El Clostridium acetobutilicum anaeróbico industrial utiliza policétidos para regular la diferenciación celular

Cepas y medios bacterianos

C. El acetobutilicum ATCC 824 se cultivó en una cámara anaeróbica (Productos de laboratorio Tímidos) que contenían una atmósfera de 97% de nitrógeno y 3% de hidrógeno. El medio 2xytg67 contenía 16 g/L de triptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl y 10 g/L de glucosa (a menos que se indique lo contrario) con el pH ajustado a 5.2 para medios líquidos y 5,8 para medios sólidos (que también contienen 15 g/L de agar). El medio de crecimiento clostridial (CGM)68 contenía 30 g/L de glucosa (a menos que se indique lo contrario), 6,25 g/L de extracto de levadura, 2,5 g/L de sulfato de amonio, 1,25 g/L de NaCl, 2,5 g/L de asparagina, 0,95 g/L de fosfato de potasio monobásico, 0,95 g/L de fosfato de potasio dibásico, 0,5 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado, 13 mg/L de sulfato de manganeso heptahidratado y 13 mg/L de heptahidrato de sulfato de hierro con el pH ajustado a 6,4. El medio P269 contenía 80 g/L de glucosa (a menos que se indique lo contrario), 1 g/L de extracto de levadura, 2,2 g/L de acetato de amonio, 0.5 g/L de fosfato de potasio monobásico, 0,5 g/L de sulfato de potasio dibásico, 0,2 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado, 1 mg/L de ácido para-aminobenzoico, 1 mg/L de clorhidrato de tiamina, 10 µg/L de biotina, 10 mg/L de sulfato de manganeso heptahidratado, 10 mg/L de sulfato ferroso heptahidratado y 10 mg / L de NaCl con el pH ajustado a 6,4. El medio basal clostridial (CBM) 70 contenía 10 g/L de glucosa, 0,5 g/L de fosfato potásico monobásico, 0,5 g/L de fosfato potásico dibásico, 4 g / L de triptona, 0.2 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado, 10 mg/L de sulfato de manganeso heptahidratado, 10 mg/L de sulfato ferroso heptahidratado, 1 mg/L de ácido para-aminobenzoico, 1 mg/L de clorhidrato de tiamina y 2 µg/L de biotina con el pH ajustado a 6,9. Para las placas CGM sólidas, se añadió agar de 15 g/L. El CBM – S (utilizado para ensayos de esporulación líquida) fue idéntico al CBM, excepto que se utilizó 50 g/L de glucosa y se añadió 5 g/L de CaCO3 justo antes de la inoculación de cultivos. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) se cultivó en medio Luria-Bertani (LB) a 37 °C. Para las cepas de Clostridium adecuadas, los medios de cultivo se suplementaron con eritromicina (Ery; 40 µg/ml para medios sólidos, 80 µg/ml para medios líquidos) y/o tianfenicol (Th; 5 µg/ml para medios sólidos y líquidos). Se añadieron kanamicina (Kan; 60 µg/ml) o cloranfenicol (Cm; 25 µg/ml) a los medios de cultivo de E. coli según se indicó. Las cepas de Clostridium y E. coli se mantuvieron como reservas de glicerol al 20% v/v almacenadas a -80 ° C.

