Eliminaciones del cromosoma 20 en neoplasias mieloides malignas: reducción de la región deletida común, generación de un contig PAC/BAC e identificación de genes candidatos

Bandas cromosómicas y pintura

Se analizaron preparaciones de cromosomas de médula ósea de 107 casos con trastornos mieloides mediante bandas G evaluar el tamaño de la deleción del brazo largo del cromosoma 20. Como se describió anteriormente (Nacheva et al., 1995b), se identificaron dos categorías de deleción de 20q: deleciones grandes (59 casos), que resultaron en la pérdida de ambas bandas oscuras de Giemsa de 20q (Figura 1a, arriba), y deleciones pequeñas (48 casos) en las que queda una banda oscura de Giemsa (Figura 1a, abajo). A continuación, nos centramos en este último grupo de pacientes (resumido en la Tabla 1).

Se realizó un análisis de FISH utilizando una pintura de cromosoma 20 en las 48 muestras con una pequeña deleción de 20q. En seis casos, se reveló que la «eliminación 20q» se debía a reordenamientos crípticos. En un caso, la aplicación simultánea de pinturas para los cromosomas 15 y 20 identificó un marcador derivado del cromosoma 15 pero dos homólogos normales del cromosoma 20 (Figura 1b). En los cinco casos restantes, la pintura cromosómica demostró la presencia de una translocación desequilibrada con un punto de interrupción recurrente en 20q11.2 y parejas cromosómicas variables (Figura 1c). En los cinco casos, el marcador der(20) fue el único producto de translocación retenido en el genoma. Además, el mapeo de FISH mostró que el punto de corte en el cromosoma 20 se había producido en una región proximal a D20S107 y confirmó la pérdida del resto del brazo largo del cromosoma 20 (datos no mostrados). Estos resultados se informarán en detalle en otra parte.

En los 42 casos restantes, la pintura cromosómica fue consistente con una pequeña deleción intersticial de 20q (Figura 1d). La mayoría (33 casos) presentaba una deleción de 20q como única anomalía cariotípica. En los nueve casos restantes, la deleción de 20q se acompañó de varias aberraciones cromosómicas adicionales (Tabla 1). Los 42 casos con una pequeña deleción de 20q se sometieron a un mapeo de PECES adicional con sondas locus específicas.

Análisis de mapeo de deleción

Los 42 pacientes con deleciones pequeñas de 20q fueron analizados por FISH utilizando un PAC centromérico (CEP20), un PAC hibridado a una región distal de 20q (LSI 20q13) y un PAC hibridado dentro de la CDR (LSI D20S108). En cada paciente, se observaron señales de LSI 20q13 y CEP20, pero no de LSI D20S108 en el cromosoma 20 eliminado, confirmando la presencia de una deleción intersticial (resumida en la Figura 3). Luego se hibridaron metafases de cada paciente con mapeo de PACs en los límites de los CDRs conocidos de SMD y SMD/LMA-D20S107 que se encuentra en el límite proximal de los CDRs y D20S176 que se encuentra telomérico del límite distal de los CDRs (Bench et al., 1998a; Wang et al., 1998).

En 37 pacientes (25 con SMD o LMA, 12 con SMP), ambas sondas no produjeron una señal en el cromosoma 20 eliminado, lo que demuestra la presencia de eliminaciones extensas que no ayudarían a refinar los CDR. Esas muestras no se investigaron más a fondo. Sin embargo, en cuatro pacientes con SMD (DB53, MH40, DB122 y DB214) y uno con MPD (JH41), una de las dos sondas dio una señal en el cromosoma 20 eliminado y estas muestras se analizaron con más detalle.

Además de los 42 pacientes con deleciones pequeñas de 20q que se analizaron mediante FISH utilizando sondas locus específicas, se analizaron otros seis pacientes con deleción de 20q (cuatro con SMD, dos con SMP), de los que no se disponía de metafases de médula ósea, mediante PCR de microsatélites. El ADN de granulocitos y células T purificados se analizó utilizando un gran panel de marcadores polimórficos que abarcó los CDR de SMD y SMD/LMA (Tabla 2). Los cuatro pacientes con SMD tuvieron eliminaciones que se extendían más allá de los límites de la CDR publicada. Sin embargo, en uno de los dos pacientes con DPM (RB42), el límite centromérico de la deleción redujo considerablemente la CDR de DPM (Figura 2, Tabla 2).

Reducción de la región común eliminada en pacientes con SMD/LMA

El análisis preliminar de FISH identificó a cuatro pacientes con SMD con eliminaciones que invadían la CDR de SMD/LMA. En cada caso, la deleción de 20q estaba presente en todas las metafases examinadas. En tres casos (DB53, DB214 y MH40), la deleción de 20q estaba presente como una única anomalía. En el paciente DB122, la deleción de 20q fue la única anomalía original con dos subclones que contenían trisomía 21 o trisomía 8 y trisomía 21 además de la deleción de 20q también presentes. Estos cuatro casos se estudiaron utilizando sondas locus específicas adicionales para determinar los límites de deleción.

