El clemizol y los moduladores de la señalización de serotonina suprimen las convulsiones en el síndrome de Dravet

Resumen

El síndrome de Dravet es una epilepsia infantil catastrófica con convulsiones de inicio temprano, retraso en el desarrollo del lenguaje y motor, trastornos del sueño, comportamiento similar a la ansiedad, déficit cognitivo grave y un mayor riesgo de muerte. Es causada principalmente por mutaciones de novo del gen SCN1A que codifica un canal neuronal de sodio activado por voltaje. El pez cebra con una mutación en el homólogo SCN1A recapitula la actividad convulsiva espontánea e imita los movimientos conductuales convulsivos observados en el síndrome de Dravet. Aquí, mostramos que el cribado fenotípico de bibliotecas de fármacos en mutantes scn1 de pez cebra identifica rápida y exitosamente nuevas terapias. Demostramos que el clemizol se une a los receptores de serotonina y su actividad antiepiléptica puede ser imitada por medicamentos que actúan sobre las vías de señalización de serotonina, por ejemplo, trazodona y lorcaserina. Coincidiendo con estos hallazgos de pez cebra, tratamos a cinco pacientes con síndrome de Dravet médicamente intratables con un agonista de los receptores de serotonina aprobado clínicamente (lorcaserina, Belviq®) y observamos algunos resultados prometedores en términos de reducción de la frecuencia y/o gravedad de las convulsiones. Nuestros hallazgos demuestran un camino rápido desde el descubrimiento preclínico en peces cebra, a través de la identificación de objetivos, hasta posibles tratamientos clínicos para el síndrome de Dravet.

Introducción

Las epilepsias infantiles clasificadas como catastróficas a menudo se asocian con una mutación genética. Entre estos, el síndrome de Dravet se ha relacionado con más de 600 mutaciones de novo en un solo gen, SCN1A (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). Los niños con síndrome de Dravet presentan convulsiones a partir de los 6 meses de edad, retraso en el desarrollo del lenguaje y motor, trastornos del sueño, comportamiento similar a la ansiedad y déficit cognitivo grave (Dravet, 2011). También se han notificado síntomas de trastorno del espectro autista(Li et al., 2011) y el riesgo de muerte súbita inexplicable con epilepsia (SUDEP) en esta población se estima en 15 veces más alto que otras epilepsias infantiles (Kearney, 2013). Los medicamentos antiepilépticos disponibles no ofrecen un control adecuado de las convulsiones y los procedimientos neuroquirúrgicos resectivos no suelen ser una opción. Los nuevos tratamientos para el síndrome de Dravet siguen siendo una importante necesidad insatisfecha a pesar de cierto nivel de eficacia en ensayos clínicos limitados de cannabidiol (Epidiolex®) y estiripentol (Diacomit®), que pueden estar asociados con problemas cognitivos o de seguridad del apetito, respectivamente (Perez et al., 1999; Chiron et al., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky et al., 2016).

Se han identificado mutaciones en SCN1A, un gen que codifica la subunidad α formadora de poros de un canal de sodio activado por voltaje (Nav1.1), en casi el 85% de los pacientes con síndrome de Dravet (Dravet, 2011). Los canales Nav1.1 contribuyen a la rápida despolarización de las membranas neuronales observada durante la generación de potencial de acción (Hodgkin et al., 1952). Los ratones heterocigotos para una mutación de pérdida de función en Nav1. 1 desarrollan convulsiones espontáneas y sensibles a la temperatura al principio de la vida, y mueren prematuramente alrededor del día 25 postnatal (Yu et al., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Los estudios de electrofisiología aguda en estos ratones con deficiencia de Scn1a y otros relacionados sugieren una reducción en la densidad de corriente de sodio y una disminución asociada en la actividad de disparo para una subpoblación de neuronas inhibidoras que expresan GABA (pero no células principales excitadoras) que culminan en una inhibición sináptica reducida e hiperexcitabilidad de la red (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Esta hipótesis de «interneuronopatía» es consistente con otras formas de epilepsias infantiles catastróficas y se confirmó en ratones en los que el Scn1a se eliminó selectivamente de subpoblaciones de interneuronas que expresan parvalbúmina o somatostatina (Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). También se notificaron comportamientos de tipo autista en estos ratones(Han et al., 2012). Curiosamente, los estudios iniciales sobre neuronas excitadoras e inhibitorias humanas derivadas utilizando tecnología de células madre pluripotentes inducidas de dos pacientes con síndrome de Dravet informaron déficits en la corriente de sodio activada por voltaje para ambos tipos de células, lo que sugiere una compensación homeostática para la pérdida temprana de la función de un canal de sodio crítico específico para el cerebro, o mecanismos adicionales que contribuyen al fenotipo epiléptico observado en estos pacientes (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013).

