El cromodominio Chp1 une la cola de H3K9me y el núcleo de nucleosoma para ensamblar heterocromatina

Construcción de plásmidos y cepas

Los mutantes Chp1CD para expresión y purificación se generaron a través de PCR inversa utilizando los cebadores enumerados en la Tabla Suplementaria S2 a partir de Plásmido de cromodominio pET28a Chp1 . Los ensayos de rescate de heterocromatina se realizaron mediante la introducción de plásmidos que contenían proteína pt-chp1 y proteína mutada chp1 bajo su promotor endógeno en una cepa chp1Δ (SP170, ver Tabla Suplementaria S3) . el gen de longitud completa chp1 y su promotor endógeno (-949 pb desde el inicio de la secuencia de codificación chp1+) se clonaron en el plásmido pREP1. los mutantes de cromodominio chp1 se generaron mediante PCR inversa utilizando los cebadores enumerados en la Tabla suplementaria S2 y se transformaron en la cepa chp1Δ indicada.

Para la integración genómica, se modificó el plásmido pREP1 para reemplazar el promotor nmt1+ con el siguiente casete de integración: Región (SphI) en los 5′ del gen Chp1 (Cromosoma I, 2215500-2215055) (AscI)—Casete de resistencia HphMX6-Promotor endógeno Chp1(Cromosoma I, 2214829-2214664)—secuencia de codificación Chp1—(BamHI) Terminador Chp1(Cromosoma I, 2210976-2210582) (BamHI). El casete de integración (tanto el casete chp1+ como el chp1LOOP1B/2B) fue amplificado por PCR y transformado por electroporación, en cepas SP101, SP170 y SP64. Las células se seleccionaron en placas de higromicina YES + (50 mg ml−1 de higromicina). Se aislaron colonias individuales, se sometieron a pruebas de PCR y se secuenciaron para la inserción genómica del casete de resistencia HphMX6 y las mutaciones LOOP1B/2B.

Las cepas que contenían plásmidos se cultivaron en un medio leu de Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC). Todas las cepas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en las Tablas suplementarias S3 y S4.

Purificación de proteínas

His6-SUMO-Chp1CD y todos los mutantes CD se expresaron en E. coli BL21 (DE3) (pLys) y purificado mediante cromatografía de afinidad mediante resina de Ni-NTA (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). His6-SUMO-Chp1CD contiene un sitio de escisión de trombina entre dos etiquetas .

En total, se añadió IPTG de 0,2 mM para inducir la expresión de proteínas, seguido de crecimiento a 18 °C O/N. Las células se recolectaron por centrifugación y se volvieron a suspender en tampón de lisis (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) de 20 mM de pH 7,5, NaCl de 150 mM, ditiotreitol (TDT) de 1 mM, imidazol de 20 mm). Después de la congelación instantánea, las células se descongelaron e incubaron durante 30 minutos en lisozima antes de la sonicación (Sonificador Branson 250-salida 4, ciclo de trabajo 40). La suspensión se centrifugó (12000 g, 20 min a 4 °C) y el sobrenadante se añadió a la resina de Ni-NTA preequilibrada en tampón de unión (20 mM HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM TDT, 20 mM imidazol) y se incubó durante 30 min a 4 °C bajo rotación. La resina se lavó 5× con tampón de unión y las proteínas se elutaron en tampón de elución (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM TDT, 300 mM imidazol). El peso de Chp1CD y los mutantes se dializaron O / N en un tampón que contenía 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM TDT. His6-SUMO-Chp1CD se purificó posteriormente mediante filtración en gel (Superdex 75 pg; GE Healthcare) y se dializó en un tampón que contenía 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mm TDT.

Ensayos silenciadores

Las células para ensayos silenciadores se cultivaron hasta un DO 0,7 – 1 y luego se normalizaron a una concentración final de 1×107 células ml−1 de cultivo. Se hicieron diluciones en serie de diez veces para que el punto de mayor densidad contuviera 1×105 células. Se detectaron células en placas no selectivas (SÍ) y de ácido 5-fluoro-orótico (5-FOA 1 g l-1 5−FOA). Las placas se incubaron a 32 °C durante 2-3 días y se tomaron imágenes. Las células tienen un gen reportero ura4 insertado en repeticiones pericentroméricas de rmi (locus heterocromático). Cuando se silencia el gen reportero ura4, las células pueden crecer en un medio que contiene 5 FOA. Cuando se pierde heterocromatina, se expresa el gen reportero ura4 y las células no pueden crecer en medio 5-FOA.