Construcción de plásmidos

Los oligonucleótidos se proporcionaron mediante Tecnologías Integradas de ADN (Tabla Suplementaria 5). Se utilizó polimerasa de pusión (NEB) para todas las reacciones de PCR. Para el aislamiento del ADN genómico de C. acetobutylicum ATCC 824, se utilizó un método de lisis alcalina71. C. acetobutilico se cultivó durante la noche en una fase de medio a estacionario de 2xYTG (OD600 > 2.0), momento en el que se centrifugaron 10 ml de cultivo a 3500×g durante 15 min (temperatura ambiente). Se desechó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en un tampón DE 5 mL (NaCl de 75 mM, EDTA de 25 mM pH 8,0, Tris-HCl de 20 mM, pH 7,5). Se añadió lisozima a una concentración final de 2 mg / ml, y la solución se mezcló suavemente. La mezcla se incubó a 37 °C durante 60 min con una mezcla suave realizada cada 15 min. Tras el período de incubación, se añadieron 660 µL de tampón de lisis (1 m de NaOH, 10% p/v de SDS) y se mezcló bien la solución. Se añadió proteinasa K a una concentración final de 0,5 mg / ml, y la solución se incubó a 55 °C durante 1 h. Después de este período de incubación, se añadió un volumen igual de fenol:cloroformo (1:1), y la solución se mezcló por inversión durante 5 min. La solución se centrifugó a 3500 × g durante 15 min (temperatura ambiente), y la fase acuosa superior se desechó mediante pipeteo. A la fase orgánica, se añadió acetato de sodio de 3 M (10% v/v en solución final). Para precipitar el ADN genómico, se agregaron 2 volúmenes de etanol y se mezcló la solución. El ADN genómico precipitado se recolectó con un gancho de vidrio y se lavó con etanol al 70%. El ADN lavado se secó sobre gas nitrógeno durante 15 minutos, se resuspendió en tampón de bajo TE (10 mm Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) y se disolvió mediante incubación a 50 °C.

Para construir el plásmido pKO_mazF_mod (que más tarde serviría como plantilla para pKO_pks), se utilizaron los cebadores pKON_Fo y pKON_Ro para amplificar por PCR una región de 5,0 kb de la plantilla pko_mazf15. Este paso fue necesario para eliminar una región de 677 pb de la columna vertebral pKO_mazF, que no pudimos amplificar a través de PCR. El producto de PCR de 5.0 kb se purificó en gel, se digirió en los extremos de 5′ y 3′ usando PshAI, se ligó para formar pKO_mazF_mod y se transformó en E. coli TOP10. Los clones transformantes se seleccionaron mediante digestión por prueba de plásmido purificado, y se utilizó la secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia del clon final pKO_mazF_mod. Para la construcción de plásmidos pKO_pks (para la deleción del gen pks de C. acetobutilicum), una región de 3,8 kb que contenía colE1, repL, bgaR y mazF se amplificó por PCR a partir de pKO_mazF_mod utilizando cebadores pKO_F y pKO_R. Además, se utilizaron cebadores UHR_Fo y UHR_Ro, y DHR_Fo y DHR_Ro para amplificar por PCR regiones de 1 kb que representaban las regiones homólogas aguas arriba y aguas abajo (UHR y DHR) flanqueando el gen pks (CA_C3355) de una C. plantilla de ADN genómico acetobutilicum ATCC 824. El gen de resistencia al cloranfenicol / tianfenicol y el promotor constitutivo (P ptb de C. acetobutylicum) se amplificaron por PCR a partir de pKO_mazF_mod utilizando cebadores CMR_F y CMR_R (región de 1,1 kb). Estos cuatro productos de PCR se ligaron a través del ensamblaje Gibson y se transformaron en E. coli TOP10. Los clones transformantes se seleccionaron mediante digestión por prueba de plásmido purificado, y se utilizó la secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia del clon final de pKO_pks. Para construir plásmido pAN315 (necesario para la metilación de pKO_pks y pCKO_pks antes de la transformación en C. acetobutilicum), una región de 6,4 kb del plásmido pAN172 se amplificó utilizando cebadores pAN1_F y pAN1_R, y una región de 1,0 kb que contenía el gen de resistencia a la kanamicina del vector pCOLA_Duet se amplificó utilizando cebadores KAN_Fo y KAN_Ro. Los productos de PCR extraídos en gel se ligaron a través del ensamblaje de Gibson y se transformaron en E. coli TOP10. Los clones transformantes se seleccionaron mediante digestión de prueba de plásmido purificado, y se utilizó la secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia del clon final de pAN3. Para construir plásmidos pCKO_pks (para la expresión del gen pks bajo el promotor de crotonasa constitutivo de C. acetobutilicum), los cebadores CPKS_Fo y CPKS_Ro se utilizaron para amplificar por PCR el gen acetobutilicum ATCC 824 pks de 5,4 kb C. (CA_C3355) con voladizos apropiados para el ensamblaje de Gibson. La columna vertebral pWIS_empty vector71 (que contiene el promotor crt constitutivo aguas arriba del sitio de clonación múltiple) se amplificó por PCR utilizando cebadores pWIS_F y pWIS_R, lo que produjo un producto de 5,0 kb. Los dos productos de PCR purificados en gel se ligaron a través del ensamblaje Gibson y se transformaron en E. coli TOP10. Los clones transformantes se seleccionaron mediante digestión de prueba de plásmido purificado, y se utilizó la secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia del clon final de pCKO_pks.

