El anticuerpo escindido-Caspasa-3 es un marcador de la actividad DRONC similar a la Caspasa-9 en Drosophila

El etiquetado por el anticuerpo escindido-Caspasa-3 persiste en dcp-1 drICE mutantes dobles

Para evaluar la especificidad del anticuerpo escindido-Caspasa-3-Anticuerpo Caspasa-3, analizamos discos imaginales oculares de larvas de tercer estadio. En los discos imaginales oculares de tipo salvaje, el anticuerpo detecta unas pocas células moribundas dispersas por todo el disco (Figura 1a). Sorprendentemente, en discos oculares doblemente mutantes para los alelos nulos dcp-1Prev y drICEΔ1 (ref.14, 15), el anticuerpo escindido-Caspasa-3 todavía marca las células (Figura 1b). El etiquetado en los mutantes dobles dcp-1Prev drICEΔ1 ocurre en grupos (Figura 1b), similar a lo que se ha observado anteriormente cuando la muerte celular se bloqueó por la expresión del inhibidor de la Caspasa-3 P35.3 Estas observaciones sugerirían que el anticuerpo de la Caspasa-3 escindida todavía detecta un epítopo en ausencia de las proteínas similares a la Caspasa-3 DCP-1 y DRICE. Sin embargo, como la apoptosis en esta etapa no ocurre en un patrón definido, no estábamos seguros de la especificidad de estas señales de etiquetado.

Por lo tanto, utilizamos transgenes GMR-hid,un modelo apoptótico bien caracterizado5, para examinar más a fondo la especificidad del anticuerpo escindido-Caspasa-3. A través de la expresión impulsada por GMR del gen pro-apoptótico hid específicamente en la mitad posterior del ojo en desarrollo, los transgenes GMR-hid inducen apoptosis en dos ondas distintas,como se muestra por el anticuerpo de la caspasa-3 hendida y el etiquetado TUNEL28 (Figura 1c, d). Para evaluar la especificidad del anticuerpo escindido-Caspasa-3, examinamos los discos oculares GMR-hid doblemente mutantes para dcp-1Prev y drICEΔ1. De acuerdo con lo esperado, la pérdida de dcp-1Prev y drICEΔ1 abroga completamente la apoptosis TUNEL positiva en discos GMR-hid (Figura 1f). Sorprendentemente, sin embargo, los discos oculares GMR-hid con doble mutación dcp-1Prev drICEΔ1 todavía mostraron una fuerte inmunorreactividad con anticuerpos de Caspasa-3 hendidos (Figura 1e). Por lo tanto, el anticuerpo de la caspasa-3 hendida no detecta o no solo DRICE y/o DCP-1. Sin embargo, observamos que la apariencia de etiquetado del anticuerpo de la caspasa-3 escindida cambia en ausencia de DCP-1 y DRICE (compare las Figuras 1c y e). La señal de etiquetado ya no se limita a dos ondas distintas (Figura 1c), sino que llena todo el compartimiento posterior del disco ocular y se limita a las células intermatidiales (Figura 1e). Se ha notificado un cambio similar en el patrón de etiquetado para el etiquetado de anticuerpos CM1 tras la expresión del inhibidor de la caspasa P35.3 Este cambio en el patrón de etiquetado es probable debido al hecho de que las células en los discos oculares dcp-1Prev drICEΔ1 de doble mutación GMR-hid no mueren (Figura 1f) y, por lo tanto, mantienen el epítopo detectado por el anticuerpo Caspasa-3 escindido. Sin embargo, es importante señalar que este análisis demuestra la detección de un epítopo en ausencia de proteínas similares a la Caspasa-3 DCP-1 y DRICE por anticuerpos de Caspasa-3 hendidos.