Aunque los ratones y las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos contribuyen a nuestra comprensión de la fisiopatología subyacente del síndrome de Dravet, estos sistemas no son adecuados para la rápida identificación de nuevas terapias debido a la variabilidad de estos modelos y la reproducibilidad de las mediciones cuantitativas. Como pez cebra, son un sistema de modelos de vertebrados ideal para realizar cribas basadas en fenotipos de moléculas pequeñas (MacRae et al., 2015), y son susceptibles a manipulaciones genéticas, centramos nuestros esfuerzos en un mutante del canal de sodio del pez cebra. Los mutantes de pez cebra que albergaban una mutación de pérdida de sentido de la función en el ortólogo SCN1A, scn1Lab, se identificaron en una prueba de mutagénesis (Schoonheim et al., 2010). Debido a una duplicación ancestral del genoma completo, los mutantes de pez cebra scn1Lab son haploinsuficientes para Nav1.1 y análogos a ratones Scn1a+/− o pacientes con síndrome de Dravet. Se observan comportamientos convulsivos y episodios de descarga electrográfica interictal breve y de larga duración tipo polispike ictal en larvas mutantes tan pronto como 3 días después de la fertilización (dpf) con progresión a fenotipos de convulsiones más robustos entre 4 y 7 dpf (Baraban et al., 2013; Hong et al., 2016). Las larvas mutantes mueren prematuramente, exhiben déficits metabólicos (Kumar et al., 2016), y son resistentes a muchos medicamentos antiepilépticos (DEA) (Dinday et al., 2015). De manera similar al tratamiento clínico del síndrome de Dravet, se puede obtener cierta atenuación de la actividad convulsiva con valproato, benzodiazepinas, bromuros, estiripentol, así como una dieta cetogénica (Baraban et al., 2013). Utilizando larvas de pez cebra mutantes de scn1Lab y una estrategia de detección basada en fenotipos de dos etapas, ahora hemos examinado más de 2300 compuestos. El clemizol, un antagonista del receptor de histamina (H1) de primera generación, se identificó como un potente inhibidor de la actividad conductual y electrográfica de las convulsiones (Baraban et al., 2013). Sin embargo, los antihistamínicos están contraindicados en poblaciones pediátricas con epilepsia (Miyata et al., 2011) y el análogo del receptor H1 en el pez cebra muestra menos del 50% de similitud con el ser humano (Peitsaro et al., 2007). Aquí, utilizamos modelos preclínicos de pez cebra para demostrar que el clemizol, pero no los antihistamínicos, ejercen actividad antiepiléptica. Sobre la base de la unión de ligandos y la detección de fármacos dirigidos adicionales en peces cebra mutantes de scn1, identificamos varios moduladores de serotonina (5-HT) como efectivos para suprimir las convulsiones, incluidos dos compuestos aprobados por la FDA (trazodona y lorcaserina). La lorcaserina (Belviq®) se recetó en el marco de un programa de uso compasivo a niños con síndrome de Dravet y resultó en una reducción de la actividad convulsiva en algunos pacientes. Proponemos que la modulación de la señalización de 5-HT representa una intervención terapéutica novedosa para esta epilepsia infantil catastrófica.