Para construir el plásmido pET24b_pks, el gen pks ATCC 824 de C. acetobutylicum de 5,4 kb (CA_C3355) se amplificó a partir del ADN genómico de C. acetobutylicum utilizando los cebadores PKS_Fo y PKS_Ro. El vector pET24b doblemente digerido (EcoRI / XhoI digerido) se ligó con un producto de PCR pks doblemente digerido (EcoRI/XhoI digerido), y el producto de ligadura se transformó en E. coli TOP10. Los clones transformantes se seleccionaron mediante digestión por prueba de plásmido purificado, y se utilizó la secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia del clon final de pET24b_pks.

Electro-transformación de C. acetobutylicum

Antes de la transformación en C. acetobutylicum, el vector pKO_pks fue co-transformado con pAN3 en E. coli TOP10 a través de electroporación. Este procedimiento permitió la metilación de pKO_pks necesaria para superar el sistema nativo de restricción-modificación activo en C. acetobutylicum 72. Purificación de plásmidos de E. se realizó un cultivo líquido de coli pKO_pks/pAN3, y la mezcla de plásmidos resultante se utilizó para electroporaciones de C. acetobutilicum utilizando el método previamente publicado 72 que detallamos aquí. Para preparar células electrocompetentes, una sola colonia de C. acetobutylicum de una placa de 2xYTG (de más de 1 semana de edad) se sometió a una descarga térmica a 80 °C durante 10 minutos y se utilizó para inocular 10 ml de MCG. Después de incubar durante la noche a 37 ° C y alcanzar la fase media exponencial (OD600 0,4-0,9), se utilizó un cultivo de 6 mL para inocular 54 mL de 2xYTG frescos. Esta subcultura se incubó a 37 ° C hasta alcanzar OD600 1.2 (~5 h), momento en el que la subcultura se centrifugó a 3500×g durante 20 min (4 °C). Tras la eliminación del sobrenadante, el sedimento celular se resuspendió en un tampón de electroporación helado de 20 ml (EPB; sacarosa de 270 mm, NaH2PO4 de 5 mM, pH 7,4). Las células resuspendidas se centrifugaron a 3500 × g durante 10 min (4 °C), se desechó el sobrenadante y se resuspendió el gránulo celular en 20 mL de EPB helada. Después de una granulación final por centrifugación a 3500×g durante 10 min (4 °C), se desechó el sobrenadante y se resuspendió el gránulo en 2,3 ml de EPB helada. Esta resuspensión final se utilizó como reserva de células electrocompetentes. Las electro transformaciones se realizaron mezclando primero (sobre hielo) 500 µL de células competentes y ~20 µL de solución de ADN plásmido (1-5 µg en total) para ser transformadas. La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,4 cm, y se dejó incubar en hielo durante 15 minutos. Las electroporaciones se realizaron con los siguientes parámetros: tensión, 2000 V; capacitancia, 25 µF; resistencia, infinito Ω. Tras la electroporación, las muestras se resuspendieron en 1 ml de 2xYTG y se transfirieron a un tubo que contenía 9 ml de 2xYTG. Después de la mezcla por inversión, se permitió que los cultivos se recuperaran a 37 °C durante 4 h. Los cultivos de recuperación se centrifugaron a 3500×g durante 15 min (temperatura ambiente) y se desechó el sobrenadante. El pellet celular se resuspendió en 500 µL de 2xYTG, y 100 µL se platearon en placas sólidas de 2xYTG suplementadas con el antibiótico apropiado. La placa se incubó a 37 °C durante 2-3 días, y las colonias transformantes se sometieron a verificación basada en PCR.

