El papel de las señales de cordina/Bmp en el desarrollo faríngeo de mamíferos y síndrome | Desarrollo de DiGeorge

RESULTADOS

Defectos de gastrulación en Crd-/- ratones

La proteína de unión a Bmp secretada por Chrd se expresa en el nodo de ratón y sus derivados, el cordón de notas y el endodermo faríngeo(Fig. 1A a F). La proteína Chrd contiene cuatro dominios ricos en cisteína (CR), todos los cuales son capaces de unirse a Bmp.CR1 y CR3 muestran la mayor afinidad por Bmp4, y pueden antagonizar los signos de Bmp después de la inyección de ARNm en embriones Xenopus(Larrain et al., 2000). Para generar un alelo nulo de Chrd, preparamos una construcción de segmentación con codones de parada de traducción en los tres marcos de lectura posibles dentro de la región del péptido único. Los codones de parada fueron seguidos por un cambio de marco y la inserción, después de CR1, de casetes IRES-LacZ y PGK-neo que destruyeron aún más el gen Chrd (Fig.1G). Las transcripciones de este alelo Chrdtm1DR (en lo sucesivo denominado Chrd-) eran embriones inChrd-/- indetectables en la etapa ganglionar (Fig. 1J, punta de flecha).

Los ratones Crd heterocigotos eran viables y fértiles y se apareaban para engendrar Crd – / – embriones de varios tipos de desarrollo stages.At el día E8. 5, observamos la presencia de nódulos de reabsorción en el útero de hembras gestantes y una pequeña reducción en el número esperado de embriones CRD -/ – (50 recuperados, 57 esperados). Los embriones mutantes homocigotos cuatrigenotipados mostraron una clara reducción del tamaño de la región embrionaria, acompañada de un agrandamiento del alantois con respecto al resto del embrión (Fig.2 BIS, A’). En las secciones histológicas, una hipoplasia considerable de la placa neural (Fig.2B, B’), ausencia de somitas y notocordio (Fig. 2C, C’), y anabundancia de células mesodérmicas extraembrionarias en el alantois(Fig. 2D, D’) fue observado. El resto de los mutantes (46) eran morfológicamente indistinguibles de sus compañeros de camada heterocigotos y salvajes. El fenotipo de los mutantes normales fourab fue similar, pero menos pronunciado, a la ventralización del mesodermo observada en Crd homocigotos dobles; Nogmutantes (Bachiller et al.,2000) en la que, además, también estaban presentes truncaciones anteriores de la neuralplaca.

En peces cebra y Xenopus, la inactivación de la DCR causa una expansión del mesodermo ventral y una reducción del mesodermo dorsal y de la placa neural (Schulte-Merker et al.,1997). En los mamíferos, el mesodermo se forma durante la gastrulación por lacresión de las células epiblásticas a través de la raya primitiva. Las células que salen del extremo posterior de la línea primitiva se mueven hacia la región extraembrionaria, donde dan lugar a un linaje mesodérmico (alantois, amnión y tierras de sangre del saco vitelino) equivalente al mesodermo ventral de Xenopus. Por el contrario, las células localizadas en regiones más anteriores de la ruptura permanecen dentro del embrión propiamente dicho y producen el mesodermo de placa paraxial, intermedia y lateral del futuro tronco. El fenotipo temprano de los mutantes CRD -/ -, en el que el alantois se expande al expenso del mesodermo embrionario, es consistente con una ventralización temprana del embrión de ratón. Este fenotipo debe llevar a la muerte de los animales afectados, ya que no se recuperó ningún mutante homocigoto con alantois anormal de disecciones en etapas posteriores. El análisis de este fenotipo con marcadores moleculares no se realizó debido a que se obtuvieron pocos embriones anormales.