Materiales y métodos

Mantenimiento del pez cebra

Monitoreo de convulsiones

A 5 dpf se colocaron larvas individuales de pez cebra en un solo pozo de una microplaca de fondo plano transparente de 96 pocillos que contenía medios embrionarios. Las larvas se seleccionaron aleatoriamente, ya que la determinación del sexo no es posible en esta etapa. Se colocaron microplacas dentro del dispositivo de seguimiento de movimiento DanioVision y se aclimataron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se obtuvieron gráficos de locomoción para cada pozo durante un período de grabación de 10 minutos utilizando un sistema DanioVision que ejecuta el software EthoVision XT (DanioVision, Tecnología de la Información Noldus); los ajustes de detección de umbral para identificar objetos más oscuros que el fondo se optimizaron para cada experimento. La puntuación de las convulsiones se realizó utilizando la siguiente escala de tres etapas establecida para las convulsiones inducidas por pentilentetrazol (Baraban et al., 2005): Etapa 0, poca o ninguna actividad de natación; Etapa I, aumento, breves episodios de actividad de natación; Etapa II, comportamiento de natación en círculo rápido «similar a un remolino»; y Etapa III, convulsiones paroxísticas paroxísticas de cuerpo entero tipo clonus, y una breve pérdida de postura. Los peces de tipo silvestre normalmente se puntúan en la fase 0 o I. Se analizaron gráficos para determinar la distancia recorrida (en milímetros) y la velocidad media (en milímetros por segundo). Como se informó anteriormente (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), los cambios de velocidad fueron el ensayo más sensible del comportamiento convulsivo.

Para los estudios electrofisiológicos, las larvas de pez cebra se paralizaron brevemente con α-bungarotoxina (1 mg / ml) y se inmovilizaron en agarosa al 1,2%; se obtuvieron registros de potencial de campo local de estructuras del cerebro anterior utilizando una técnica de electrodo único, como se describió anteriormente (Baraban et al., 2005; Hong et al., 2016). Se obtuvieron sesiones de grabación de potencial de campo local incrustadas en agarosa de 10 a 30 min para cada pez a 1 kHz. El sistema iZAP (Hong et al., 2016) se utilizó para el monitoreo no invasivo a largo plazo del pez cebra en ausencia de un agente paralizante. El sistema atrapa de forma autónoma varias larvas de pez cebra debajo de múltiples electrodos de superficie integrados dentro de las cámaras microfluídicas. Las larvas de scn1Lab se monitorizaron continuamente durante 5 h. El potencial de campo eléctrico se registró a 1 kHz de forma continua, excepto pausas de 2 a 3 minutos para el cambio de medios para el tratamiento y lavado de compuestos. Los datos registrados se analizaron utilizando MATLAB para gráficos de potencial de campo y análisis de frecuencia.

Cribado de biblioteca de compuestos

Los compuestos para cribado de medicamentos se compraron a Selleck Chemicals y se proporcionaron como soluciones DMSO de 10 mm. La Biblioteca de Ligandos de Canales Iónicos de Selleck (Catálogo #L2700), la Biblioteca de Compuestos GPCR (Catálogo #L2200) y una biblioteca de modulación de 5 HT personalizada se utilizaron para el cribado. Los compuestos de biblioteca se enumeran en la Tabla suplementaria 1. En todas las pantallas de la biblioteca de medicamentos, los compuestos fueron codificados y los experimentos fueron realizados por investigadores que no sabían la naturaleza del compuesto. Se obtuvieron registros basales del comportamiento de locomoción de mutantes en medios embrionarios, como se describió anteriormente; luego se obtuvo una segunda gráfica de locomoción después de un cambio de solución a un compuesto de prueba y un período de equilibrio de 20 minutos. Los compuestos para estudios de locomoción se disolvieron en medios embrionarios y se probaron a una concentración de 250 µM, con una concentración final de DMSO del 2,5%.