Detección de niveles de ARN por qPCR (RT-qPCR)

Los cultivos de levadura (10 ml) se cultivaron hasta un OD600 de 0,7–1,5. Las células se resuspendieron en tampón de lisis de 500 µl (NaOAc de 300 mM pH 5,2, dodecil sulfato de sodio al 1%) y 500 µl de fenol–cloroformo y se incubaron a 65 °C durante 10 min con mezcla constante. La fracción acuosa se separó del fenol–cloroformo por centrifugación (10 min, 20 000 g) y se precipitó etanol. Los ácidos nucleicos se trataron con DNasa I (Roche, Basilea, Suiza) durante 30 minutos a 37 °C seguido de 15 minutos a 75 °C de inactivación térmica. El ADN complementario se sintetizó utilizando 100 ng de ARN y 1 pmol de oligos de ADN con Superíndice III (Invitrogen, Darmstadt, Alemania) utilizando condiciones estándar. Los niveles de ARN se cuantificaron con qPCR utilizando el kit de QRT-PCR de DyNAmo Flash Biozym y se normalizaron al gen eucromático tdh1.

Se realizaron ensayos de cambio de movilidad electroforética de ARN

El ensayo de cambio de ARN se realizó siguiendo las condiciones previamente notificadas . En total, 0.se incubaron 66 pmol de ARN centromérico 30 nt radiomarcado 32P con cromodominio Chp1 de 10 µM (tipo salvaje y mutante) en un tampón que contenía 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, TDT de 0,5 mM y glicerol al 3%. Para el ARN EMSA con transcripciones centroméricas de 100 nt dg, se incubaron 2 pmol de ARN radiomarcado 32P con 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmoles de proteína Chp1CD (mutante en peso y LOOP1B/2B) en un volumen final de 15 µl. El péptido H3K9me3 (Eurogentec, Colonia, Alemania) se añadió en un péptido Chp1CD – H3K9me 1:1, como se informa en . La incubación se llevó a cabo durante 1 h en hielo y las muestras (20 µl de volumen final) se cargaron en un gel nativo de acrilamida-TBE al 10% (relación Bis-acrilamida 1:29). Para los pull-downs de ARN in vitro, se unió 1 µg de SUMO-Chp1CD (mutante de tipo salvaje y LOOP1B/2B) a 15 µl de resina de Ni-NTA (GE Healthcare) y se agregó el nucleosoma h3k9me3 para ensamblar el complejo de nucleosoma Chp1CD-H3K9ME3 en tampón de unión (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM TDT, 20 mM imidazol). Después de lavarse tres veces con 50 µl de tampón de unión, se agregaron 2 pmol de ARN 100nt dg marcado con 32P y se incubaron con la resina de nucleosoma Chp1CD en hielo durante 1 h. La resina se centrifugó a velocidad lenta (60 g, 10 s) y se recogió el flujo. La resina se lavó tres veces con un tampón de unión de al menos 3× (v/v) y el complejo Chp1CD-Nucleosoma-ARN se elutó mediante la adición de tampón imidazólico de 300 mM (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mm TDT, 300 mM imidazol), incubado durante 1 h en hielo con un intervalo de mezcla de 5 minutos (fracción unida). Las muestras se cargaron en un gel de acrilamida nativo al 10% TBE (relación Bis-acrilamida 1:29) y se corrieron durante 2 h a 10 mA a 4 °C. Después de la exposición nocturna, los geles se escanearon utilizando el fosfoimager TyphoonFLA9000.