Deleción del gen pks y complementación genética

KO dirigido del gen pks (ca_c3355) en C. el acetobutilicum ATCC 824 se logró utilizando el método publicado previamente15. En detalle, 5 µg de mezcla de plásmido pKO_pks/pAN3 metilado se transformaron en C. acetobutilicum utilizando el método descrito anteriormente. Tras la recuperación en medio líquido de 2xYTG durante 4 h, los pellets de células se recogieron por centrifugación (3500×g, 15 min, a temperatura ambiente), se resuspendieron en 0,5 ml de 2xYTG líquido fresco y 100 µL del cultivo celular resuspendido se platearon en placas sólidas de 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 mM β-lactosa. En estas condiciones de recubrimiento, solo se espera que sobrevivan las células que han sufrido el evento de recombinación homóloga de doble cruce deseado. La contraelección de la columna vertebral del vector es proporcionada por el promotor inducible a lactosa (P bgaL ), que impulsa el gen de la toxina mazF en la columna vertebral del vector pKO_pks. Después de este procedimiento de recubrimiento, se observaron aproximadamente 10 colonias en las placas de β-lactosa de 2xYTG + 5 µg / mL Th + 40 mm. De estas 10 colonias, cuatro fueron reimplantadas dos veces y sometidas a la verificación por PCR de la colonia. Se utilizaron cuatro juegos de cebadores como base para la verificación de PCR de colonias, como se detalla en la Fig. 2.

Para generar la cepa de complementación genética pks, se realizó la electroporación de ∆pks C. acetobutilicum con una mezcla de plásmido pCKO_pks/pAN3 como se describió anteriormente. Después de la electroporación y recuperación, los cultivos se platearon en medios sólidos de 2xYTG + 5 µg/ml Th + 40 µg/ml Ery. Después de repasar dos veces en medios Ery sólidos de 2xYTG + 5 µg/ml Th + 40 µg/mL, las colonias potenciales que albergaban pCKO_pks se examinaron mediante PCR de colonias utilizando cebadores pCKO_F y pCKO_R.

LC-HRMS análisis metabolómico

Para no focalizados metabolómicos comparaciones de tipo salvaje y ∆pqr C. acetobutylicum, colonias individuales de cada cepa fueron calor sorprendió a 80 °C durante 10 min y se utiliza para inocular 10 mL de líquido CGM (30 g/L de glucosa). Después de la incubación nocturna (estancada) hasta alcanzar OD600 ~1.0, estos cultivos se utilizaron para inocular 10 ml de CGM líquido (80 g/L de glucosa) con un inóculo al 10% para subculturación. Después de ~5 h (OD600 ~1.0) de crecimiento estancado, las subculturas se utilizaron para inocular fermentaciones de matraz cuádruplicadas (70 ml CGM, 80 g/L de glucosa + 5 µL Antiespumante 204, inóculo al 3%) agitadas a través de barras de agitación magnéticas. Se añadió carbonato de calcio (6 g/L) a los medios de fermentación para amortiguar el pH. Todos los cultivos se realizaron a 37 °C. Se incluyeron aproximadamente 5 µg/ml de Th en todos los cultivos de ERS pks, con la excepción del cultivo de fermentación final, ya que se sabe que ciertos antibióticos perturban las fases de fermentación de ABE. Se tomaron muestras de caldo de fermentación (1 mL) de cada réplica durante la fase estacionaria temprana y se extrajeron con 3 mL de cloroformo metanol 2:1. Las mezclas se agitaron en vórtice, se separaron mediante centrifugación (2700 × g, 10 min) y la capa inferior rica en cloroformo se transfirió a un vial de vidrio. Estos extractos orgánicos se secaron con gas nitrógeno, se resuspendieron en metanol de 100 µL y se inyectaron 10 µL en un instrumento LC-MS QTOF de Masa precisa Agilent Technologies 6520 equipado con una columna Eclipse Plus C18 Agilent (4,6 × 100 mm). Se utilizó un gradiente lineal de 2-98% de CH3CN (vol/vol) durante 40 min en H2O con ácido fórmico al 0,1% (vol/vol) a un caudal de 0,5 ml/min. La plataforma de análisis metabolómico XCMS16 (Instituto de Investigación Scripps) se utilizó para comparar los metabolomas de cepas pks de tipo salvaje y ERS basándose en los datos de MS-LC cuadruplicados. Picos de MS exclusivos de ∆pks (Fig. 1a) fueron identificados utilizando los siguientes parámetros: valor de p < 0,01, cambio de pliegue > 10,0, intensidad máxima > 5000.