Los criterios para la designación de una respuesta positiva positiva fueron los siguientes: i) una disminución de la velocidad media de ≥40%; y ii) una reducción del comportamiento de las convulsiones a la fase 0 o a la fase I en la gráfica de locomoción para al menos el 50% de los peces de ensayo. Se evaluó la toxicidad de cada compuesto de ensayo clasificado como «positivo» en el ensayo de locomoción mediante visualización directa en un microscopio estereoscópico tras una exposición de 90 minutos al fármaco. La toxicidad (o mortalidad) se definió como ausencia de latidos cardíacos o movimientos visibles en respuesta a la estimulación externa en al menos el 50% de los peces de ensayo. La hiperexcitabilidad se definió como un compuesto que causa un aumento ≥40% de la velocidad de natación y/o actividad convulsiva en estadio III en al menos el 50% de los peces de prueba. Los resultados positivos identificados en el cribado primario de locomoción se confirmaron utilizando el método de cribado de locomoción en un segundo ensayo con una nidada independiente de pez cebra. Los compuestos se adquirieron por separado de Sigma-Aldrich y se probaron por tercera vez utilizando el método de detección de locomoción en una nidada independiente de pez cebra. Los fármacos que reducían la velocidad media de natación por encima del umbral y no eran tóxicos en los tres ensayos de locomoción independientes se analizaron más a fondo utilizando el ensayo electrofisiológico. En estudios electrofisiológicos, los fármacos se confirmaron primero a una concentración de 250 µM utilizando el ensayo de locomoción y, a continuación, se evaluó el mismo pez cebra utilizando un registro de potencial de campo local. Todos los exámenes de detección se realizaron con compuestos codificados y fueron analizados por investigadores ciegos a la identidad del compuesto.

Análisis filogenético

Se realizó un análisis filogenético de secuencias de proteínas HTR2 humanas y de peces cebra con el software PhyML bajo los parámetros de prueba de relación de verosimilitud tipo SH (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper et al., 2008). Las secuencias de proteínas se derivaron de HTR2A humana de Ensembl (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198) y htr2aa de pez cebra (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ENSDART00000104569), secuencias htr2cl1 (ENSDART00000024191).

Análisis cuantitativo de expresión de ARNm en tiempo real

Los niveles de expresión de los genes htr2 de peces cebra se examinaron utilizando ARN agrupado de 25 cabezas o colas de 5 larvas mutantes homocigotos de dpf de tipo salvaje o scn1Lab, y cerebros diseccionados de peces cebra machos adultos de tipo salvaje individuales. El ARN total se extrajo utilizando el reactivo TRIzol® (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se trató con DNasa I (Invitrogen). El ARNm purificado se retrotranscribió a ADNc utilizando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra SuperScript®III(Invitrogen) con una mezcla de oligo (dT)20. Los niveles de expresión de los genes htr2 del pez cebra y el factor de elongación de traducción eucariótica 1 alfa 1, como 1 (eef1a1l1) se determinaron utilizando una máquina de PCR en Tiempo real StepOne™ (Applied Biosystems). Las reacciones se realizaron en volúmenes de 20 µl en placas de 96 pocillos utilizando SYBR ® Green Master Mix (Applied Biosystems), con imprimación de 250 nM y 3 µl de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos se enumeran en la Tabla suplementaria 2. Los datos se analizaron a partir de tres experimentos independientes. Los datos se expresaron como valores de Tc y se utilizaron para determinar los valores de ΔCt.