Inmunoprecipitación con cromatina

Los cultivos de levadura (100 ml) se cultivaron hasta un OD600 de 0,7 y se reticularon con formaldehído al 3% a temperatura ambiente durante 15 minutos, como se describe . La reacción se apagó con glicina de 125 mm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se resuspendieron en tampón de lisis de 500 µl (50 mM HEPES pH 7,5, 1.5 m de acetato sódico, 5 mm MgCl2, 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético, 2 mM de ácido etilenglicol tetraacético, 0,1% de NP-40, 20% de glicerol) que contienen inhibidores de la proteasa (comprimidos de cóctel inhibidores de la proteasa, Roche, Completos, sin ácido etilendiaminotetraacético). Las células congeladas se lisaron con el batidor de bolas MP Biospec. Después de la lisis, el extracto se sonicó 35× durante 30 s (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Bélgica) y se hiló a 13 000 g durante 15 minutos para obtener el sobrenadante de cromatina. Para el ADN de entrada, se utilizaron 50 µl del sobrenadante. Para inmunoprecipitaciones, los sobrenadantes se normalizaron en función de la concentración de proteínas y se incubaron con anticuerpo anti-dimetilado H3K9 o anticuerpo anti-Chp1 (H3K9me2, no Abcam. Ab1220 y Chp1, Abcam no. Ab18191), inmovilizado en cabezales magnéticos, durante 2 h a 4 °C. Las perlas y la proteína inmovilizada se lavaron 5× con 1 ml de tampón de lisis. Las proteínas se elutaron incubando con 150 µl de tampón de elución (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM ácido etilendiaminotetraacético, dodecil sulfato de sodio al 1%) a 65 °C durante 15 min. Los enlaces cruzados se invirtieron por incubación a 65 °C durante la noche, seguido de degradación del ARN con la RNasa A y degradación de las proteínas con la proteinasa K. El ADN se recuperó mediante extracción de fenol–cloroformo y precipitación de etanol y se cuantificó mediante qPCR. Se utilizó el gen eucromático tdh1 para la normalización. Los oligonucleótidos utilizados en ensayos de inmunoprecipitación con cromatina se enumeran en la Tabla suplementaria S2.

Reconstitución in vitro de nucleosomas y metilación (H3K9me3)

Los nucleosomas se reconstituyeron utilizando histonas de Xenopus laevis y la secuencia 601 como se describió anteriormente . La metilación in vitro se realizó como se describe . El pico a + 42 Da se ha observado en la publicación original y no es una contaminación (Matt Simon, comunicación personal y descrito en).

Formación y elución de complejos nucleosómicos de Chp1CD–H3K9me3 MLA in vitro

En total, 5 µg de Chp1CD se unieron a 15 µl de resina de Ni-NTA en tampón de unión (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM TDT, 20 mM imidazol) durante 20 min a 4 °C. La resina se lavó una vez con cinco volúmenes de tampón de unión y se agregaron 10 µg de nucleosomas análogos de metil lisina (MLA) H3K9me3 (los nucleosomas de MLA se dializaron previamente en tampón de unión) en un volumen final de 20 µl y se incubaron 1 h en hielo con resuspensión constante cada 5 min. Después de la incubación, la resina se centrifugó (60 g durante 10 s) y se recogió el flujo. La resina se lavó tres veces con cinco volúmenes de tampón de unión. El complejo de nucleosoma SUMO-Chp1CD-h3k9me3 se eluyó añadiendo trombina (Sigma, Múnich, Alemania) durante 2 h en hielo en 20 µl de tampón de unión. A continuación, se evaluó la formación de complejos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS en geles de acrilamida al 15% y tinción EM negativa.

Ensayos de unión a péptidos Chp1CD H3K9me3

En total, se incubó 1 µg de péptido de Histona H3 (1-21)- GGK(Biotina) (Eurogentec) con 15 µl de resina de agarosa de estreptavidina (Invitrogen) en HEPES de 20 mM, pH 7,5, KCl de 75 mM, TDT de 0,5 mm. A continuación, se añadieron aproximadamente 5 µg de Chp1CD (tanto en peso como en mutantes) en un volumen final de 20 µl y se incubaron durante 1 h en hielo en las mismas condiciones tampón. La resina se lavó tres veces y luego se evaluó la eficiencia de unión mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS en geles de acrilamida al 15%. La cuantificación de la unión se realizó utilizando el software ImageJ. La unión de cada mutante se normalizó a wt Chp1CD para cada ensayo.

Termoforesis a microescala (MST)

Para la etiqueta SUMO MST se eliminó de las construcciones Chp1CD con proteasa Ulp1. En total, se etiquetaron fluorescentemente 100 µg de Chp1CD mutante y de tipo salvaje utilizando el Kit de Etiquetado de Proteínas Monolíticas MO-L003 BLUE-NHS (Reactivo a aminas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Nanotemper Technologies, Múnich, Alemania). Se calculó una relación de fluorescencia:Proteína de 1: 1 utilizando la función «Proteínas y etiquetas» del software Nanodrop1000 y cada Cromodominio Chp1 se ejecutó en un gel de acrilamida SDS al 15% para normalizar las concentraciones a 0,1 mg ml−1.