Letalidad perinatal

Solo el 49% (95 de 194) de los Crd-/-animales esperados se recuperaron al nacer, todos mostrando el mismo fenotipo completamente penetrante. De ellos, la mayoría nació muerta,pero unos pocos intentaron, sin éxito, inflar sus pulmones. Externamente, los neonatos mutantes homocigotos eran ligeramente más pequeños que sus compañeros de camada silvestres y presentaban cianosis,microcefalia y reducción del oído externo, que se colocaba anormalmente cerca del ojo (Fig. 3A»).Examen histológico (Fig.3B’ – C’) reveló la falta de timo (t, un derivado de la tercera bolsa faríngea) y paladar secundario (p), e hipoplasia del oído interno (ie) en los mutantes. El lóbulo anterior y la parte intermedia de la glándula pituitaria (ip), ambos derivados del ectodermo oral dorsal inmediatamente adyacente al borde cefálico del endodermo anterior, eran normales(Fig. 3C, C’). Esto definió el límite rostral del fenotipo en la orofaringe, con malformaciones restringidas a derivados del endodermo de expresión de Crd. La glándula tiroides, que se forma en el endodermo faríngeo ventral en el foramen ciego, se diferenció pero era hipoplásica y de forma irregular(th, Fig. 3C’). Las glándulas paratiroideas, derivadas de las bolsas faríngeas 3 y 4, estaban ausentes (datos no mostrados), una observación consistente con la hipocalcemia neonatal en individuos con síndrome de DiGeorge(DiGeorge, 1968). Concluimos que el fenotipo de ratones Crd-/- nacidos muertos recapitula la mayoría de las características descritas en dichos individuos.

Defectos esqueléticos

En preparaciones esqueléticas de animales Crd/ recién nacidos, los huesos apendiculares y lumbares eran normales, pero la base del cráneo y el esqueleto axial anterior presentaban múltiples defectos. Las alteraciones en el hueso temporal incluyeron la falta de escama temporal (st) y el acortamiento del arco cigomático (Fig.4 BIS, A’). También observamos una hipoplasia considerable del hueso hioides y de los cartílagos laríngeos tiroideos y cricoides (Fig. 4B’), y una mandíbula anormalmente pequeña (Fig.4C’). En la base del cráneo, el alisfenoide (as)parecía normal, pero en la línea media los huesos basioccipital (bo) y basisfenoide(bs) estaban fusionados, y el prefenoide (ps) era hipoplásico(Fig. 4D, D’). Consistente con los hallazgos histológicos, los estantes palatinos no se extendieron medialmente para formar el paladar secundario. En el oído, el anillo timpánico y las cápsulas óticas estaban reducidas y malformadas (Fig.4D’). También se observaron malformaciones esqueléticas en las regiones cervicaly torácica de la columna vertebral. Los cuerpos vertebrales(vb) eran más pequeños en Crd-/- neonatos (Fig. 4E’), con dilatación de la osificación y pérdida ocasional de otros elementos de las vértebras como procesos asspinosos, arcos neuronales y arco anterior del atlas (Fig. 4E ‘ y Fig. 5 BIS»).

Los defectos esqueléticos de los mutantes de Crd ya eran condensaciones detectables en las cartilaginosas en E14 .5 (Fig.5 BIS, A’). Los cartílagos basioccipital y basisfenoides se fusionaron, y el centro de osificación del basioccipital fue más estrecho y extendido hacia el basisfenoide (Fig.5 TER, B’). La notocordia anterior, que estaba presente en la línea media del basioccipital de tipo salvaje, estaba ausente en mutantes Crd (Fig. 5 TER, B’). La ausencia de la notocordia anterior se confirmó mediante un examen histológico de la región cervical en E14 .5 (Fig.5F’).

Los huesos afectados por la mutación Chrd tienen orígenes muy diferentes. El basioccipital es puramente de origen somítico; partes del bisfenoide surgen de la osificación endocondral del mesénquima cefálico; la palatina se origina de la osificación intramembranosa del mesénquima derivado de la cresta neural; las cápsulas óticas se diferencian de una mezcla de células paraxiales de la cresta neural mesodermanda; y el hioides se deriva estrictamente de la cresta neural (Le Douarin y Kalcheim,1999). En medio de tal diversidad de linajes, el principio unificador del fenotipo parece ser la localización de estructuras malformadas en la proximidad del mesendodermo axial que expresa Crd(Fig. 1E). Esta interpretación es consistente con la degeneración prematura observada del cordón anterior en Crd-/- animales, y con el requerimiento de señales derivadas de placa precordial y mesendodermo para el desarrollo del esqueleto de la cabeza (Belo et al., 1998; Couly et al., 2002; David et al.,2002).