Estudios en humanos

Después de la identificación exitosa de los compuestos en nuestro modelo de pez cebra y la consideración de la farmacocinética, a los niños se les recetó Belviq® (lorcaserina) bajo un protocolo de uso compasivo en el Hospital Infantil de Colorado (IND 125307). Los niños calificaron para el uso de Belviq® si tenían una mutación en SCN1A o un diagnóstico clínico de síndrome de Dravet, y fallaron al menos dos medicamentos, incluido el estiripentol en algunos casos y excluyendo los bloqueadores de los canales de sodio. Los niños debían someterse a un electrocardiograma y un ecocardiograma al inicio del tratamiento y cada 6 meses durante el uso del producto. Además, se les pidió que realizaran visitas de seguimiento cada 3 meses para garantizar un crecimiento adecuado, así como evaluar los efectos secundarios adicionales. Se requirieron pruebas de laboratorio cada 6 meses para incluir pruebas hematológicas, pruebas de función hepática y pruebas de función renal. La dosis de Belviq ® se inició con 2,5 mg al acostarse y se aumentó gradualmente semanalmente según fuera necesario hasta una dosis máxima de 10 mg dos veces al día o 0,3 mg / kg / día, lo que ocurra primero.

Se obtuvo la aprobación de la junta de revisión institucional para la recolección retrospectiva de datos, incluida una renuncia al consentimiento. Los datos se extrajeron de una revisión retrospectiva de los registros médicos electrónicos del Children’s Hospital Colorado, incluidos la edad, los tipos de convulsiones y la frecuencia antes y después del uso de Belviq®, los eventos adversos, la dosis de Belviq® y el uso concomitante de medicamentos.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM), a menos que se indique lo contrario. Para la comparación entre dos grupos se utilizó la prueba t de Student. Cuando la varianza no tenía una distribución normal, se utilizó la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica. ANOVA unidireccional después de la prueba de comparación múltiple de Dunnett para el análisis contra una muestra de control o comparaciones múltiples en parejas de Holm-Sidak entre medias. Las diferencias consideradas estadísticamente significativas se indican con asteriscos (*P < 0,05; * * P < 0,01).

Resultados

Efecto de clemizol en el comportamiento convulsivo en peces cebra

Tratamos larvas mutantes de scn1Lab (5 dpf) con clemizol a concentraciones entre 30 y 400 µM y luego monitorizamos el efecto en el comportamiento convulsivo espontáneo utilizando un software de seguimiento de locomoción automatizado. Basándose en 250 ensayos repetidos de control de locomoción en mutantes scn1Lab no tratados, se estableció una reducción de la velocidad media de natación ≥40% (>1,5 × DE) con respecto al valor basal como umbral para la supresión positiva del comportamiento convulsivo. Clemizol (Fig. 1A) mostró actividad antiepiléptica a 300 y 400 µM (exposición de 30 minutos) y a 100 µM (exposición de 90 minutos) (Fig. 1B); las exposiciones prolongadas fueron tóxicas en las concentraciones más altas. Para determinar si el clemizol puede suprimir el comportamiento convulsivo espontáneo en un segundo mutante de scn1 de pez cebra, examinamos las larvas mutantes de scn1Laa (5 dpf) en el ensayo de seguimiento de locomoción. Larvas identificadas como comportamiento convulsivo en estadio III (por ejemplo, convulsiones de cuerpo completo, actividad de natación a alta velocidad y una breve pérdida de postura; Fig. 1C) se confirmó que exhibían descargas electrográficas con componentes similares a interictal e ictal en registros de campo posteriores del cerebro anterior (Fig. 1D). La velocidad media de natación para larvas identificadas como peces cebra S3 o ‘mutantes supuestos scn1Laa’ fue significativamente mayor que para los controles de hermanos, o para todas las larvas analizadas (Fig. 1E); los mutantes fueron confirmados como homocigotos scn1Laa por PCR post hoc. A continuación, probamos fármacos que anteriormente habían demostrado suprimir las convulsiones espontáneas en el síndrome de Dravet y los mutantes scn1Lab (estiripentol de 250 µM y diazepam de 250 µM), así como lamotrigina de 250 µM (un DEA que puede agravar las convulsiones en el síndrome de Dravet). Como se esperaba, el estiripentol y el diazepam, pero no la lamotrigina, suprimieron significativamente el comportamiento convulsivo en larvas mutantes de scn1Laa; el clemizol de 250 µM también fue eficaz en este ensayo (Fig. 1F). En conjunto, estos estudios demuestran que el clemizol puede suprimir el comportamiento convulsivo en dos líneas de peces cebra mutantes de scn1 diferentes.