Fermentaciones de biorreactores

Para comparar los perfiles de fermentación ABE de tipo salvaje y ∆pks C. se realizaron fermentaciones de acetobutilico y biorreactor en Biorreactores DASGIP (recipientes de 4 × GPI 100, Sistema Biobloque DASGIP) con volúmenes de trabajo de 500 mL. Cultivos nocturnos (10 ml de CGM, 30 g/L de glucosa, estancados, 34 °C) inoculados con colonias individuales de C. acetobutylicum sometidas a choque térmico se cultivaron hasta alcanzar OD600 ~1. Se utilizó un inóculo al 10% para iniciar una subcultura (30 ml de medio P2, 80 g/L de glucosa, estancada, 34 °C), y la subcultura se incubó hasta alcanzar OD600 ~1. Los subcultivos de 30 mL se transfirieron asépticamente a Biorreactores DASGIP individuales precargados con medio P2 de 500 mL (80 g/L de glucosa, 100 µL Antiespumante 204, 34 °C). Las fermentaciones se permitieron durante 54 h con muestreo periódico para mediciones de densidad óptica, análisis de productos de fermentación y cuantificación de los compuestos 1, 2 y 3. La temperatura se mantuvo a 34 °C durante toda la fermentación, la agitación se proporcionó agitando a 200 rpm y el pH se mantuvo por encima de 5,0 mediante la adición automática de 3 M NH4OH. Para mantener las condiciones anaeróbicas, se roció gas nitrógeno libre de oxígeno a una velocidad de 2 sL/h durante la fermentación. Para la cuantificación de los compuestos 1, 2 y 3, se mezcló 1 mL de caldo de fermentación con 3 ml de acetato de etilo, en vórtice, separado por centrifugación (2700×g, 10 min, a temperatura ambiente) y se aisló la capa orgánica superior. La capa orgánica se secó por evaporación rotativa, se resuspendió en metanol de 200 µL y se inyectaron 20 µL en un instrumento LC-MS cuadrupolar Agilent Technologies 6120 (con DAD) equipado con una columna Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Se utilizó un gradiente lineal de 2-98% de CH3CN (vol/vol) durante 40 min en H2O con ácido fórmico al 0,1% (vol/vol) a un caudal de 0,5 ml/min. Los compuestos 1, 2 y 3 se identificaron por absorción UV (240 nm), como se demuestra en la Fig. 1b, y se cuantificaron por el área de pico integrada (absorbancia a 240 nm).

Procedimientos analíticos de fermentación

Se utilizó un espectrofotómetro para determinar las densidades celulares midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD600). Se utilizó un sistema UFLC de prominencia Shimadzu equipado con una columna Biorad Aminex HPX-87H (300 mm × 7,8 mm) para analizar C. caldo de fermentación de acetobutílico para la concentración de glucosa y productos de fermentación (acetato, butirato, lactato, acetona, butanol y etanol). Las muestras de caldo de fermentación (1 mL) se peletizaron primero mediante centrifugación a 10.000×g durante 3 minutos, seguido de la filtración del sobrenadante utilizando un filtro de jeringa de PVDF de 0,22 micras. Se inyectaron muestras de sobrenadante filtrado (20 µL) en el sistema UFLC con fase móvil de ácido sulfúrico de 0,01 N fluyendo a 0,7 ml/min, temperatura de columna de 35 °C, y se cromatografiaron durante 35 min. Los analitos se detectaron mediante un detector de índice de refracción (utilizado para cuantificar las concentraciones de glucosa, acetato, lactato, butanol y etanol) y un detector de matriz de diodos (utilizado para cuantificar las concentraciones de butirato (208 nm) y acetona (265 nm)).