Defectos cardiovasculares similares a DiGeorge

La cianosis observada al nacer puede ser un signo de mal funcionamiento cardíaco. Para investigar esto más a fondo, se realizaron disecciones en diferentes etapas del desarrollo embrionario. En E14.5, los corazones de CRD / animales mostraron un solo vaso, en lugar de los dos normales, en el tracto de salida cardíaca(Fig. 5D, D’, E, E’).Esta condición se conoce en humanos como tronco arterioso persistente y es una malformación importante en individuos con síndrome de DiGeorge. La falta de separación entre la aorta ascendente y el tronco pulmonar puede aumentar la carga de trabajo del ventrículo derecho causando su hipertrofia, así como la vasodilatación, edema y hemorragia observados en embriones E14.5(Fig. 5 QUATER»). Como síndrome inDiGeorge, los defectos en el sistema cardiovascular se extendían más allá del tracto de salida e incluían los grandes vasos derivados de las arquerías faríngeas (Fig. 6). En los mutantes recién nacidos, las arterias carótidas comunes se unieron directamente al tronco arterioso, lo que resultó en la ausencia de la arteria braquiocefálica y parte del arco aórtico (Fig. 6A a C).Las arterias pulmonares se originaron directamente del tronco arterioso proximal, lo que resultó en la ausencia de un tronco pulmonar común(Fig. 6A a C). Además, se observaron defectos de lateralidad, con un giro anormal a la derecha del aortain 40% de los mutantes (Fig. 6, compare 6 con 6F). Cuando se realizaban disecciones desde la parte posterior, se podía observar que, dependiendo de la lateralidad de la aorta descendente, las arterias subclavia derecha o izquierda adoptaban una posición retroesofágica anormal (Fig. 6D-F). Se han descrito efectos similares en embriones de pollo con ablaciones de células de cresta neural (Kirby et al., 1983), e inmice llevando supresiones en la región congénica de DiGeorge(Lindsay et al., 1999; Merscher et al., 2001 )ututaciones en Tbx1 y Fgf8(Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002; Jerome y Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Vitelli et al., 2002b).

Al nacer, solo se recuperó el 49% de los mutantes homocigotos esperados de Crd. Sin embargo, 48 de los 56 embriones Crd/-esperados (86%) seguían vivos en camadas diseccionadas en E14.5, una frecuencia no significativamente diferente de la observada en E8.5 (88%). El fuerte aumento de la letalidad después de E14.5 coincide con la manifestación completa del fenotipo cardiovascular, y sugiere que el mal funcionamiento circulatorio es una causa importante de letalidad de Crd-/- embriones durante la gestación tardía.

Anomalías faríngeas

Para determinar la aparición del fenotipo faríngeo, diseccionamos las hembras gestantes de apareamientos heterocigotos en diferentes momentos después del coito. En E9.0, una etapa en la que la DCR se expresa en el endodermo faríngeo,los embriones de Dcr-/- podrían identificarse por una hendidura en la región del cuello (Fig.7A’, flecha). Las vesículas óticas de los mutantes se redujeron a la mitad de su diámetro normal (Fig.7A’, puntas de flecha) y el segundo arco faríngeo (hioides) que desaparece. Arcos faríngeos de tres a seis nunca se formaron en embriones mutados (Fig. 7B’ y datos no mostrados). Las estructuras faltantes o mal formadas son precursoras directas o desempeñan funciones inductivas durante el desarrollo de muchos de los órganos que son eficaces al nacer en ratones Crd/ CRD. Como la mayoría de las anormalidades fenotípicas observadas en mutantes recién nacidos tienen su origen embriológico en el endodermo faríngeo y en la región perifríngea, analizamos la expresión de una serie de genes que se sabe que tienen importantes funciones de desarrollo en la enfermedad hereditaria humana.

Examinamos primero la expresión de Pax3, un factor de transcripción expresado en cresta neural, tubo neural dorsal y somitas(Goulding et al., 1991). Inhumanos, PAX3 está mutado en enfermedades de la cresta neural designadas síndrome de Waardenburg tipos 1 y 3(Strachan y Read, 1994) y es un co-regulador, junto con SOX10, del gen microftalmiaITitf (Bondurand et al.,2000), el factor de transcripción mutado en el síndrome de Waardenburg tipo 2a en humanos (Tassabehji et al.,1994). La mutación de Pax3 en la mancha(Sp2H) del ratón produce defectos cardíacos, que incluyen tronco arterioso persistente, así como malformaciones del timo, las glándulas tiroideas y paratiroides (Conway et al.,1997). Encontramos que la expresión de Pax3 era indistinguible entre embriones mutantes y de tipo salvaje en E7.5 (no mostrada),pero en E10.5 se observaron diferencias significativas. Las células de la cresta de la vena positiva Pax3 que migran a través de los arcos faríngeos 3, 4 y 6 (Fig. 7C, puntas de flecha) eran detectables en animales Crd -/ – (Fig. 7 QUATER). Estas células neurálgicas pueblan el tabique que separa la aorta de la arteria pulmonar en el tracto de salida, o región conotrúnica, del corazón(Li et al., 2000). El fracaso de la cresta neural cardíaca para llegar al corazón explica la falta de retención de los tractosde salida y el fenotipo cardiovascular posterior observado en mutantes de IRC. Curiosamente, la expresión de Pax3 en otros tejidos como el componente mandibular (dm) del primer arco faríngeo, los dermomiotomas(dm) y los precursores de mioblastos en los miembros delanteros (fl) no se vio afectada(Fig. 7 QUATER).