La investigación del mecanismo de acción de clemizol

La detección secundaria de fármacos con mutantes scn1Lab

El cribado terciario para identificar compuestos de plomo prometedores para la clínica

5-Expresión del receptor de HT en larvas de pez cebra

Como el clemizol tiene una afinidad de unión significativa a HTR2A y HTR2B, y tanto trazodona como lorcaserina son moduladores de señalización de 5-HT, buscamos confirmar la expresión de estos receptores en el pez cebra. La alineación de secuencias de proteínas de receptores HTR2 humanos y de peces cebra reveló una conservación evolutiva con ortólogos de peces cebra, con Htr2aa y Htr2ab, ambos exhibiendo 59,3% de identidad de proteína con el HTR2A humano; y un único ortólogo HTR2B, Htr2b mostrando 62,0% de identidad de proteína. La cuantificación del nivel de expresión de htr2 utilizando cabezas o colas aisladas de 5 larvas mutantes de dpf de tipo salvaje o scn1Lab reveló una expresión enriquecida de htr2a y htr2cl1 en la cabeza. Se obtuvieron resultados similares en el cerebro adulto de pez cebra de tipo silvestre, ya que las larvas mutantes no sobreviven hasta la edad adulta (Suplemento Fig. 4).

Reducción de la frecuencia de convulsiones en pacientes con síndrome de Dravet

El síndrome de Dravet es una epilepsia infantil catastrófica y un trastorno raro (http://www.rarediseases.org/) con resultados debilitantes que incluyen epilepsia intratable, desarrollo cognitivo gravemente limitado y riesgo de SUDEP. Nuestros datos preclínicos confirman que la modulación de la señalización 5-HT puede suprimir las convulsiones asociadas con mutaciones de pérdida de función de SCN1A. Debido a que los moduladores de 5-HT identificados son compuestos aprobados por la FDA con perfiles de seguridad conocidos, el tratamiento con estos fármacos reutilizados podría alterar la frecuencia de las convulsiones en niños con síndrome de Dravet. Este enfoque traslacional se dirige a enfermedades raras y devastadoras para las que los ensayos clínicos a gran escala no son viables (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

Ya que el clemizol no se fabrica actualmente ni está disponible en formulaciones de grado clínico y la trazodona puede actuar como un agonista o antagonista del receptor de 5-HT, dependiendo de la concentración (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998), elegimos evaluar Belviq® (lorcaserina) bajo un programa de uso compasivo fuera de etiqueta en una pequeña población de niños con síndrome de Dravet. Se demostró que estos niños eran resistentes a al menos cinco DEA aprobados. Cinco niños (edad media: 11,8 años; rango: 7-18 años) heterocigotos para una deleción en NCB1A fueron tratados prospectivamente con Belviq® y seguidos longitudinalmente en el Children’s Hospital Colorado (Aurora, Colorado). El protocolo de tratamiento fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional Médica de Colorado (COMIRB), y los padres de pacientes con síndrome de Dravet dieron su consentimiento por escrito a la participación de su hijo. Revisamos retrospectivamente el número de convulsiones atónicas, mioclónicas y tónico-clónicas generalizadas (GTC), efectos secundarios y DEA simultáneos notificados en el diario.

Las características clínicas de los niños con síndrome de Dravet tratados con Belviq® se resumen en la Tabla 1. No hubo muertes entre los cinco pacientes tratados con Belviq®, y Belviq® fue bien tolerado sin efectos adversos graves que causaran el cese de la terapia. Durante el tratamiento con Belviq ® fuera de etiqueta, un paciente estuvo inicialmente libre de convulsiones durante 3 semanas, un paciente estuvo libre de convulsiones durante 2 semanas y un tercer paciente tuvo de 1 a 2 días libres de convulsiones por semana. Los cinco pacientes presentaron una reducción en el número total de convulsiones. Las crisis tónico-clónicas generalizadas se redujeron significativamente en los pacientes 1, 2 y 3. De hecho, el paciente 2 experimentó una reducción del 90% en las convulsiones tónico-clónicas generalizadas sin necesidad de medicamentos de rescate. Dos pacientes siguen tomando Belviq ® sin aumentar la frecuencia de las convulsiones y, como se esperaba, el efecto secundario más común observado fue una disminución del apetito. Un paciente reinició el medicamento por segunda vez con una mejoría intermedia durante un corto período de tiempo y luego se fue reduciendo gradualmente.