Aislamiento de ARN y análisis de ARN-Seq

Se tomaron muestras (10 mL) de caldo de fermentación en triplicado biológico a partir de fermentaciones biorreactores de tipo silvestre y ∆pks C. acetobutylicum 26 h post inoculación. Las muestras se centrifugaron (4000 × g, 10 min, 4 ° C) y los pellets se resuspendieron y almacenaron en reactivo celular RNAprotect (Qiagen). El ARN total se extrajo utilizando un Mini kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó un tratamiento de DNasa en columna con DNasa I (libre de RNasa) (NEB). El control de calidad del ARN, la construcción de bibliotecas y la secuenciación de bibliotecas fueron realizados por el Laboratorio de Genómica Funcional QB3 de la Universidad de California-Berkeley y el Laboratorio de Secuenciación Genómica Vincent J. Coates. La calidad y la concentración de ARN se evaluaron utilizando un nanochip en un bioanalizador Agilent 2100. El ARNr bacteriano 16S y 23S se eliminó utilizando un kit RiboZero (Illumina). El ARN mensajero resultante (ARNm) se convirtió en una biblioteca de ARN-Seq utilizando un kit de construcción de biblioteca de ARNm-Seq (Illumina). La secuenciación de la biblioteca de ARN se realizó en un Illumina HiSeq4000 con lecturas de un solo extremo de 50 pb. Las lecturas de secuenciación (50 pb) se procesaron y se asignaron al genoma de C. acetobutylicum ATCC 824 (acceso NCBI NC_003030.1 y NC_001988.2 ) utilizando CLC Genomics Workbench 9.0 con parámetros predeterminados. Se descartaron las lecturas que no se alineaban de manera única con el genoma. Las diferencias en la expresión génica entre el tipo salvaje y el xt pks C. acetobutylicum se calcularon utilizando el mismo software. Los genes se consideraron expresados diferencialmente con valor de p < 0,003 (basado en una prueba t no apareada, n = 3) y |cambio de pliegue normalizado |> 2,0. Se calcularon correcciones falsas de la tasa de descubrimiento a los valores de p en CLC Genomics Workbench 9.0 utilizando un método publicado73. Los resultados del análisis de ARN-Seq se presentan en los Datos complementarios 1. Se realizó un análisis DE STRING30 para determinar las posibles interacciones proteína-proteína entre los genes expresados diferencialmente revelados por el análisis de ARN-Seq.

Ensayos de comparación de fenotipos

Se realizaron ensayos de esporulación líquida con pequeñas modificaciones74. Se tomaron muestras de cultivos biológicos líquidos triplicados después de 5 días de incubación (30 mL CBM-S, 37 °C). Las muestras de 20 µL se sometieron a descargas térmicas (80 ° C, 10 min), se detectaron diluciones (101-106) en placas de 2xYTG y se enumeraron colonias después de 30 h de incubación (37 °C) para calcular el número de unidades formadoras de colonias resistentes al calor (ufc/mL). Para la complementación química de ERS pks en el ensayo de esporulación líquida, se suplementó clostrienosa purificada (concentración final de 3,5 µM) en cultivos CBM-S de ers pks C. acetobutilicum en el momento de la inoculación. Dado que el compuesto 3 se añadió como solución concentrada en metanol, se añadió el volumen equivalente de metanol (60 µL) a todos los demás cultivos de ensayo de esporulación líquida (de tipo salvaje y no complementado ∆pks) para controlar este efecto.