La inmunorreactividad del anticuerpo escindido-Caspasa-3 depende de los componentes del apoptosoma DRONC y ARK

Hay dos posibilidades de por qué las etiquetas de anticuerpos escindidos-Caspasa-3 dcp-1 drICE células de doble mutante, aunque no son apoptóticas. En primer lugar, el anticuerpo puede no detectar un epítopo apoptótico; o en segundo lugar, el anticuerpo puede detectar un epítopo apoptótico generado aguas arriba o en paralelo a DCP-1 y DRICE. Para distinguir entre estas posibilidades, examinamos los discos oculares GMR-hid mutantes para los componentes del apoptosoma DRONC y ARK, que actúan aguas arriba de DRICE y DCP-1. En los discos oculares GMR-hid mutantes de dronc y ark, las etiquetas de anticuerpos TUNEL y Caspasa-3 hendida están bloqueadas (Figura 1 g,h; Figura 3a,b). Estos datos confirman que el anticuerpo escindido-Caspasa-3 detecta de hecho un epítopo apoptótico en Drosophila. Además, debido a que no detecta el epítopo apoptótico en los mutantes dronc y ark, pero no en los mutantes dobles drICE dcp-1, es más preciso considerar el anticuerpo Caspasa-3 escindido como marcador de la actividad de DRONC, en lugar de la actividad de caspasa efectora, en las células de Drosophila moribundas.

El tripéptido ETD es el epítopo apoptótico detectado por el anticuerpo Caspasa-3 escindido

El epítopo detectado por el anticuerpo Caspasa-3 escindido depende de la actividad del DRONC. Es posible que el anticuerpo reconozca directamente al DRONC activado. Alternativamente, también es posible que el anticuerpo escindido-Caspasa-3 detecte un epítopo generado a través de la escisión de un sustrato desconocido por DRONC activo, independientemente de DRICE y DCP-1.

Para distinguir entre estas dos posibilidades, alineamos los residuos de la cisteína catalítica (Cys163) al sitio de escisión en Asp175 de Caspasa-3 humana (péptido Caspasa-3) con las regiones correspondientes de las caspasas de Drosophila (Figura 2a; ver también ref. 3). La mayoría de los residuos C-terminales del péptido Caspasa-3, ETD, se conservan en DRICE y DCP-1 (Figura 2a). Similar a Caspasa-3, este es el sitio de escisión para la activación de al menos DRICE,29 y posiblemente DCP-1. Es interesante observar que el N-terminal, dos tercios del péptido Caspasa-3, tiene la mayor similitud con DRONC; se conservan seis de cada nueve residuos (Figura 2a). Esta parte del péptido Caspasa-3 está menos bien conservada en DRICE, DCP-1 y las caspasas de Drosophila restantes. Aunque la escisión entre las subunidades grandes y pequeñas de DRONC no es necesaria para su actividad30,31 y puede no ocurrir in vivo, consideramos la posibilidad de que los anticuerpos dirigidos contra la parte N-terminal del péptido Caspasa-3 puedan detectar directamente DRONC activo en células moribundas.

Utilizamos péptidos de bloqueo para evaluar qué epítopos del péptido Caspasa-3 son detectados por el anticuerpo Caspasa-3 escindido en células de Drosophila moribundas. Las secuencias de los péptidos bloqueantes se muestran en la Figura 2b y se subrayan en la Figura 2a. El péptido bloqueador A (TETD) se deriva de DRICE y DCP-1 y el péptido bloqueador B (CRGDEYDLG) corresponde a la región de mayor similitud en DRONC (Figura 2a,b). El péptido C es un péptido de control correspondiente a los residuos inmediatamente adyacentes al péptido B en DRONC (Figura 2a,b). El péptido D es otro péptido de control, que es muy similar al péptido A y se deriva del prodominio de DRONC en la posición 113. Si el prodominio de DRONC es escindido en este sitio, expondrá la DES en su terminal C, que es muy similar al terminal C del péptido Caspasa-3 (ETD, péptido A) y, por lo tanto, puede ser detectado por el anticuerpo Caspasa-3 escindido.

Los péptidos bloqueadores se mezclaron con el anticuerpo Caspasa-3 escindido 60 minutos antes de la incubación con los discos imaginales oculares. Los resultados de los experimentos de bloqueo se resumen en la Figura 2b, y para los péptidos A y B se muestran en la Figura 2c–f. El péptido A es suficiente para bloquear toda la inmunorreactividad del anticuerpo escindido-Caspasa-3 en los discos oculares GMR-hid y dcp-1 drICE con doble mutación GMR-hid (Figura 2c,d). Por el contrario, el péptido B no abroga la inmunorreactividad del anticuerpo en estos discos (Figura 2e,f). Los péptidos de control C y D tampoco logran bloquear la inmunorreactividad de la caspasa-3 hendida (Figura 2b; datos no mostrados).