El límite proximal de la RDC de SMD/LMA fue refinado por los pacientes DB53, MH40 y DB122. El límite proximal de la deleción en DB53 estaba entre D20S107 y WI-11538 (Figura 3), una distancia de aproximadamente 400 kb. Para el paciente MH40, un PAC que contenía WI-11538 (dJ357E14) dio lugar de manera consistente a una señal reducida consistente con la presencia del punto de interrupción de deleción proximal dentro de este PAC (Figura 3). Además, el límite proximal de la deleción en el paciente DB122 se situaba entre sts-R52161 y stSG25449 (Figura 1e,f), a una distancia inferior a 200 kb (Figuras 3 y 4). Esto representa un gran refinamiento del límite proximal de la CDR de SMD/LMA.

El paciente DB214 permitió un refinamiento considerable del límite distal de la RDC de SMD/LMA. El límite distal de esta eliminación se situaba entre WI-12515 y stSG40369 (Figura 1g,h), una distancia de menos de 100 kb (Figuras 3 y 4).

Por lo tanto, estos datos reducen considerablemente el CDR MDS/AML a una región situada entre PAC dJ620E11, que contiene sts-R52161, y PAC dJ196H17, que contiene WI-12515 (Figuras 3 y 4). El clon bacteriano contig que se presenta a continuación demuestra que el tamaño físico de esta región es de aproximadamente 2,6 Mb.

Reducción de la región de deleción común en pacientes con DPM

En el paciente JH41 (diagnóstico VP), el límite proximal de la deleción se había determinado previamente mediante PCR microsatélite para situarse entre D20S438 y D20S107 (Bench et al., 1998a). PAC dJ155H19, que contiene D20S107 (Figura 4), dio lugar de manera consistente a una señal reducida consistente con la presencia del punto de interrupción de deleción proximal dentro de este PAC (Figura 3).

Se investigaron granulocitos y células T de dos pacientes adicionales utilizando PCR de microsatélites (Tabla 2). Un paciente con VP (RB42) demostró retención de heterocigosidad en D20S108 pero pérdida en D20S858 (Figura 2, Tabla 2). El punto de corte proximal de la deleción en este paciente se situaba entre D20S108 y D20S858, una distancia de menos de 200 kb (Figuras 3 y 4).

Estos datos reducen en gran medida el CDR de MPD que ahora está flanqueado por D20S108 (este estudio) y D20S481 (Wang et al., 1998). El tamaño físico estimado de esta región es de 2.7 Mb, utilizando datos del clon bacteriano contig que se presenta a continuación. La región de solapamiento entre los nuevos SDM / LMA y los RDC de MPD definió una RDC «mieloide» combinada de 1,7 Mb (Figura 3).

Un contig clon bacteriano que abarca las regiones eliminadas comunes de MPD y MDS/AML

Previamente habíamos construido un contig YAC de 11 Mb de esta región del cromosoma 20 (Bench et al., 1998a). Con el fin de producir un mapa físico más detallado, ahora hemos construido un mapa contiguo basado en PAC y BAC. Los clones PAC y BAC se identificaron mediante hibridación de STSs a bibliotecas genómicas (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et al., 1998). Los clones se superpusieron utilizando huellas dactilares de restricción (Gregory et al., 1997) y mapeo de contenido STS que permite agrupar los clones en contiguos. Para tender puentes entre los contiguos, se utilizaron nuevas sondas de ADN y STSS, desarrolladas a partir de los extremos de los contiguos, para un mayor cribado de bibliotecas. Los nuevos PACs y BACs se fusionaron en contiguos de la misma manera hasta que se produjo un mapa contiguo.

El clon bacteriano contig contiene un total de 456 clones bacterianos, de los cuales 376 son PAC y 80 son BAC. Se extiende desde D20S607 hasta SEMG1 e incluye 202 marcadores de ADN, de los cuales 185 son STSs y 17 son sondas de ADN. El tamaño del contig se basó en un promedio de 3,5 kb por banda de huellas dactilares HindIII(P Deloukas (2000), resultados no publicados). El tamaño estimado del contig se calculó en 5 Mb multiplicando el número total de bandas de huellas dactilares diferentes dentro del contig por 3,5. En la Figura 4 se muestra una representación del mapa que ilustra la trayectoria de mosaico mínima y los PAC que se utilizaron para experimentos con PECES. Una versión completa del mapa se puede encontrar en http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name= Chr_-20ctg125&class=Map.

Identificación de secuencias expresadas

Cuarenta y tres EST únicas se ubicaron entre D20S607 y stSG34035 inclusive. De estos, 34 ESTs se mapearon por hibridación a una ‘polígrida’ de PACs y BACs o por PCR de colonias de colonias bacterianas que contenían PACs o BACs (Figura 4). Nueve EST adicionales, previamente mapeadas en esta región del cromosoma 20 (Bench et al., 1998a; Deloukas et al., 1998) se colocaron sobre el contig por alineación de la secuencia EST con la secuencia genómica PAC o BAC disponible.