A continuación, realizamos hibridaciones in situ con Sox10, un genemutado en individuos con síndrome de Waardenburg tipo 4 (Pingault et al., 1998) que se expresa en las células de la cresta neural y de Schwann. En E7. 5, la expresión deSox10 fue la misma en Crd-/- embriones y en sus compañeros de camada de tipo silvestre (no se muestran los datos). En E9. 5, la expresión Sox10 en los ganglios de la raíz dorsal (drg) del tronco fue normal(Fig. 7B, B’), pero la distribución de células gliales que expresan Sox10 reveló defectos específicos en la organización del sistema nervioso periférico en la región del cuello y la cabeza de los mutantes (Fig.7 TER’). En particular, los ganglios sensoriales craneales mostraron anormalidades marcadas. Los ganglios trigéminos (tr) y vestibulo-cocleares (vc), correspondientes a los nervios craneales V y VIII, respectivamente, se ubicaron más juntos en Crd-/- embriones que en compañeros de tipo salvaje. Además, se observaron proyecciones nerviosas anormales que conectaban a los dos (Fig. 7B’, punta de flecha). Los ganglios geniculados (g), petrosales (p) y nodosos (n), correspondientes a los nervios craneales VII, IX y X, fueron los más afectados, mostrando una reducción extrema de tamaño o ausencia completa. Estos tres ganglios se originan de los placodos epibranquiales, y se sabe que requieren signos inductivos del endodermo anterior para su desarrollo adecuado (Begbie et al., 1999). La carencia de ganglios derivados del placodo epibranquial indica que la proteína secretada es necesaria para la actividad de la señal inductiva liberada por el endodermo faríngeo.

Pax9 es un factor de transcripción necesario para el desarrollo del endodermo faríngeo y sus derivados en el ratón (Peters and Balling, 1999; Peters et al., 1998). En E9.5, la expresión de Pax9 en el endodermo faríngeo de embriones CRD-/- fue más débil que en sus compañeros de tipo salvaje (pe, Fig.7D, D’). La expresión de Pax9 reveló que el tamaño y la forma de la faringe estaban alterados en los mutantes Crd, con las protuberancias faríngeas reducidas a una sola hinchazón en la región más anterior(Fig. 7 SEXIES, E’). La hipoplasia de la faringe se confirmó mediante secciones histológicas de los genes E14.5, en las que el endodermo anterior apareció como un tubo delgado que delineaba una luz muy disminuida (ph, Fig.5F, F’). La reducción del endodermo faríngeo también se ha observado en las caídas de Xenopus Chrd(Oelgeschläger et al.,2003). Las regiones no faríngeas en las que se expresa normalmente el ARNm Pax9, como los esclerotomas somíticos (sc) y el mesénquima facial(fm), no mostraron diferencias en la distribución o abundancia de los guiones (Fig.7F, F’).

Concluimos de estos estudios que las alteraciones en la expresión de Pax3, Sox10 Ypax9 están restringidas a un área muy limitada de dominios de amplia presión, lo que sugiere que la falta de proteína secretada interrumpe específicamente las vías reguladoras locales que actúan en la región perifaríngea que rodea al endodermo que expresa Crd.