Discusión

Clemizol, un antihistamínico de primera generación descubierto en la década de 1950 (Zierz et al., 1952), fue identificado como un potencial terapéutico para el tratamiento del síndrome de Dravet utilizando peces cebra mutantes de scn1Lab para detectar bibliotecas de fármacos reutilizados (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Aquí confirmamos una actividad antiepiléptica para clemizol utilizando un segundo modelo mutante de pez cebra scn1. Desafortunadamente, el clemizol se metaboliza rápidamente en ratones con una semivida plasmática de < 10 min (en comparación con 3,4 h en humanos) (Nishimura et al., 2013), limitando su evaluación en modelos murinos. Utilizado con éxito como antihistamínico (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) con estudios agudos y crónicos que reportan un bajo orden de toxicidad (Finkelstein et al., 1960), el clemizol ya no se fabrica y actualmente no está disponible para su administración clínica fuera de etiqueta. Al carecer de medios para evaluar de manera eficiente el clemizol en modelos preclínicos de roedores, utilizamos pez cebra para el compromiso objetivo (receptores 5-HT) e identificación de medicamentos relacionados (trazodona y lorcaserina) con perfiles de seguridad adecuados que facilitan la traducción rápida a una aplicación clínica. También se describe la prescripción de Belviq® (lorcaserina) para uso compasivo y fuera de etiqueta para pacientes con síndrome de Dravet médicamente intratables.

Los antagonistas de los receptores H1 de los antihistamínicos están normalmente contraindicados en poblaciones de pacientes pediátricos (Miyata et al., 2011) y los exámenes de detección de estos medicamentos confirmaron su incapacidad para suprimir (y en algunos casos exacerbar) las incautaciones en el pez cebra scn1. Los datos de unión revelaron una afinidad de clemizol previamente desconocida por los receptores HTR2A y/o HTR2B. Una pantalla fenotípica posterior de bibliotecas objetivo identificó dos compuestos moduladores de 5-HT, trazodona y lorcaserina, capaces de suprimir las convulsiones conductuales y electrofisiológicas de una manera comparable al clemizol. Belviq ®(lorcaserina) es un agonista HTR2C aprobado por la FDA recetado para el control de peso crónico (Thomsen et al., 2008). Desyrel ®(trazodona) también es un antidepresivo aprobado por la FDA que se prescribe comúnmente para trastornos del sueño (Mendelson, 2005). Con frecuencia se clasifica como antagonista inverso HTR2A y HTR2C e inhibidor de la captación de 5-HT (Stahl, 2009). Sin embargo, los estudios en ratas sugieren que la trazodona, o su metabolito meta-clorofenilpiperazina (mCPP), puede actuar como agonista de HTR2C en concentraciones más altas (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). En particular, el tratamiento crónico con trazodona demostró anteriormente ser protector contra las convulsiones inducidas por electroconvulsivos en ratones (Chavan et al., 2010; Borowicz et al., 2012), apoyando nuestros datos del pez cebra mutante scn1Lab. Una acción mediada por el receptor de 5-HT para el clemizol también es consistente con un cribado fenotípico reciente en el que los moduladores de señalización serotoninérgica (incluido el clemizol) demostraron ser un tratamiento eficaz en un modelo preclínico de enfermedad de Machado-Joseph (Teixeira-Castro et al., 2015); y los estudios aquí sugieren que el clemizol y la trazodona justifican un mayor desarrollo para pruebas no autorizadas en pacientes con síndrome de Dravet.