Para los ensayos de esporulación sólida, se empleó un método descrito previamente75 con algunas modificaciones. En detalle, las colonias individuales de choque térmico (80 °C, 10 min) se cultivaron en medios líquidos (10 ml CGM, 37 °C) durante 24 h. Los cultivos se diluyeron por un factor de 106 y se platearon en CBM sólido. El muestreo se llevó a cabo 1, 2, 3, 4 y 6 días después del enchapado inicial. Para el muestreo, se combinaron tres colonias individuales y se resuspendieron completamente en 60 µL de MCG líquido. 20 µL de la mezcla de colonias resuspendidas se sometieron a descargas térmicas (80 ° C, 10 min), se detectaron diluciones (101-106) en placas de 2xYTG y se enumeraron colonias después de 30 h de incubación (37 °C) para calcular el número de unidades formadoras de colonias resistentes al calor (ufc/colonia). Todas las muestras se realizaron como triplicados biológicos.

Se realizaron ensayos de acumulación de granulosa mediante tinción de yodo53. Los cultivos líquidos de fase logarítmica media (OD600 ~0,6) (P2, 37 °C) se platearon en medio sólido de 2xYTG con niveles elevados de glucosa (50 g/L) para permitir la producción de granulosa. Las placas se incubaron a 30 °C durante 4 días, momento en el que se teñieron por exposición a un lecho de cristales de yodo durante 10 min. Se permitió que las placas se destinaran durante 10 minutos antes de la toma de imágenes. Para la complementación química de XT pks en el ensayo de acumulación de granulosa, se incrustó clostrienosa purificada (concentración de placa final de 4,0 µM) en placas sólidas de 2xYTG antes del recubrimiento del cultivo de xt pks. Dado que se añadió clostrienosa a las placas de 2xYTG como solución concentrada en metanol (mezclada en el medio fundido antes de la solidificación), se añadió el volumen equivalente de metanol (6 µL) a todas las demás placas de 2xYTG utilizadas en los ensayos de acumulación de granulosa para controlar este efecto.

Se observaron y tomaron imágenes de colonias individuales de C. acetobutilicum cultivadas en placas CBM durante 48 h (37 °C) utilizando un microscopio de disección Leica MZ16 F equipado con una cámara Leica DFC300 FX.

Se realizaron ensayos de dispersión de aceite como se describieron previamente76, 77, 78. En detalle, se llenó un vaso de precipitados de vidrio de 400 mL (7,5 cm de diámetro interior) con 300 mL de agua, y se añadió una gota de aceite de lámpara de parafina de 10 µL, que se dejó esparcir en una película delgada sobre la superficie del agua durante un período de 5 minutos (~25 mm de diámetro). Se prepararon soluciones de surfactina, clostrienosa purificada y un control tampón de fosfato de potasio al pH y la concentración indicados (preparado en tampón de fosfato de potasio de 10 mm). Se agregaron cuidadosamente alrededor de 10 µL de muestra al centro de la película de aceite y se observó el efecto en la película de aceite. Se espera que las muestras con actividad de surfactante formen zonas circulares estables de limpieza en la película de aceite, con una actividad de surfactante más potente correspondiente a zonas de limpieza más grandes (o dispersión completa de la película de aceite para una actividad de surfactante muy alta). Se realizaron ensayos de colapso de caída 77, 79, 80. Las microondas circulares (8 mm de diámetro interior) dentro de la tapa de poliestireno de una placa de 96 microondas (12,7 × 8,5 cm) se recubrieron con una fina capa de aceite de lámpara de parafina agregando 2,0 µL de aceite de lámpara de parafina a cada pozo, y permitiendo que la gotita se distribuyera uniformemente sobre el microondas durante un período de 1 hora. Se prepararon muestras de surfactina, clostrienosa purificada y control de fosfato de potasio para los ensayos de propagación de aceite. Se añadieron cuidadosamente unos 5 µL de muestra al centro de la microcelda. Después de 5 minutos, se observó la forma y el grado de propagación de la gotita. Mientras que se espera que los controles de tampón formen perlas estables en la superficie de la microcelda, se espera que las muestras que contienen surfactante colapsen y se extiendan sobre la superficie de la microcelda, con una actividad de surfactante más potente que corresponde a un mayor grado de propagación de gotas.