Estos datos demuestran que el anticuerpo escindido-Caspasa-3 detecta específicamente el epítopo ETD en células apoptóticas. Entre las caspasas de Drosophila, este epítopo solo está presente en DRICE y DCP-1, por lo que es muy probable que el anticuerpo detecte estas caspasas efectoras. Por el contrario, el hecho de que los péptidos B, C y D derivados del DRONC no bloqueen la inmunorreactividad sugiere que es poco probable que el anticuerpo detecte directamente el DRONC activo. Por lo tanto, debido a que el anticuerpo de la caspasa-3 escindida no pierde inmunorreactividad en los mutantes dobles dcp-1 drICE (Figura 1e), detecta al menos otra proteína, que expone el epítopo ETD de una manera dependiente de DRONC.

Activación de la DCP-1 independientemente de ARK restaura la inmunorreactividad de la caspasa-3 escindida

El análisis presentado en la Figura 2 sugiere, pero no prueba, que el anticuerpo de la Caspasa-3 escindida detecte de hecho la DCP-1 y la DRICE escindidas. Para probar directamente esta posibilidad, expresamos un transgeno GMR-ΔN-dcp-1 en el fondo mutante del arca. ΔN-dcp-1 carece del prodominio N-terminal de DCP-1. Se cree que ΔN-DCP-1 empobrecido de prodominio promueve fácilmente el autoprocesamiento, y la expresión consistente bajo control de GMR induce un fenotipo de ablación ocular.32 Este fenotipo de ablación ocular se debe a la inducción de la apoptosis (Figura 3c, d). Como se mencionó anteriormente, los clones mutantes de ark en el fondo GMR-hid no inducen apoptosis TUNEL positiva (Figura 3b) y el anticuerpo escindido-Caspasa-3 no tiene inmunorreactividad en los clones de ark (Figura 3a), lo que sugiere que ni DCP-1 ni DRICE ni los sustratos desconocidos de DRONC son escindidos en los clones mutantes de ark. Por lo tanto, probamos si la expresión de ΔN-Dcp-1 en ausencia de actividad de apoptosoma, es decir, en clones de ark, puede restaurar el etiquetado de anticuerpos de Caspasa-3 hendida. En comparación con el tejido de tipo salvaje (marcado por GFP en la Figura 3c,c’), el número de células positivas a Caspasa-3 escindidas se reduce fuertemente en los clones mutantes de ark (Figura 3c,c’), lo que sugiere que la activación de ΔN-DCP-1 depende al menos parcialmente del apoptosoma. Sin embargo, alrededor del 50% de los clones mutantes de ark (n=32) en el fondo GMR-ΔN-Dcp-1 contienen células inmunorreactivas de Caspasa-3 hendidas (flechas en la Figura 3c, c’). Es poco probable que sea un artefacto de etiquetado, porque estas células también son TUNEL-positivas (Figura 3d, d’). Por lo tanto, debido a que DRONC está inactivo en el fondo mutante de ark, lo que sugiere que la señal de etiquetado de Caspasa-3 escindida no es causada por el sustrato de DRONC desconocido, este análisis demuestra que el anticuerpo Caspasa-3 escindido detecta de hecho DCP-1 escindido. También es posible que el anticuerpo escindido-Caspasa-3 detecte DRICE escindido en este experimento, porque DCP-1 puede procesar proteolíticamente DRICE, al menos in vitro.29, 32 No se pudo realizar un análisis similar con DRICE porque GMR-drICE y GMR-ΔN-drICE no causan un fenotipo de ablación ocular.32 Sin embargo, si DCP-1 escinde DRICE in vivo o no, dada la similitud de secuencias de DCP-1 y DRICE en el extremo C de la subunidad grande y los datos de bloqueo de péptidos de la Figura 2, sugiere que el anticuerpo también puede detectar DRICE escindido.