La expresión de Tbx1 y Fgf8 requiere chordin

Para estudiar la interacción de Chrd con genes conocidos por causar fenotipos similares a DiGeorge o DiGeorge en ratones, analizamos la expresión de Bx1 y Fgf8 en embriones mutantes de Chrd. Tbx1 es un miembro de la familia de factores de transcripción T-box (Papaioannou y Silver,1998). Se mapea dentro de la microdeleción DGS/VCFS 22q11 en humanos y recientemente se ha demostrado que causa fenotipo DiGeorge al inactivarse en ratones (Jerome y Papaioannou,2001; Lindsay et al., 2001; Merscher et al., 2001; Vitelli et al., 2002a). La expresión de Tbx1 se alteró en embriones CRD/ CRD. En animales silvestres E7.5, la Tbx1 se expresa en el intestino anterior (futuro endodermo faríngeo) y en el mesodermo de la cabeza(Fig. 8A). En esta etapa, los compañeros de camada mutantes mostraron una clara reducción en los niveles de expresión de Tbx1 en las mismas áreas (Fig.8 BIS’). La reducción del ARNm Tbx1 fue igualmente clara en la región faríngea de embriones homocigotos Crd en E8, 0, E8, 5 y E9, 0 (Fig.8B’, C’, D’). Las secciones histológicas transversales mostraron que, a nivel celular, la abundancia de transcripciones Tbx1 se redujo drásticamente en el endodermo, tanto en la faringe como en el intestino anterior, hasta el nivel del divertículo hepático (Fig.8F-H’) La disminución de la concentración de MRN de Tbx1 también fue evidente en el mesodermo, incluyendo la cabeza, el mesodermo esplácnico (puntas de flecha) y el mesodermo sintomático (flechas) en la región perifraríngea(Fig.8F», G», H»). Además, la expresión de Tbx1 en E9 en el núcleo mesodérmico del primer arco faríngeo fue difusa, extendiéndose a la mayor parte del arco, y las transcripciones de Tbx1 fueron ausentes de la vesícula ótica (Fig.8D-D’).

El Fgf8 es un factor de crecimiento secretado expresado en una variedad de tejidos, incluyendo el endodermo faríngeo y el mesodermo vecino(Crossley y Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).Durante el desarrollo temprano, se requiere Fgf8 para la gastrulación (Sun et al., 1999) y el establecimiento del eje de simetría izquierda/derecha(Meyers y Martin, 1999). Se requieren estadios más largos de Fgf8 para las extremidades (Lewandoski et al., 2000; Moon y Capecchi, 2000) ycraniofacial (Trumpp et al., 1999) development. Experimentos recientes han demostrado que los ratones con actividad reducida de Fgf8 presentan un espectro de defectos cardiovasculares y faríngeos que imitan de cerca el síndrome de DiGeorge(Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002). Además, la expresión de Fgf8 se suprime en el endodermo faríngeo de mutantes Bx1-/- y ambos genes interactúan genéticamente durante la diferenciación de las arterias del arco faríngeo (Vitelli et al., 2002b). La expresión de AtE9, Fgf8 en mutantes Chrd es normal en el istmo del cerebro medio, la prominencia frontonasal y la cola. Sin embargo, en el endodermo faríngeo, los niveles de transcripción de Fgf8 se reducen drásticamente(Fig. 8E’). La reducción de la expresión de Tbx1 y Fgf8 en Crd-/-embriones sugiere que ambos genes actúan aguas abajo de la Crd en la misma vía reglamentaria. Estos experimentos no determinan si es necesario el Crdi para el mantenimiento o para la inducción de Tbx1 y Fgf8 en la faringe y los tejidos vecinos.

Para probar si la Drc puede inducir Tbx1 y Fgf8,inyectamos ARNm de Drc (50 pg) en la región ventral de embriones Xenopus en la etapa de cuatro células. Los explantes de la zona marginal ventral (VMZ)se diseccionaron en las primeras etapas de la gastrula, se cultivaron hasta que los embriones de los hermanos alcanzaron la etapa temprana de la neurula y se analizaron mediante RTPCR. Los ARNm Tbx1 y FGF8 se expresaron en niveles altos en embriones enteros y explantes de zona dorsal y alargada (DMZ) en esta etapa, y en niveles bajos en explantes VMZ (Fig. 8I, carriles 1-3). Upon Microinyección, el ARNm Crd aumentó los niveles de Tbx1 y Fgf8 en VMZ (Fig. 8I, carril 4). La hibridación in situ de embriones de Xenopus microinyectados confirmó que las transcripciones de Tbx1 inducidas por Crd mrnawestaban localizadas en el endodermo faríngeo (datos no mostrados). Concluimos que el CHRD, un antagonista de la Bmp, puede inducir la expresión Tbx1 y Fgf8 en embriones Xenopus, y es necesario para la expresión completa de estos genes en la región faríngea del embrión de ratón.