Las reacciones se ensamblaron en 20 µl con 300 ng de Chp1CD fluorescente y cantidades crecientes de péptido de Histona H3 (1-21)- GGK(Biotina) (Eurogentec) o nucleosomas H3k9me3, en un tampón que contenía 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mm TDT y 0,05% de interpolación-20. Para los ensayos de unión a nucleosomas H3K9ME3, se añadió glicerol a la concentración final del 10%. Para los ensayos H3K9me3, estas diluciones se utilizaron para mediciones: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µM, 800 µM, 1,2 µM, 1,8 µM. Para el ensayo de nucleosoma H3K9ME3, utilizamos las siguientes diluciones para las mediciones: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1.06 µM, 1.2 µM, 1.4 µM, 1.6 µM, 2.4 µM.

Se realizaron corridas de MST utilizando capilares tratados estándar (Nanotemper Cat # K002) en el NT.Instrumento monolítico 115. Todas las mediciones se realizaron con un 80% de LED y un 40% de potencia MST, con un tiempo de encendido del láser de 30 s y un tiempo de apagado del láser de 5 s. Para cada experimento, se realizaron cinco mediciones individuales.

Los datos fueron analizados con el software GraphPad Prism versión 6.00 (Software GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.) y el software SigmaPlot versión 13.0 (Software Systat, San José, CA, EE. UU.). Para los ensayos de unión a péptidos, con las curvas mostrando una tendencia sigmoide distinta, ajustamos la ecuación Sigmoidal Asimétrica Logística de cinco Parámetros de Richards y calculamos automáticamente el Kd. Para los ensayos de unión a nucleosomas H3K9ME3, como la tendencia de los datos brutos ya no era sigmoide para todas las proteínas analizadas, se utilizó una ecuación polinómica de tercer orden (cúbica) para ajustar y comparar los puntos de datos brutos de Chp1CD de tipo salvaje y los diferentes mutantes. Kd se calculó sobre la base de la función de «interpolación» del software GraphPad prism, utilizando el valor 50% ligado/no unido en el eje y.

Digestión de tripsina de nucleosomas

Se prepararon nucleosomas sin cola incubando nucleosomas reconstituidos con una resina de tripsina TPCK inmovilizada (termocientífica) durante 2 horas a temperatura ambiente en un tampón que contenía 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mm TDT . La digestión triptica genera bandas de histonas muy definidas y se ha caracterizado en detalle dónde corta exactamente la tripsina .

Los ensayos de unión a nucleosomas con mutantes Chp1CD

Los ensayos de unión a nucleosomas mutantes y de tipo salvaje Chp1CD se realizaron como se describió anteriormente para la formación del complejo de nucleosomas Chp1CD—H3KC9me3 MLA en HEPES de 20 mM pH 7,5, KCl de 100 mM, TDT de 0,5 mM, imidazol de 40 mm. Las resinas y los insumos se ejecutaron con electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-15% en gel de acrilamida. Todas las muestras fueron analizadas por inmunoblot con histona anti-H3 (AbCam, Cambridge, Reino Unido, 1:1000), o anticuerpo anti-H3K9me3 (AbCam, 1: 1000), IgG-HRP anti-cabra (BioRad, 1:3000), IgG-HRP anti-conejo (BioRad, Múnich, Alemania, 1:3000).

Microscopía electrónica de tinción negativa

Después de la elución de trombina, se detectaron 3 µl del complejo de nucleosomas Chp1CD–H3KC9me3 en una rejilla de cobre descargada incandescente (malla Cu 400 Q11916, Quantifoil, Großlöbichau, Alemania) recubierta con una película de carbono de 1 nm durante 45 s. Después de un lavado rápido con agua, la rejilla se incubó durante 15 s en uranilo al 2% Acetato. Se recogieron imágenes de tinción negativas en un microscopio electrónico de transmisión FEI Morgagni.

Crio-EM en el complejo de nucleosomas Chp1CD–H3KC9me3

Las rejillas Crio-EM (rejillas perforadas recubiertas de carbono, capa de carbono de malla Cu 300 R3/3+1 nm, Quantifoil) se prepararon utilizando un Vitrobot Mark IV (Empresa FEI). Los datos crio-EM se recolectaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión Titan-Krios (FEI Company, Hillsboro, OR, EE.UU.) a 200 KeV y un aumento de 113 000× en el plano del CCD utilizando una cámara CMOS F816 (TVIPS GmbH, Gauting, Alemania), lo que resultó en un tamaño de píxel de imagen de 1,2 Å por píxel en la escala del objeto (el tamaño de píxel del CCD fue de 13,6 µm). Para la recogida automatizada de datos se utilizó el software EM-TOOLS y los datos se recogieron en un rango de desenfoque de 10 000 a 40 000 Å.