Purificación y análisis in vitro de la proteína PKS

Para purificar la proteína PKS marcada con His6 para el análisis in vitro, pET24b_pks se transformó en E. coli BAP1. Se inoculó una sola colonia en kanamicina (Kan) de 10 mL LB + 50 µg/mL para un crecimiento nocturno a 37 °C. Se utilizaron aproximadamente 7 mL de cultivo nocturno para inocular 700 mL LB + 50 µg/mL Kan, y el cultivo se agitó a 240 rpm y 37 °C hasta alcanzar OD600 de 0,5. Después de glasear el cultivo durante 10 minutos, se añadió isopropil tio-β-d-galactósido (IPTG) a una concentración final de 0.1 mM para inducir la expresión de proteínas, y el cultivo se incubó a 16 °C durante 16 h. Las células se recolectaron por centrifugación (5500 × g, 4 ° C, 20 min), se resuspendieron en tampón de lisis de 25 mL (HEPES de 25 mM, pH 8,0, NaCl de 0,5 M, imidazol de 5 mm) y se lisaron por homogeneización sobre hielo. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (17.700 × g, 4 ° C, 60 min) y se añadió resina de agarosa de Ni-NTA al sobrenadante (cultivo de 2 mL/L). La mezcla se nutalizó a 4 °C durante 1 h, se cargó en una columna de flujo de gravedad y la proteína PKS se elutó con concentraciones crecientes de imidazol en el tampón A (20 mM HEPES, pH 8,0, TDT de 1 mM). La proteína PKS purificada se concentró e intercambió tampón en tampón A + 10% de glicerol utilizando un concentrador centrífugo Vivaspin. Alícuotas de proteína PKS purificada fueron alícuotas y congeladas en nitrógeno líquido. El rendimiento proteico aproximado fue de 5 mg / L (203 kDa).

Ensayo de carga PKS con sustrato marcado con 14C contenido, en un volumen total de 15 µL, 4 mm ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.CoA de 5 mM, ácido 2-14C-malónico (0,1 µCi), MatB de 10 µM, PKS de 17 µM y HEPES de 50 mM, pH 8,0. Después de 2 h de incubación a 25 °C, las muestras se apagaron agregando un volumen igual de 1× tampón de muestra SDS. Tras el análisis de la SDS-PAGE con un gel de 4-15% TGX (Criterio), el gel se secó durante 2 h a 50 °C y se expuso en una pantalla de fósforo de almacenamiento (20 × 25 cm; Dinámica Molecular) durante 5 días. Se tomó una imagen de proteína radiomarcada en un fosforimager Typhoon 9400 (modo de almacenamiento de fósforo, resolución de 50 µm; Amersham Biosciences).

Para los ensayos de producto in vitro (50 µL) de la proteína PKS, se incubaron 8 µM de PKS con malonil-CoA (2 mm) en tampón de fosfato (100 mM, pH 7,0) a temperatura ambiente durante 2 h para generar el compuesto 4, identificado en comparación con un estándar químico. Se añadió NADPH (2 mm) al ensayo para generar los compuestos 5 y 6, los cuales se identificaron en comparación con los estándares químicos. Tras la incubación, las mezclas de ensayo se extrajeron dos veces con 100 µL de acetato de etilo al 99%/ácido acético al 1% (v / v). Los extractos orgánicos se secaron y resuspendieron en 100 µL de metanol, y se inyectaron 10 µL en un instrumento LC-MS cuadrupolar Agilent Technologies 6120 (con DAD) equipado con una columna Agilent Eclipse Más C18 (4,6 × 100 mm). Se utilizó un gradiente lineal de 2-98% de CH3CN (vol/vol) durante 40 min en H2O con ácido fórmico al 0,1% (vol/vol) a un caudal de 0,5 ml/min. El análisis LC-HRMS de los extractos de ensayo se realizó en un instrumento LC-MS de QTOF de masa precisa Agilent Technologies 6520 equipado con una columna Agilent Eclipse Más C18 (4.6 × 100 mm) utilizando el mismo gradiente de disolvente y caudal descritos anteriormente.

Disponibilidad de datos

Los datos ARN-seq generados en este estudio se han depositado en ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) con el número de acceso E-MTAB-6019. Todos los demás datos pertinentes están disponibles a petición de los autores.