mientras se etiquetan las células objetivo, prepare una suspensión de células efectoras de una sola célula. En este ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica humana, o PDMC, se aislaron de sangre completa mediante centrifugación de gradiente de densidad estándar a una concentración de 5 veces 10 a la 6a. Transfiera esta suspensión de célula efectora a un depósito de reactivo desechable y luego agregue 200 microlitros de esta suspensión en cada pocillo de la fila B en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. A continuación, agregue 100 microlitros de RPMI a cada pozo de la fila C a la G de la placa.
Ahora, comience a realizar diluciones en serie de los PBMC para tener un rango de números de células efectoras eliminando primero 100 microlitros de las células en los pocillos de la fila B y agregándolo a la fila C. Luego, diluya aún más las células efectoras transfiriendo 100 microlitros de células de la fila C a la fila D. Continúe con la dilución en serie. Una vez alcanzada la fila G, mueva 100 microlitros de los pocillos para dejar un volumen final de 100 microlitros en cada pocillo de esa fila. A continuación, agregue 100 microlitros de medio de cultivo de tejidos a los pocillos de la fila A para que sirvan como control de la liberación espontánea de Cromo 51 de las células diana, ya que no se deben agregar células efectoras a esta fila. Luego, coloque una placa en una incubadora de 37 grados celsius hasta que las células objetivo estén listas para ser agregadas.
Después del período de incubación, retire las células diana de la incubadora y lávelas con 5 mililitros de FBS para eliminar el exceso de cromo 51. Luego, coloque el tubo en una centrífuga designada y gire a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el lavado radiactivo de FBS en un recipiente de residuos apropiado y repita el paso de lavado resuspendiendo el gránulo en 5 mililitros de FBS nuevos. Coloque el tubo en una centrífuga designada y vuelva a girar las celdas a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el segundo lavado y compruebe la radiactividad incorporada en el pellet con un contador Geiger. Por último, Resuspenda el gránulo en 10 mililitros de medio completo y vierta la suspensión de células objetivo marcada con Cromo 51 en un depósito de reactivo desechable. Luego, agregue 100 microlitros de estas células objetivo etiquetadas a cada pocillo de la placa de células efectoras de 96 pocillos. A continuación, agregue 100 microlitros de 1% NP-40 en agua a los pozos de la fila H para lisar todas las celdas objetivo en cada fila. Estos pozos se utilizarán como control para determinar los recuentos totales por minuto, o cpm.
Ahora que la placa está preparada, asegure la tapa agregando un pequeño trozo de cinta a cada lado de la placa y coloque un trozo de cinta radiactiva en la tapa para indicar que contiene cromo 51. Luego, coloque la placa en una centrifugadora marcada para manipular muestras radiactivas. Si solo se utiliza una placa experimental, agregue una placa de equilibrio a la centrífuga. Ajuste la centrífuga a 1200 rpm y acelere la placa. Una vez a la velocidad, detenga la máquina. Retire la placa de la centrífuga. Luego, coloque la placa en una incubadora de 37 grados celsius con un pequeño trozo de blindaje de plomo sobre la placa para mayor seguridad. Incubar durante 16 horas para permitir que las células objetivo se lisen.
Al final del período de incubación, retire cuidadosamente la cinta alrededor del borde de la placa y retire la tapa. A continuación, coloque el marco de recolección en la placa asegurándose de que los pequeños discos de filtro estén en su lugar para cada uno de los tapones de algodón. Ahora, presione lenta y suavemente los tapones de algodón en los pozos. Después de aproximadamente diez segundos, suelte la presión sobre los tapones de algodón y luego transfiera los tapones de algodón a las tiras de tubo. Coloque cada uno de estos tubos en un tubo FACS secundario. Finalmente, cargue los tubos FACS en un contador gamma y analice las muestras para cuantificar la cantidad de cromo 51 liberado en cada condición. Registre cuidadosamente el orden en que se cargaron los tubos en el mostrador.
Aquí, se agregaron PBMC no estimuladas a los primeros 3 carriles y se agregaron PMBC estimulados por CPG a los carriles 4 a 6. En este ejemplo, los recuentos por minuto se ingresaron en las celdas de una hoja de cálculo de la misma manera que las muestras se colocaron en la placa original y se calcularon los promedios de los triplicados. Por ejemplo, para la primera condición, las celdas A1, A2 y A3 se promediaron en la celda I3. Una vez que se determinan los promedios, el porcentaje de lisis específica para cada condición se puede calcular utilizando esta fórmula. Por ejemplo, para calcular el porcentaje de lisis específica para las células no estimuladas que tenían una relación de 50 a 1 células efectoras para las células objetivo, se restó la CPM espontánea, que en este ejemplo es 1164,67, de la CPM experimental, 1129. 67. Este número puede dividirse por la diferencia entre el CPM máximo y el CPM espontáneo, y luego multiplicarse por 100 para obtener el porcentaje de lisis específica. Esto se calcula para cada condición. Estos datos se pueden graficar para mostrar la comparación de la relación E a T con el porcentaje de lisis específica tanto para las PBMC no estimuladas como para las PBMC estimuladas por GPC. En este ejemplo, las células efectoras estimuladas con CPG destruyeron más eficazmente las células diana a medida que aumentaba la proporción de células efectoras respecto a las células diana. Este aumento no se observó en las PBMCS no estimuladas, lo que indica que la estimulación de la GPC es necesaria para el aumento observado de la lisis celular diana.