En total, se seleccionaron 2 480 micrografías para el complejo Chp1CD–H3KC9me3 y 991 micrografías para el control de nucleosomas H3KC9me3, respectivamente, para el análisis de una sola partícula utilizando el paquete de software Xmipp (Figura Suplementaria S9A) . Unos miles de partículas se recogieron manualmente y se limpiaron cuidadosamente del ruido. Estas partículas se utilizaron para la selección de partículas semiautomática y automática en XMIPP. La función de transferencia de contraste fue determinada por CTFFIND3 . Las partículas individuales seleccionadas se convirtieron a formatos ARAÑA y RELIÓN para su posterior análisis (Figura suplementaria S9B). Las medias de clase bidimensionales se generaron con el paquete de software RELION (Figura suplementaria S9C). Se eliminaron los promedios de mala clase de los análisis de datos posteriores. Los refinamientos tridimensionales se realizaron posteriormente con los paquetes de software SPIDER y RELION .

La clasificación de partículas sin supervisión se realizó mediante siembra aleatoria con los mapas de densidad completos sin clasificación enfocada en el paquete de software SPIDER. Los intentos de utilizar la clasificación focalizada resultaron en un fuerte sesgo y sobreajuste de ruido en las regiones de interés. Por lo tanto, no utilizamos la clasificación enfocada para reducir el sesgo. En la clasificación inicial realizada en SPIDER, las clases C0-C6 y N0-N5 se retroproyectaron utilizando ángulos de mapas C0 y N0 y estas clases no se refinaron completamente. Aquí solo queríamos seleccionar clases que tuvieran densidad adicional unida al nucleosoma. Se separaron y clasificaron las partículas que generaban mapas con diferentes densidades de Chp1CD. Se realizaron aproximadamente 20 rondas de clasificaciones de siembra aleatorias hasta que se dividieron las partículas en cinco grupos diferentes (Figura suplementaria S3). Las clases C11–C15 se refinaron con el paquete de software RELION. Los refinamientos finales de los complejos de nucleosomas Chp1CD-h3k9me3 (clase C15) y el control de nucleosomas se realizaron con el paquete de software RELION. Para el refinamiento final, la referencia se filtró a ~50 Å (filtro RELION). La referencia que utilizamos no tenía ninguna de las características observadas en reconstrucciones refinadas (la doble hélice del ADN no se resuelve, el surco mayor no es visible, las hélices α no se resuelven). Esto indica que no hay sesgo de referencia en nuestra estructura. La resolución del control de nucleosomas alcanzó 7,3 Å usando el auto-refinamiento en RELIÓN y simetría C2 (corte FSC 0,143 de dos mapas refinados independientemente). El complejo de nucleosomas Chp1CD-h3k9me3 se refinó a 10 Å (corte FSC 0.143 de dos mapas refinados independientemente) sin simetría aplicada.

La resolución local se calculó utilizando el software ResMap (volumen único final, minRes = 7, maxRes = 14, máscara automática). La resolución media determinada por Resmap es de 9,4 Å para el complejo de nucleosomas Chp1CD-H3K9ME3, confirmando de forma independiente la resolución media determinada previamente de 10 Å (FSC 0,143) (Figura 1c). Para el complejo de nucleosoma Chp1CD-h3k9me3, la resolución local para el nucleosoma es de 9-10 Å y para el ligando ~10 Å (Figura 2a). La distribución del ángulo de Euler para las reconstrucciones finales se muestra tanto para el nucleosoma como para el complejo de nucleosomas Chp1CD-H3K9ME3 (Figura suplementaria S9D). Todas las orientaciones están presentes con preferencia por vistas superiores y laterales.

Los modelos moleculares se construyeron utilizando el paquete de software Chimera utilizando un ajuste de cuerpo rígido de estructuras de cristal . El ajuste a la densidad se realizó con las opciones de Quimera «Encajar en el mapa» y «Encajar en Segmentos» con solo pequeños ajustes manuales. La segmentación y visualización de todos los mapas crio-EM también se realizó con el software Chimera .