Nuestros resultados también se suman a un creciente cuerpo de evidencia que sugiere modulación de la señalización serotoninérgica como un potente supresor de la actividad convulsiva, especialmente en epilepsias infantiles catastróficas como el síndrome de Dravet. Recientemente, 7 de cada 10 pacientes en tratamiento de dosis bajas con el bloqueador de recaptación de 5 HT fenfluramina se reportaron libres de convulsiones durante 1 año (Ceulemans et al., 2016). Se notificó un ligero engrosamiento de una o dos válvulas cardíacas en dos de estos pacientes, lo que concuerda con una posible relación entre el uso de fenfluramina y la hipertensión pulmonar (Douglas et al., 1981; Ceulemans et al., 2016). En los seres humanos, HTR2A y HTR2C se expresan en el SNC, mientras que la expresión de HTR2B se enriquece en el corazón (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Más específicamente, HTR2C se expresa en una subpoblación de interneuronas inhibidoras(Liu et al., 2007) y la activación de estos receptores con 5-HT aumenta la inhibición sináptica mediada por GABA (Boothman et al., 2006), es decir, el mecanismo de acción antiepiléptico que subyace a muchos fármacos antiepilépticos comúnmente prescritos. De hecho, la mayoría de los estudios preclínicos sugieren que la activación de los receptores HTR2A y/o HTR2C tiene efectos antiepilépticos (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et al., 2015), que es un mecanismo de acción razonable que une clemizol, lorcaserina, trazodona y el bloqueador de recaptación de 5-HT fenfluramina (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). Curiosamente, la expresión de htr2b en el cerebro del pez cebra fue relativamente baja, lo que sugiere que estos fármacos potencialmente ejercen actividad antiepiléptica a través de la activación de los receptores HTR2A o HTR2C. Curiosamente, los estudios en moscas Drosophila que transportan la mutación humana K1270T SCN1A en el gen del canal para sodio han demostrado que la suplementación con un precursor de 5-HT (5-hidroxitriptófano) rescata el fenotipo de convulsiones inducidas por calor (Schutte et al., 2014). Además, un estudio reciente con mutantes de scn1Lab evaluó 13 compuestos de señalización de 5-HT y también sugirió un papel antiepiléptico potencial para moduladores de señalización de 5-HT (Sourbron et al., 2016). Sin embargo, estos últimos estudios de peces cebra utilizaron un protocolo fundamentalmente diferente (24 h versus 30-90 min de exposición a medicamentos) no validado previamente como identificación exitosa de los DEA utilizados en el síndrome de Dravet (benzodiazepinas, valproato, estiripentol, bromuros y dieta cetogénica). Además, las concentraciones de fármacos unas 10 veces más bajas de lo que demostramos para ser eficaces en el pez cebra (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015), y reportando una acción antiepiléptica para el alucinógeno TCB-2 (Fig. 5), sugiere que la comparación directa de datos de laboratorios utilizando diferentes procedimientos debe interpretarse con cautela.

En general, concluimos que el pez cebra mutante es un modelo adecuado para la detección rápida y el descubrimiento de nuevos DEA que, con perfiles de seguridad adecuados, pueden informar directamente la atención clínica para poblaciones de pacientes en riesgo, como el síndrome de Dravet.

Abreviaturas

Abreviaturas
• 5-HT

  serotonina

• DEA

  medicamento antiepiléptico

• dpf

  días después de la fertilización

• GPCR

  Receptor acoplado a proteína G

• iZAP

  plataforma integrada de análisis de pez cebra

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Baraban, Brian Grone y Matthew Dinday en particular, por su útil discusiones durante el curso de estos estudios.

Financiación

S. C. B reconoce la financiación de la subvención NINDS R01 no. NS079214, Premio Catalizador UCSF y el Fondo Sabático Raymond & Beverley Sackler Centre.

Material suplementario

El material suplementario está disponible en Brain online.