Con el fin de identificar secuencias expresas putativas novedosas, se secuenciaron parcial o completamente 23 clones PAC de la ruta de mosaico mínima. La secuencia genómica de estos clones se analizó mediante el programa NIX (Williams et al., 1998), que permite la observación simultánea de una serie de herramientas de identificación de genes, como GRIAL, GENSCAN y BLAST. Se identificaron ocho EST y genes no mapeados previamente (Tabla 3). Seis de ellos se encuentran dentro del CDR del MPD y siete dentro del CDR del MDS. Se obtuvo evidencia de que seis de estas ocho secuencias expresas supuestas representaban genes transcritos de buena fe, en lugar de pseudogenes procesados o contaminantes de ADN genómico dentro de la base de datos EST. KCNS1 es un gen que codifica una subunidad de canal dependiente de voltaje de potasio. Posteriormente se descubrió que las ESTs AA053206/AA053121 se derivaban del gen SGK2 (Kobayashi et al., 1999). La alineación de la secuencia de ADNc con la secuencia genómica demostró una estructura de exón/intrón para tres de las seis EST restantes (AI312497, AA568401 y AA910031) con la secuencia de consenso del sitio de empalme presente en todos los límites de exón/intrón. En los tres casos, la presencia de cada exón fue confirmada por programas de predicción de exones como el GRIAL. La existencia de un exón también fue predicha por GRAIL, GENSCAN y Genefinder dentro de la región de PAC dJ1108D11 que se alineó con EST AA993161, lo que implica que este EST también representaba un gen transcrito.

El análisis de secuencias de PACs desde el interior de la ruta de mosaico mínima también nos permitió establecer la estructura genómica de genes conocidos y nuevos en esta región. La alineación de cDNA RPTPrho con PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 y dJ269M15 demostró que este gen abarca al menos 1,2 Mb. PAC dJ138B7 contenía dos genes (h-l (3)mbt y SGK2), así como la porción de 5′ del gen correspondiente a SHGC-36858. En particular, el gen h-l(3)mbt contiene 20 exones con dos exones finales alternativos putativos. El análisis de dJ644L1 demostró que el gen MafB humano consiste en un solo exón. El análisis de la secuencia terminada también fue realizado por el Centro Sanger (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) y esto se puede ver en http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&class=GenomeSequence.

Estos datos establecen la presencia de seis genes y otros 14 EST unqiue dentro de los nuevos CDR de SMD/LMA y un total de 14 genes con 23 EST únicos dentro de los nuevos CDR de MPD (Tabla 3). Seis genes y 10 EST únicos están presentes en la región de superposición entre los dos CDRs.

Perfil de expresión

Se cree que los trastornos mieloproliferativos, los síndromes mielodisplásicos y la leucemia mieloide aguda son el resultado de la transformación de una célula multipotente dentro del compartimento de células madre hematopoyéticas (Bonnet y Dick, 1997; Kralovics y Prchal, 1998). Además, se ha demostrado previamente que la deleción 20q puede surgir en una célula progenitora capaz de dar lugar tanto a células mieloides como a células B (White et al., 1994). Estas consideraciones sugieren que es probable que el gen o genes del cromosoma 20q inactivados en estas enfermedades se expresen en células progenitoras hematopoyéticas normales. Por lo tanto, determinamos cuáles de las secuencias transcritas se expresaban en médula ósea y células CD34 positivas purificadas.

La amplificación por PCR de transcripción inversa (RT–PCR) se realizó con cebadores que representaban cada una de las 51 secuencias transcritas (Figura 5). Se realizaron al menos dos amplificaciones independientes de RT–PCR para cada secuencia transcrita. Se utilizaron cebadores correspondientes a un EST (WI-7685) derivado del 3′ UTR del gen CD34 como control positivo (Figura 5). Cuando dos o más TES correspondían a la misma secuencia transcrita, se obtuvo el mismo resultado para cada TES.

Los datos se presentan en la Figura 5, Tablas 3 y 4. De las 37 secuencias expresadas en la MPD CDR, 20 se expresaron en células mononucleares de médula ósea. De ellos, 16 también se expresaron en células CD34 positivas. Dentro de la CDR de SMD/LMA, 11 de las 20 secuencias transcritas se expresaron en células mononucleares de médula ósea. De estos, ocho también se expresaron en células CD34 positivas. De las 16 secuencias transcritas que se encuentran dentro de la región de superposición entre el SMP y el SMD/LMA, ocho se expresaron en células de médula ósea, de las cuales cinco también se expresaron en células CD34 positivas. Por lo tanto, estas cinco secuencias transcritas representan genes candidatos principales, ya que se encuentran dentro de los CDRs MPD y MDS/AML y se expresan dentro del compartimento de células progenitoras hematopoyéticas. Incluyen dos genes desconocidos correspondientes a ESTs SHGC-36858 y WI-12515, así como tres genes, SFRS6, h-l(3)mbt y MYBL2.